类胡萝卜素生物合成的遗传工程研究

《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 NO．5 类胡萝 I、素生物合成的遗传工程研究 李浩明 高蓝 (青岛大学天然色素研究所，青岛 266071) 摘要：类胡萝 卜素是一类橘黄 、黄色或红色 的色素 ，存在于质体中 ，具有许 多不 同的生物 功能和生物活性 。 本文综述了近年来用遗传工程手段改造微生物和植物类胡萝 卜素生物合成途径，开发用来分离所需类胡萝 卜素 的微生物资源及高类胡萝 卜素含量的食用植物的 、成果和存在的问。 关键词：类胡萝 卜素，遗传工程，生物合成 Genetic Manipulation of Carotenoid Biosynthetic Pathways Li Haoming，Gao Lan (Inst．Nat．Pigments，Qingdao Univ．，Qingdao 266071) Abstract：C&roteinoids，which have a range of diverse biological functions an d actions ，&re orange，yellow，or red pig— ments present in all plastids．This review summarizes the strategie8，achievements an d problems in modifying an d engi— neering the carotenoid biosynthetic pathways to provide source for the isolation of desired carotenoids or to generate food plan ts with increased carotenoid content． Key words：Carotenoid，Genetic manipulation，Biosyn thesis 类胡萝 卜素具有许多不同的生物功能和生物 活性 ，与人类健康密切相关 ，能降低许多疾病包括 癌症的发病率，对健康、视力是至关重要的。类胡 萝 卜素生物合成的遗传修饰的重要性是易而易见 的。本文综述了近年来用遗传工程手段改造微生 物和植物类胡萝 卜素生物合成途径、开发用来分离 所需类胡萝 卜素 的微生物资源及高类胡萝 卜素含 量的食用植物的方法、成果和存在的问题。 类胡萝 卜素是一类由异戊二烯组成的萜类化合 物，它是一类亲脂性化合物，存储于亲脂环境，在质 体中合成。典型的 Go类胡萝 卜素带有环化 B一紫罗 酮末端基团，其不同位置可被氧、环氧和氢氧基团取 代(图 1)，分子中的共轭双键与其呈色和生物功能 密切相关。类胡萝 卜素的显著功能是作为抗氧化剂 淬灭单线态氧和捕获氧 自由基 ，类胡萝 卜素在工业 上用作营养补充剂、食用色素和饲料着色剂。 商业用的类胡萝 卜素大部分是化学合成的，少 部分从 自然资源中提取 ，许多重要的类胡萝 卜素在 食物中含量很低 (如玉米黄质)，玉米黄质和叶黄素 是视网膜的重要色素，它们在食物中含量甚微 ，玉 米黄质和叶黄素低摄入容易导致年龄相关视黄斑 退化⋯1。为 了丰富类胡萝 卜素 的 自然资源 ，研究 人员进行了微生物和植物的遗传改造研究 ，培育用 于工业分离类胡萝 卜素的微生物和类胡萝 卜素含 量高、类胡萝 卜素种类符合要求的植物工程株。 近年来 ，在微生物和植物中就类胡萝 卜素生物 合成途径的遗传修饰、相关基因的克隆、分析、改造 等方面做 了大量 的研究工作 ，并取得 了很大 的进 展 ，通过遗传工程方法用不同微生物生产类胡萝 卜 素和经遗传修饰植物类胡萝 卜素生物合成途径使 其产生所需 的类胡萝 卜素的研究获得成功_2_3j。 尽管如此 ，要提高类胡萝 卜素含量和产生新类胡萝 卜素 ，仍存在以下几个问：(1)工程株原有代谢途径 消耗大量类胡萝 卜素合成 的前体 ；(2)干扰其他代 谢途径 ，影响工程株的正常生长 ；(3)目的产物产生 后的存储问题。所以，要使类胡萝 卜素产量高就必 须提供足够的前体 ，平衡相关代谢途径 的关 系，有 适当的生物或组织能存储亲脂性产物。 15 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 No．5 ^ ＼＼ ^ ^ 入 ＼ 牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸 OPP 图 1 类胡萝 卜素生物合成途径简图 ● 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 一 、转基因微生物 通过遗传工程方法已成功地使不产类胡萝 卜 素的产朊假丝酵母(Candida utilis)合成类胡萝 b 素，如番茄红素、l3一胡萝 卜素和虾青素等_4 J。将细 菌类胡萝 卜素生物合成途径中的相关基因，根据产 朊假丝酵母密码子利用情况改造后 ，转到产朊假丝 酵母中表达 ，用代谢工程方法改变产朊丝酵母 甲羟 戊酸途径 ，使其增加萜类化合物前体 的供应 ，用抑 制固醇代谢途径 的方法减少异戊二烯焦磷酸的消 耗 ，这样得 到的工程菌番茄红 素的产量达到7．8 mg／g干重 [ 。 大肠杆菌是表达外源类胡萝 卜素生物合成途 径相关基因、生产类胡萝 卜素的方便宿主，大部分 来源于细菌、真菌和高等植物的类胡萝 b素生物合 成相关酶的基因均能在大肠杆菌中表达。另外 ，现 已获得带有不同抗性标记、属不同于不相容性群的 质粒，这样就可用它们携带不同基因同时转化大肠 杆菌 ，以便产生类胡罗 卜素，其前体供应问题可通 过脱氧 一D一木酮糖 一5磷酸途径的代谢工程来解 决。用脱氧 一D一木酮糖 一5一磷 酸合成酶、脱氧 一 D一木酮糖 一5一磷酸还原异构酶和异戊基焦磷 酸异构酶基因转化大肠杆菌，并使其表达 ，结果类 胡萝 卜素的产量达到 1．5mg／g干重l6 J，相当含量 的虾青素大肠杆菌工程菌也 已获得 。 通过来 自不同生物的类胡萝 b素生物合成途 径的相关基因的组合 ，能产生新的类胡萝 卜素化合 物，如 1一羟基化无环结构和 13个共轭双键的结 构，其抗氧化性优 于普通类胡萝 b素【8 J。另一种 获得全新类胡萝 卜素的方法是分子育种 ，来源两个 欧文氏杆菌的八氢番茄红素脱饱和酶基因体外随 机重组后，编码的酶催化八氢番茄红素向 3，4，3，， 4一 四氢番茄红素转化。番茄红素环化酶 中的几 个氨基酸替换后 ，催化 3，4一二氢番茄红素向 toru— lene(3’，4～ didehydro—l3， ～carotene)转化 J。 二、转基因植物 增加植物类胡萝 卜素含量 、提高其营养价值是 这方面研究的主要 目的，目前已在以下几个方面获 得了成功：(1)通过修饰番茄类胡萝 卜素生物合成 途径 ，将番茄红素转化为其他类胡萝 卜素ll。。；(2) 提高油菜种子原有类胡萝 卜素的含量_l¨；(3)通过 转基因的方法使原本不产类胡萝 卜素的组织如稻 米胚乳产生类胡萝 卜素[12]。 由两分子牦牛儿基焦磷酸缩合成八氢番茄红 素是类胡萝 卜素生物合成途径的第一步，番茄成熟 过程中导致番茄红素积累的关键酶是八氢番茄红 素合成酶 ，如果要用遗传工程的办法控制番茄果实 中类胡萝 卜素的组成的话，遗传修饰该酶的基因是 最重要的途径之一【13j。番茄中八氢番茄红素合成 酶基因持续高水平的表达，可使其种皮、子叶、胚轴 富含类胡萝 卜素，在此情况下因类胡萝 卜素合成途 径竞争使用异戊二烯焦磷酸 ，使得赤霉素和脱落酸 的合成量减少，导致植株变矮。将细菌八氢番茄红 素脱饱和酶或 一j：胡萝 卜素脱饱和酶基 因转到番 茄后 ，转基因番茄果实总类胡萝 卜素量有所下降， 但 l3一胡萝 卜素的含量增加 3倍ll ，其他类胡萝 卜 素合成酶特别是内源 j：一胡萝 卜素脱饱和酶和番 茄红素 l3一环化酶的表达得到加强。 稻米不含类胡萝 卜素，用遗传工程方法使稻米 胚乳产生环化类胡萝 卜素如 l3一胡萝 卜素需要建 立类胡萝 b素生物合成途径中的至少 4个反应 ，包 括八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱饱和酶 、j： 一 胡萝 卜素脱饱和酶和番茄红素 l3一环化酶催化 的反应。转化是由带有植物八氢番茄红素合成酶 基因和细菌八氢番茄红素脱饱和酶基 因的质粒进 行的，这两个基因加上质体靶序列和麦谷蛋白启动 子或花椰菜病毒35S启动子，表达的八氢番茄红素 合成酶和八氢番茄红素脱饱和酶完成从耗牛儿基 牦牛儿基焦磷酸合成番茄红素_l ，令人惊奇的是： 产生的类胡萝 卜素不是番茄红素，而是叶黄素、玉 米黄质、a一胡萝 卜素和 l3一胡萝 卜素。显然 ，番茄 红素 l3一、￡一环化酶和 l3一、￡一羟化酶在转化体内 被诱导合成或原本就有表达 ，如果八氢番茄红素合 成酶基因和细菌八氢番茄红素脱饱和酶基因与番 茄红素 l3一环化酶基因共同转化植株，稻米胚乳 的 l3一胡萝 卜素含量可达 1．6>g／g。 遗传工程方法增加油菜籽类胡萝 卜素含量的 研究取得了巨大的成功 ，八氢番茄红素合成酶基因 用质体靶序列延长后加上种子特有的启动子 ，转化 植株 ；如果 ，成熟种子中的类胡萝 b素含量增加 50 倍 ，种胚呈鲜亮橘黄色，而对照植株为绿色胚 ；转基 因植株种子种类胡萝 卜素(主要为 a～胡萝 卜素和 l3一胡萝 卜素 )的含量在 lmg／g以上，菜籽油 中的 类胡萝 卜素的含量达到 2mg／g[¨J。 总之，类胡萝 卜素生物合成途径的遗传修饰已 用于微生物类胡萝 卜素的生产、增加植物类胡萝 卜 素含量和调节类胡萝 卜素的积累。在合适的微生 】7 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2002 No．5 物中生产类胡萝 卜素前景很好 ，新的类胡萝 卜素生 物合成途径相关基因的克隆、体外修饰和重组以及 由产生的不同类胡萝 卜素衍生物 ，对类胡萝 卜素结 构与功能的研究非常重要。代谢工程可 以解决异 戊二烯前体的供应的瓶颈问题 ，类胡萝 卜素的代谢 途径完全可以通过遗传工程和代谢工程重新设计 ， 要获得高产量的类胡萝 卜素的主要 问题是宿主对 类胡萝 卜素的存贮能力。人们在用遗传工程方法 提高植物类胡萝 卜素含量和其营养价值方面作 了 不少的尝试 ，需要注意的问题是不要干扰其他异戊 二烯代谢途径 ，这可以在靶组织 中进行来避免，如 果实和种子，这些组织基础代谢弱 ；同时，在遗传工 程中使 目的基 因处于组织器官特异的启动子控制 之 下 。 参考文献 1．Van Den Berg，H．et a1．(2000)The potentiM for the improve— ment of carotenoid levels in foods and the likely systemic ef— fects．J．Sci．FoodA ．80，880—912 2．Peck RF，Johnson EA，Krebs MP．(2002)Identification of a lycopene beta——cyclase r~ mred for bacteriorhodopsin biogene— sis in the al'chaeon Halobacterium salinarttm．J Bacteriol Jun；184(11)：2889—97 3．Armstrong GA，Hearst JE．(1996)Carotenoids 2：Genetics and molecular biology of carotenoid pigment biosynthesis． FASEBJ Feb；10(2)：228—37 4．Misawa，N．and Shirnada，H．(1998)Metabolic engineering for the prodction of carotenoids in non—carotenogenic bacteria and yeasts J B 0technol 59．169—181 5 Shimada，H．et．al(1998)Increased carotenoid production by the food yeast Cand／da utlils through metabolic eng inee ring of the isoprenoid pathway．App1．Environ．Microbio1．64，2676 — 2680 6．AIbrecht，M．et a1．(1999)Metabolic engineering of the ter— penoid biosynthetic pa thway of Escherichia colifor production of the carotenoids b—carotene an d zeaxanthin Biotechno1． ． 21，791—795 7．Wang，C．W．et a1．(1999)Engineered isoprenoid pathway an— hances astaxanthin prod uction in Escherchia coli．Biotechno1． Bioeng．62，235—241 8．A1brecht，M．et a1．(2000)Novel hydroxycarotenoids with im— proved an tioxidative properties．prod uced by gene combination in B cherichia coli． t．Biotechno1．18．843—846 9．Schmidt— Dannert，C．et a1．(2000)Molecular breeding of carotenoid biosynthetic pathways．．Nat Biotechno1．18，750— 753 10．Romer，S et a1．(2000)Elevation of the provitaminA content of transgenic tomato plan ts．Nat Biotechno1．18，666—669 11．Shewmaker，C．K．et a1．(1999)Seed—specific overexpres— sion of phytoene syn thase：increase in carotenoids an d other metabolic effects．Plant．J 20，401—412 12．Ye，X．et a1．(2000)Engineering the provitamin A(b— carotene)biosyn thetic pathway into carotenoid—free rice an— dospe rm．Sc／et／ce 287，303—305 13．Fray，R．G．et a1．(1995)Constitutive expression of a fruit phytoene syn thase gene in transgenic tomatoes causes dwarfism by redirecting metabo lites from the gibberellin path— way Plant J．8，683—701 (上接 10页) 水 中是不能溶解的。此外 ，番茄红素经包合后 ，明 显改善了对光、氧和热的稳定性。但是在试验中也 发现了一些问题 ，如主客分子 比过大，致使包合物 中番茄红素含量太低 ，结果不能令人满意等。这些 问题的解决 ，还有待于进一步的实验研究。 参考文献 1．Di Mascio P，Kaiser S，Sies H．Lycopene aS the most efficien t biological caroten oid single oxygen quen cher．Arch biochem． Biophys，1989，274：532—538 2．Giovannucci E，Ascherio A，Rim E B et a1．Intake of carotenoids and retlnolin relation to risk of prostate cancer．J Natl Cancer Inst．，1995，87(23)：1767—1767 18 3．Fran ceschi S，Bidoli E，Vecchia L et a1．Toma toes an d risk of digestive—tract cancers．Int．J．Cancer，1994，59，181—184 4．Giovannucci E：Tomatoes，tomato—based products，lyco pene， and prostate cancer：Review of the epidemiologic hterature．J Natl Cancer Inst 1999，91：317—331 5．Levy J，goNon E，Feldman B et a1．Lycoperm is a more potent inhibitor of human cancer cell proliferation than either alofac． 1~'oten e or be ta—carotene．Nutrition and Cancel"，1995，24：257 — 266 6．赵海霞等 ，环糊精包合技术 ，山东 中医杂志 ，2000，4：241— 243 7．张连富，番茄红素开发及生理功能研究，无锡轻工大学博士 学位论文 ，2000 维普资讯 http://www.cqvip.com