植物食品中类胡萝卜素的高压液相色谱检测

《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 No．5 植物食品中类胡萝 I、素的高压液相色谱 惠伯棣 欧阳清波 曾悦 (中国农业大学食品学院，北京 100094) 摘要 ：本文论述了一种在各国的许多实验室中被广泛采用 的应用高压液相色谱定性 、定量检测植物食品 中 的类胡萝 卜素的方法。色谱的固定相为反相 C18柱 ，流动相 A为乙腈 和水 (9：1)，流动相 B为乙酸乙酯。洗脱 条件为二元线型梯度。梯度的起点为 100％的流动相 A，终 点为 100％的流 动相 B。洗脱时间为 20—25分钟 。 高压液相色谱配备二极管阵列检测器(PDA)是检测类胡萝 卜素 的理想设备组合 。该方法可 同步收集 各类胡萝 卜素组分的色谱及光谱数据，并据此对其进行定性和定量的分析。该方法最突出的优点是应用范围广 、易操作 、 重复性好 ，因此被认为是一种检测植物食品中类胡萝 卜素的“”方法 。 关键词 ：高压液相色谱 ，类胡萝 卜素 Analysis of Carotenoids frOm Plant Foods by High Pressure Liquid Chromatography(HPLC) Hui Boll，Ouyang Qingbo，Zeng Yue (Food College of China Agriculture University，Beij ing 100094) Abstract：A method currently employed by many laboratories to examine carotenoids from plan t food by high pressure liquid chromatography(HPLC)was described herewith．Stationary phase applied Was reversed phase C18 column while mobile phase A consisted of acetonitrile and water(9：1．v／v)and mobile phase B Was ethyl acetate．Binary gradient Was performed linearly with the original of 100％ A and finished in 20—25 minutes with 100％B．It Was considered aS an ideal configuration for HPLC to equip a photodiode array detector(PDA)that ma y acqui~e spectral and chromatographic data of each component simultaneously．This chromatographic method has been widely applied in the both qualification an d quantification of camtenoids from plan t fcxxts wi th significant benefits such aS‘e．say to operate’an d better repro— ducibility and Was there~re considered aS a‘critical’method in practice． Key words：HPLC．Carotenoid 一 、引言 l 类胡萝 卜素 类胡萝 卜素(Carotenoid)是一类天然化合物的 总称。迄今为止 ，于 自然界中已发现超过 600种的 天然类胡萝 卜素，如：番茄红素(Lycopene)、叶黄素 (Lutein)、玉米黄素(Zeaxanthin)、a一及 8一胡萝 卜 素(a一／13一Carotene)和虾青素(Astaxanthin)等。 大多数天然类胡萝 卜素为 C4 分子，由中央多 聚烯链和位于两侧的官能 团组成。图 l为 8一胡 萝 卜素的分子结构。 72 图 1 0一胡萝 卜素的分子结构 在 自然界中，绝大多数类胡萝 卜素以全反式异 构体(E—isomer)的形式存在。 根据其分子结构，类胡萝 卜素可分为含氧类胡 萝 卜素及不含氧类胡萝 卜素。含氧类胡萝 卜素包 括 叶 黄 素 (Xanthophyl1)及 类 胡 萝 卜素 酯 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 NO．5 (Carotenoidester)等 ，含氧类胡萝 卜素被称为胡萝 卜素(Carotene)。含氧 的类胡萝 卜素极性较强 ，不 含氧的类胡萝 卜素极性较弱。 类胡萝 卜素广泛分布且被大量生物合成于高 等植物的光和及非光和组织 中，包括植物的叶、花 、 果及根中。植物类 的农产品中拥有丰富的天然类 胡萝 卜素资源 ，如：番茄中的番茄红素、菊花和绿色 蔬菜中的叶黄素等L2,7]。 类胡萝 卜素是有机化合物 ，可溶解于大部分有 机试剂 中[ 。已经证 明，许多类胡萝 卜素具有 良 好的抗氧化功能，是优秀的 自由基淬灭剂 ，因此对 凸 0 一 翻 人体的健康有许多正面作用o L4]。 类胡 萝 卜素分 子 结 构 中所 具 有 的发 色 团 (Chromophore)使其在紫外 一可见光区有着独特的 吸收区(见下图)因而其结晶或深液在可见光下具 有十分绚丽的红 ，橙或黄色。所以，类胡萝 卜素长 期被认为是一类色素。到 目前为止 ，许多类胡萝 卜 素的紫外 一可见吸收光谱特征 已被确定，如：最大 吸收峰的波长如 ：最大吸收峰的波长(XmaX)和摩尔 发光系数(e)等 。因此 ，利用类胡萝 卜素在紫外 一 可见光 区 的吸收光谱 可对其 进行 定性、定量 分 析[ 波长 (nm ) 图 2 全反式 一J3一胡萝 卜素及番茄红素在正己烷中的紫外 一可见吸收光谱 按照所含类胡萝 卜素的种类及其组成划分 ，含 有类胡萝 卜素的植物食品，可分为如下几类 ： (1) 主要含有不含氧类胡萝 卜素 的植物食 品，如 ：胡萝 卜和番茄等。 (2) 含有类胡萝 卜素和叶绿素的植物食品， 主要包括光和组织 。 (3) 含有类胡萝 卜素及其酯的植物食 品，如： 南瓜、辣椒、菊花等。 2 高压液相色谱和类胡萝 I、素检测技术 色谱法是一种以分配平衡为基础的分离分法， 它的分离体系包含两个相：一个是固定相 ，一个是流 动相。当两相做相对运动时，反复多次地利用混合 物中所含组分分配平衡性质的差异使其彼此分离。 作为色谱分析法的一个分支，高效液相色谱法 是在本世纪 60年代末期 ，在经典液相色谱法的基 础上发展起来的新兴 的分离分析技术。其机理是 在高压的条件下根据被分离的组份在固定相和流 动相问分配的平衡将不同的组份分离的一种技术。 从分析原理上讲高效液相色普法和经典液相 色谱法没有本质的区别，但 由于它采用了新型高压 输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，使经 典的液相色谱法焕发出新的活力。高压液相色谱 的优点是明显的，如 ：分离效果好、选择性高、检测 灵敏度高、分离速度快等。 二极管阵列检测器是一种紫外一可见光吸收 光谱检测器。其最突出的优点是可迅速获得被检 测组份的吸收光谱 。应用装备了二极管阵列检测 器的高压液相色谱检测植物食 品中类胡萝 卜素组 份具有显著的优点。此类设备可 同时收集被检测 73 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 NO．5 组份的光谱数据及色谱数据，因此，在植物食品中 类胡萝 卜素检测中应用这类设备进行定量和定性 分析时具有显著的优点。 到 目前为止 ，所有应用于胡萝 卜素检测的高压 液相色谱的固定相均为吸附型材料，如：硅胶及键 和型吸附材料 ，包括 ：反相 C18及腈基吸附材料。 其中反相 C18材料最为常用。 随着类胡萝 卜素类化合物在制药、食品及饲料 工业中的广泛应用 ，国内的许多研究机构 、大专院 校 、商检部门和生产制造商都在进行类胡萝 卜素的 分析工作。高压液相色谱法已成为主要的类胡萝 卜素分析及检测方法。但是 ，国内的许多实验室所 采用的色谱条件各不相同。这此色谱条件大部分 来 自于国外的参考文献。许多色谱条件所达到的 分离效果是 良好 的。但是，一种应用范围广 ，重复 性强的“标准”色谱方法一直是许多人追求的目标。 这种“标准”的色谱方法可以被许多行业或企业标 准所采用。 自上个世纪 70年代 ，以反相 C18固定相和含 水的流动相为主的梯度洗脱条件逐渐被世界上各 国类胡萝 卜素化学工作者所接受，成为分析类胡萝 卜素天然产物的主要方法 ，简称：Aqueous reversed —phase(ARP)法。尤其是世界类胡萝 卜素协会大 阪会议之后，这一方法得到了最后的确认。现在 ， 这一方法已成为世界上各主要类胡萝 卜素实验室 的通用分析方法。同时，它也成为许多国家的法律 系统中(如 ：国家标准、行业标准及企业标准)所认 可 的方 法l5， 。 本文对该方法进行 了系统的介绍 ，分析了它的 优点和不足。同时 ，还介绍了作者实验室中应用该 方法时所取得的部分结果。希望该方法能够在我 国食品工业中得到广泛应用 ，尤其能够被有关的行 业或企业标准所采用。 二、材料与方法 1 药品与试剂 乙醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷 、氢氧化钾均为 分析纯试剂。乙酸乙酯和乙腈为色谱纯试剂。高 74 压液相色谱所用的水为经过逆流渗透处理的超纯 水。 实验 中所使用的各类胡萝 卜素单体的纯品均 来 自于 Sigma Co．。 2 仪器 Waters高压液相色谱仪 2690系列 ，包括 ：wa— ters 996二极管阵列检测器及 600溶剂输送系统。 真空旋转蒸发仪(BiiHI 461型) 3 实验方法 (1)样品前处理 所有植物食品样品均来 自于当地超级市场。 准确称取新鲜菠菜叶片 5克，放入研钵并加入 石英砂和少量(20毫升)丙酮充分研磨。所得浆液 离心(900转／分)后 ，收集上清液。重复 3—4次至 残渣无色为止。合并上清液，负压浓缩至 25毫升 ， 低温避光保存。 准确称取新鲜番茄果实 10克 ，于研钵 中加少 许四氢呋喃研磨 ，收集上清液。再分别用少量 (20 毫升)二氯甲烷研磨两次 ，离心后 回收上清液。合 并四氢呋喃和二氯 甲烷上清液 ，负压浓缩至 25毫 升 ，低温避光保存。 准确称取干红辣椒 1克，于研钵 中加少许 (5 毫升)正己烷充分研磨。收集上清液。重复 4—5 次至残渣无色为止。用正己烷定容至 25毫升，低 温避光保存。 取 10毫升上述干红辣椒溶液与等体积的 4％ 氢氧化钾一 乙醇溶液混合摇匀 ，静置 4小时，备用。 (2)高压液相色谱条件 色 谱 的 固定 相 为 Nova—Pak C】 色 谱 柱 (4 m，c?3．9×300mm)。流动相 A为乙腈和水 (9： 1，v／v)，流动相 B为乙酸乙酯。洗脱条件为二元线 型梯 度：流 动相 B在 20分 钟 内 由 0％上 升 到 100％。流量为 1．0毫升／分。进样量为 20微升。 柱温为 25℃。检测器的波长范围。250—600nm。 根据各组份的保留时间和吸收光谱与纯品的 保留时间和吸收光谱 的比较，可对各组份定性分 析。各类胡萝 卜素组份 的定量测定采用内标法完 成。纯品的添加 回收率 >97％。色谱设备和方法 的重复性 良好(误差<7％)。 该方法的梯度可根据不同的样品进行调整 ，对 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 不同样品中的胡萝 b素 ，叶黄素 ，绿 叶素进行有效 的分离。 三、结果与讨论 1 菠菜提取物的高压液相色谱分析 菠菜叶片是光合组织。其丙酮提取物 中含有 丰富的叶绿 素 a和 b、含氧及不含氧 的类胡 萝 卜 素 ，如 ：J3一胡萝 b素和叶黄素等。大多数绿色植物 食品的有机试剂提取物均具有此类化学组成。图 3为菠菜丙酮提取物 的高压液相色谱图。色谱条 件见上。根据其保留时间和光谱特征，各组份鉴定 为：I=含氧类胡萝 b素；II=含氧类胡萝 b素 ；lII = 叶黄素及玉米黄素；Ⅳ=叶绿素 b；v：叶绿素 a；VI=J3一胡萝 b素。 由图 3可以看出：整个洗脱过程可以分为三部 分： 第一部分是含氧类胡萝 b素区(I区)。在该 区内含有羟基的类胡萝 b素可 以得到 良好的分离 效果。但是 ，同分异构体的分离不尽理想。最为典 型的情况是叶黄素和玉米黄素的分离。二者互为 同分异构体。在载碳量比较低的反相 C18柱上可 以有 比较明显的分离 ，而在载碳量 比较高的固定相 上分离效果不理想。一般是玉米黄素在叶黄素峰 上形成右搭肩峰。 含有酮基的类胡萝 b素在该 区内也可形成色 谱峰，但峰的形状非常差 ，峰的底边较大。 第二部分是叶绿素区(II区)。在该 区内叶绿 素 a和叶绿素 b得到很好的分离。 第三部分为不含氧类胡萝 b素区(HI区)。不 含氧的类胡萝 b素(如 ：a一及 I3一胡萝 b素和番茄 红素 )可以得到 良好的分离。与第一区的情况类 似 ，不含氧类胡萝 b素的同分异构体在该区内也不 能达到理想的分离效果。 图4示意 了 I3一胡萝 b素和叶黄素 的分子结 构。通过 比较可以看出叶黄素分子多出两个羟基。 因此 ，叶黄素分子的极性 比 j3一胡萝 b素分子的极 性强 ，其保留时间也 比 I3一胡 萝 b素短。可 以认 为：这一色谱条件所产生的洗脱顺序具有明显的反 相性 。 HO p一胡萝 卜素 叶黄素 图 4 B一胡萝 卜素和叶黄素的分子结构 2 番茄提取物的高压液相色谱分析 番茄果实的二氯甲烷提取物中含有丰富的番 茄红素和不含氧的类胡萝 卜素(如：I3一胡萝 b素)， 不含叶绿素。在植物食品中，具有这类类萝 b素组 成的样品也有不少 ，如：番茄及胡萝 b等。 图 5为番茄二氯甲烷提取物的高压液相色谱 OH 图。色谱条件见上。根据其保留时间和光谱特征， 各组份鉴定为 ：I：番茄红素；II=I3一萝 b素。 图 6为 J3一胡萝 b素和番茄红素的分子结构。 通过 比较可以看 出 I3一胡萝 卜素分子具有两个六 元环。由此可以看出：具有芳香环结构的类胡萝 素在该色谱条件下较非芳香环结构的类胡萝 卜畚 的保留时间长。 75 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 NO．5 0 p一胡萝 b素 0H 番茄红素 图 6 t3一胡萝 b素和番茄红素的分子结构 3 辣椒提取物及其皂化物的高压液相色谱 分析 红辣椒的果实含有丰富的类胡萝 b素酯。所 谓类胡萝 b素酯是指含有羟基的类胡萝 b素分子 中羟基上的氢原子被羧酸基取代而生成的衍生物。 富含胡萝 b素酯的植物食品有辣椒的果实、南瓜、 黄花菜、菊花等。 红辣椒的果实中含有丰富的辣椒红素酯 (Cap— santhin esters)和辣椒玉红素酯 (Capsorubin esters) 76 以及它们的单体。它们构成辣椒果实中主要的红 色素。图 7为红辣椒的果实正己烷提取物的高压 液相色谱图。色谱条件见上。图中在不含氧类胡 萝 b素区(HI区)有大量的类胡萝 b素酯峰被检出。 这些组分中分子的酯键结构可被随后进行 的皂化 反应(见图 8及图 9)所确定。图 10为红辣椒果实 正己烷提取物皂化产物的高压液相色谱图。要据 其保留时间和光谱特征 ，各组份鉴定为：I=辣椒 红素(Capsanthin)；II=辣椒玉红素(Capsorubin)； HI=t3一胡萝 b素。 R。 — 。 = Ho 辣椒红素酯 辣椒玉红素酯 图 8 辣椒红素酯的皂化 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 No．5 OR OR 辣椒玉红素酯 OH 辣椒玉红素 图 9 辣椒玉红素酯的的皂化 从这个样品的色谱图中可以看出，类胡萝 b素 酯在该色谱条件下的保留时间在Ⅲ区内。因此，类 胡萝 b素酯的峰可能会干扰不含氧类胡萝 b的峰。 当然，经过皂化处理的样品，不含氧类胡萝 b素的 峰就可以清楚地显现出来(如 ：图 10中的Ⅲ号峰) 4 定量分析 从上述三类样品中类胡萝 b素的高压液相色 谱分析结果可以看出现行的洗脱条件对不同样品 中的类胡萝 b素组分的分离达到 了满意的效果。 因此 ，在现有的色谱条件下 ，食品中常见 的类胡萝 b素定量分析成为可能。表 l列举 了从本地超级 市场购买的上述三种植物食品样品中主要类胡萝 b素的定量检测结果。 表 1不同植物食品中的主要胡萝 b素含量(微 克／100克鲜重) 菠菜 番茄 红辣 叶片 果实 椒果实 B一胡萝 卜素 394 225 57 番茄红素 759 叶黄素 +玉米黄素 642 辣椒素红 * 746 辣椒玉红素 * 243 其它 注 ：* 皂化后的样品 5 优点和局限性 自从世界类胡萝 b素化学协会大板年会以来 ， 该色谱条件已被世界上许多实验室所采用 ，作为研 究中测定样品中类胡萝 b素组成的基本方法。随 后 ，有相当国家的商检部门和仲裁机构也将该方法 作为具有法律效应的商品检测方法之一。 该方法的最大优点在于：它的流动相起点具有 很强的极性 ，因此对极性 比较强的类胡萝 b素(含 有羟基的类胡萝 b素)分离效果较好 ，但不适于含 有酮基的类胡萝 b的素分离。 其次，该色谱条件的梯度易根据样品的类胡萝 b素组成进行调整 ，而各组分的洗脱顺序不变。这 就有可能形成一种所谓的“标准”方法 ，进而建立数 据库。 二极管阵列检测器(PDA)的出现 ，无论是对紫 外一可见吸收光谱技术还是对高压液相色谱技术 来说 ，都是一个革命性的设备突破。它最突出的优 点是可以迅速提供被检测组分的扫描图。因此，在 色谱过程中被检测组分的光谱信息和色谱信息可 同时收集。这种技术为类胡萝 b素 的定性带来极 大的方便。在现有的色谱条件下 ，利用配备了二极 管阵列检测器的高压液相色谱建立类胡萝 b素的 色谱和光谱数据库是完全可能的。 现有的色谱条件也具有一定 的局限性。如 ：含 有酮基的类胡萝 b素、同分异构体及不含氧的类胡 77 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 No．5 萝 卜素的分离在该色谱条件下都存在一定的困难。 6 改进方向 世界类胡萝 卜素化学协会大板年会上 ，对于流 动相 A，曾经存在着两种观点 ：一种认为甲醇和水 (95：5)比较理想 ，另一种比较倾向乙腈和水 (9：1)。 从色谱的质量上看，乙腈和水的流动相 A会带来 比较好的峰形 ，而甲醇和水组成的流动相 A成本 比较经济。 另外 ，固定相的载碳量 (Carbon loading)对分 离的效果影响也是非常强烈的。己经，载碳量 低的反相 C18柱对同分异构体 的分离会有一定的 改进 ，载碳量高的反相 C18柱对含氧类胡萝 卜素 的分离有利。 结论 当色谱的固定相为反相 C18，流动相 A为乙腈 和水(9：1)，流动相 B为乙酸乙酯 ，洗脱条件为二 元线性梯度时，不同植物食品中的含氧和不含氧类 胡萝 卜素以及绿叶素能被有效地分离。在配备了 二极管阵列检测器的高压液相色谱上可同步收集 各组分的光谱。因此 ，该方法可同时获得样品中类 胡萝 卜素的色谱及光谱数据，并据此对其进行定性 和定量的分析。 参考文献 1．Britton，G Meth．Enzymol(1985)lll 113 2．Britton，G．In Carotenolds in otosynthesis(Young，A．J andBritton，G ，eds．)Cha【pman& Hal1．London(1993)1 3．Britton，G．In Carotenoids(1B)(Britton，G．，Liaaen—Jensen， S and P fander．H．．eds．)Birkh~user．Basel，~ ston and Berlin f1995)13 4．Britton，G FASEBJ．(1995)91551 5．Britton，G．and Young，A．J In Carotenoids in Photosynthesis (Young，A J and Britton，G．，eds)Chapman & Hal1．Lo n— don．(1993)409 6．G~xtwin，T．W ．and Britton，G．In Plant Pigments(Gc~ win， T w．，ed．)Academic Press．London．(1988)61 7．H ui，B Ph．D．Thesis University ofLiverpool(1996)1 (上接 59页) 0．8％ Ve 30mg香精适量 4 成本分析： 通过对胡萝 卜素、复合姜黄橙色、乳化香精对 讨论条件 ：原橙汁含量 30％ 糖 13％ 柠檬酸 比见表 2 表 2 名称 使用量 ( ) 单价 (元 ／kg) 吨成本(元) 一 胡萝 卜素(1％)(天然) 1．2 240 288 复合姜黄橙色(天然) 0．68 180 110 柠檬黄 +日落黄 (合成) 0．12 75 9 栀子黄 +红 曲红 (天然) 1．4 200 280 在果蔬饮料的加工过程 中，食品着色剂的使 用 ，是整个果蔬饮料生产中非常重要 的环节之一。 随着人们健康 、安全意识的增强，天然着色剂越来 78 越受到人们的青睐，越来越受到众多厂商的重视 ， 通过上述数据表明，姜黄素在果蔬饮料中具有很多 优势 ，可作为基础色调广泛推广。 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 No．5 图 3 菠菜丙酮提取物的高压液相色谱 图 色谱条件 ：色谱柱 =Nova一 忌C18(4／~m， 3．9×300mm)；流动相 A=乙腈和水(9：1，V／V)；流动 相 B=乙酸乙酯 ；洗脱条件 ：二元线型梯度 ，流动相 B在 20分钟内由 0％上升到 100％；流量 =1．0毫升／ 分。进样量 =20微升。柱温 =25℃ ；检测器波长范围 =250—600nm。组份鉴定 ：I=含氧类胡萝 b素 ； 11=含氧类胡萝 b素 ；Ⅲ=叶黄素及玉米黄素；IV=叶绿素 b；V=叶绿素 口；Ⅵ= 一胡萝 b素。 79 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 NO．5 图 7红辣椒的果实正己烷提取物的高压液相色谱图。色谱条件 ：色谱柱 =Nova—PakC18(4／~m， 3．9 ×300mm)；流动相 A=乙腈和水(9：1，、厂／、厂)；流动相 B=乙酸乙酯 ；洗脱条件：二元线型梯度，流动相 B 在 20分钟内由 0％上升到 100％；流量 =1．0毫升／Yt。进样量 =20微升。柱温 =25℃ ；检测器波长范围 =250—600nm 。 80 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 No．5 I I ● 7 l r ， 。 H _ —： ． ：= ， 。 _ 图 5番茄二氯甲烷提取物的高压液相色谱图。色谱条件 ：色谱柱 =Nova一 愚Cl8(4fzm， 3．9× 300mm)；流动相 A=乙腈和水(9：1，V／V)；流动相 B=乙酸乙酯；洗脱条件 ：---~线型梯度 ，流动相 B在 20分钟内由 0％上升到 100％；流量 =1．0毫升／分。进样量 =20微升。柱温 =25U ；检测器波长范围= 250—600nm。组份鉴定 ：I=番茄红素 ；Ⅱ=p一胡萝 b素。 81 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 NO．5 图 10红辣椒果实正己烷提取物皂化产物 的高压液相色谱 图。色谱条件：色谱柱 =Nova—Pak C18 (4／mz， 3．9×300ram)；流动相 A=乙腈和水 (9：1，V／V)；流动相 B=乙酸乙酯 ；洗脱条件 ：二元线型梯 度 ，流动相 B在 20分钟内由0％上升到 100％；流量 =1．0毫升／Yt。进样量 =20微升。柱温 =25℃ ；检 测器波长范围 =250—600nm。组份鉴定 ：工=辣椒红素(Capsanthin)；II=辣椒玉红素(Capsorubin)；Ⅲ ： 一 胡萝 卜素。 82 维普资讯 http://www.cqvip.com