HPLC法测定婴幼儿配方奶粉复合维生素添加剂中维生素B12方法的研究

《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．2 HPLC法测定婴幼儿配方奶粉复合维生素添加剂中 维生素 B12的研究 郝岩平 姜金斗 房玉国 (国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨 15oo86) 摘要：建立了高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉专用复合维生素添加剂中维生素B。2方法含量的方法。 采用紫外检测器，波长为 361rim；色谱柱为 Inertsil ODS一3，柱温为室温，流动相为磷酸二氢钠(10g／l 磷酸调 pH 3．5)：甲醇=70：30，流速为 1．0ml／nfin。曲线回归方程Y=一0．1340+0．0009592x，相关系数为r= 0．9976；回收率为96．4％；12次样品重复测定变异系数为0．54％。 关键词：高效液相色谱，复合维生素添加剂，维生素B Research on the Determination Method of Vitamin B12 in Composite Vitamin Additives for Milk Powder and Formula by HPLC (National Dairy Testing Center，Harbin 150086) Al~a'act：Amethodfor detemfination ofvitamin BI2in composite vitamin additivesformilk powder andformula byHPLCisIe- ported．Ultraviolet detector，inerlsilODS-3 column was usedwith columntemperature 25 ．Mobile phase l0g／L~ 2P04(pH 3．5)：ACN is 70：30．The speed ofmobile phase was 1．0ml／min．The regressing equation was Y=一0．1340+0．0009592x， the relative coefficient was 0．9976，the recovery was 96．4％ ；the CV％ in 12 sample testing was 0．54％ ． Key wO b：HPLC，Composite vitamin additives，Vitamin BI2 闹、反应迟钝、爱睡觉、手足无意识运动或头与肢体 颤动，最后导致贫血。美国纽约的哥伦比亚大学和 O 引言 丹佛的科罗拉多大学的专家对323名缺乏维生素 维生素 Bl2是所有维生素中分子最大和最复杂 B12的人进行考察，发现其中将近半数的人(共 141 的一种，但是人体对它的需要量也许是所有维生素 人)出现了程度不同的神经损伤及精神性症状。症 中最少的一种，每天只需 3微克左右即可。过量的 状包括痴呆、抑郁、记忆障碍、平衡功能失调等，有 维生素 Bl2也会产生副作用，大量维生素 Bl2也可导 的还有精神分裂症的表现。当医生给这些人补充 致叶酸缺乏。维生素 B。2可以提高叶酸的利用率， 维生素B1：后，许多患者的精神性症状完全消失。 若缺乏维生素 B。2，则叶酸的利用受到影响。维生 根据目前已报道的资料，测定维生素 B12主要 素 Bl2缺乏还可导致周围神经炎。小孩缺乏维生素 有四种方法：比色法、原子吸收分光光度法[1i、高效 B·2的早期表现是精神情绪异常、表情呆滞、少哭少 液相色谱法及微生物法。微生物法是测定如食品 93 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2O04 No．2 中维生素 B12的通用方法 J，该法灵敏度特别高，可 测定出样液中 0．Olng／ml的含量。但由于该法操 作繁琐，检验周期长，技术难度大，影响因素多及重 现性差、成本高等问题而不能广泛应用。特别是用 此法测定添加剂等维生素 Bl 含量高的样品，由于 稀释倍数较大且难于掌握等使测定误差较大，不很 适宜；而前三种方法大都用于药品类等含量较高的 样品(一般含量 mg／g级)。我们通过对查阅的大量 已报道的国内外资料进行对比研究后发现，在已报 道的有关液相色谱法测定维生素B 方法中检出限 一 般都不能满足奶粉专用维生素添加剂的测定。 如国家药品标准中规定的方法 3，测定液中要求在 lOt,e,／ml以上；测定饲料添加剂时，测定液中要求 在40tc,／ml左右。而奶粉专用复合维生素添加剂 中的维生素 B12含量一般为 lOgg／g或更低(国标规 定婴幼儿配方奶粉中维生素 Bl2含量为≥0．8t~,／ 100g，即维生素添加剂含量一般应在800t~,／100g以 上)HJ，若称取样品量为 l0克左右(称样量过大样 品无法完全溶解及会影响色谱柱分离)，定容至50 毫升时，测定液中维生素 B12含量约为2ug／ml；且许 多样品中的维生素 B12含量低于 lOgg／g，制备液甚 至在 lgg／ml以下，所以用于测定此类样品中维生 素B， 含量的方法必须达到一定的检出限。另外在 奶粉专用复合维生素添加剂中除含有 l0多种维生 素外，还有其他杂质。这些组分含量远高于维生素 B。 含量，要通过色谱柱进行有效分离并准确定量 测定，在选择合适的色谱柱的同时，还需研究相应 的测定条件及样品处理方法。本研究就是根据此 类样品的特点，通过研究适于测定维生素Bl 的高 效液相色谱条件，从而建立相应的检验方法。 1 试验仪器与材料 1．1 主要仪器 Waters 1525高效液相色谱二元泵，Waters 2996 二极管阵列检测器及色谱工作站；超声波等。 1．2 试验用试剂 乙腈(色谱纯)，甲醇(色谱纯)，磷酸二氢钠，磷 酸二氢钾，维生素 B12(Sigma)，辛烷磺酸钠(Sigm~)， 磷酸，硫酸锌。 1．3 试验材料 奶粉专用复合维生素添加剂 94 2 试验方法研究 2．1 色谱柱及色谱测定条件 选择两种色谱柱 inertsil ODS一3和迪马 一cl8 柱，250 X 4．6mm，粒度 5tan进行试验。结果表明分 离效果及柱效等性能前者优于后者，在研究中选用 ODS色谱柱作为试验测定用色谱柱；经研究确定色 谱测定条件为：柱温为室温；流动相流速 lml／min； 测定波长361nm。通过计算，此条件下测定维生素 B12的色谱柱理论塔板数 J为2216。 2．2 流动相的试验研究 根据有关资料，共选择了六种不同流动相：(1) 磷酸二氢钾(0．02mol／l pH 3．0)：甲醇为 75：25、85： l5、90：10；(2)磷酸二氢钾(0．02mol／l pH 3．0)：乙腈 为75：25、85：15、90：10；(3)磷酸二氢钠(5g／l pH 3． 5)：甲醇为 65：35、70：30、75：35；(4)磷酸二氢钠 (8s／l pH 3．5)：甲醇为 65：35、70：30、75：35；(5)磷 酸二氢钠(10g／l pH 3．5)：甲醇为 65：35、70：30、75： 35；(6)磷酸二氢钠(10g／l pH 3．5)：甲醇 +辛烷磺 酸钠0．1％为65：35、70：30、75：35。 试验结果表明：(1)、(2)、(3)、(4)四种流动相 不同配比的主要问题一是检出限都在 16ng以上 (此检出限无法测定奶粉维生素添加剂中的维生素 Bl2)；二是部分配比维生素 Bl2无法与其他成分进 行有效分离；三是灵敏度较低；在后面的试验中不 予采纳。(5)流动相的三个配比中保留时间分别为 4．21min、6．05min、7．58min，其中第一个的样品峰与 杂质重叠，无法分离；而第三种配比的峰有拖尾现 象；70：30的配比分离好、响应值高。(6)的三个配 比流动相试验结果与(5)基本相同，即加入离子对 试剂辛烷磺酸钠对分离测定结果无影响。所以在 下列的所有试验中全部采用磷酸二氢钠(10g／l pH 3．5)：甲醇=70：30的流动相进行试验研究(标准样 品及样品测定色谱图见图 1和图2)。 2．3 最佳测定波长的选择 浓度为3t,e,／ml的标准维生素 B12用二极管阵 列检测器在波长为200 500nm的范围内进行色谱 图扫描后确定波长为361nm处吸收值最大，峰形较 好，在下列研究中采用该波长。 2．4 样品处理 2．4．1 称取样品 lOg放于 125ml三角瓶中。加入 30m140~C左右的蒸馏水溶解后放人超声波中，l0分 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．2 图 1 维生素 Bl2标准色谱图 图2 样品维生素 Bl2色谱图 钟后取出，转入50ml容量瓶中定容，混匀后用滤 纸。滤液通过0．45tma的滤膜后上机测定。 2．4．2 称取样品 10g放于 125ml三角瓶中。加入 25m140~C左右的蒸馏水溶解后放人超声波中，10分 钟后取出，转入 50ml容量瓶中加入 10％硫酸锌溶 液5ml定容，混匀后用滤纸。滤液通过 0．45tma的 滤膜后上机测定。 由于样品中往往用有机物作载体，所以用蒸馏 水直接溶解后即使通过滤膜也会出现混浊的现象； 而用硫酸锌作沉淀剂时可有效把有机成分沉淀，待 测液澄清，更利于上机测定。所以样品测定中即采 用该法处理样品。 3 结果与分析 3．1 标准曲线的测定 标准溶液的配制：配制维生素 B。 浓度为 lmg／r~的储备液；然后配制成浓度各为 0．5、1．0、 2．0、3．0、4．0、5．0ug／n~的系列标准浓度的溶液，进 样量分别为20／A。上机测定并计算回归方程及相 关系数，结果见表 1。 ． 表 l 维生素 B，2标准曲线测定结果 根据上表可计算出维生素B。 标准曲线的回归 方程为 ：Y=一0．1340+0．0009592x，相关系数为 r = 0．9976。浓度与峰高间呈正相关，相关性好，可 用于外标法进行定量测定。 3．2 样品测定 共选用了企业送检的5个含有维生素 B。2的婴 幼儿配方奶粉专用维生素添加剂按 2．4．2的方法 处理样品后进行测定(测定结果列于表 2)并按下 式计算结果。 样品中维生素 BI2(Ug／10og)= x 100 式中：h．一样品峰高(ⅡⅡn) h2一标样峰高(一 ) V一样液体积(m1) m一样品质量(g) c一维生素Bl2标准溶液浓度(ue,／r~) 表 2 婴幼儿配方奶粉专 用维生素添加剂维生素 B，2测定结果 样品号 1号样品 2号样品 3号样品 4号样品 5号样品 含量(ug／lOOg)335 341 402 415 388 370 490 479 628 645 从 5个样品测定结果看，两次平行间的相对偏 差都在5％以内。 3．3 回收率与精密度试验 3．2．1 回收率试验：以上述5个样品作为试验材 95 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20D4 No．2 料，分别加入维生素 Bl2标准溶液，然后再按上述操 作步骤进行测定，测定结果见表 3： 表 3 维生素 Bl2回收率试验结果 样品号 1 2 3 4 5 平均 理论值(gg) 50 50 50 50 50 实测值(gg)50．85 48．00 49．20 47．70 45．25 回收率％ 101．7 96．0 98．4 95．4 90．5 96．4 5次重复测定结果回收率平均为96．4％，其准 确度可满足测定婴幼儿配方奶粉专用维生素添加 剂中维生素Bl2含量的要求。 3。2。2 精密度试验：以5号样品作为试验样品，同 时重复测定 12次，结果见表 4。 表4 精密度试验结果 (单位 tw,／loog) 测定次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 l1 12 x CV％ 628 645 649 641 657 664 658 639 650 633 655 668 649 0．54 维生素Bl2含量 12个平行样品测定结果统计分析表明，测定 结果平均值为649pg／100g，样品测定结果的重复性 较好，变异系数为 0．54％。可以满足采用该法测 定婴幼儿配方奶粉专用维生素添加剂中维生素 B。2 含量的要求。 3．4 最低检出限的测定 按噪音 2倍计算出的最低检出限为 4ng，即若 按与标准溶液同体积(20 )进样，可检出样液中 0．2pg／ml的维生素 Bl2的含量。从而可得出用本法 测定婴幼儿配方奶粉专用维生素添加剂中维生素 Bl2检出限为 lpg／g。 4 结论 4．1 通过对流动相的研究后认为：六种流动相 中，只有(5)、(6)两种适于测定维生素 Bl2。其中加 入离子对试剂的流动相分离效果与未加的相同，所 以采用(5)中的磷酸二氢钠(10g／l pH 3．5)：甲醇= 70：30测定维生素 Bl2的流动相。 4．2 色谱测定条件：色谱柱选用 inertsil ODS一3， 250×4．6mm，粒度 5tan；柱温为室温；流动相流速 hnl／min；测定波长 361nm。此条件下测定维生素 Bl2的色谱柱塔板数为2216。 4．3 此方法标准曲线线性好，回归方程为： Y=一0．1340+0．0009592x，相关系数为 r=0．9976。 浓度与峰高间呈正相关，相关性好，可用于外标法 进行定量测定。 4．4 方法回收率与精密度试验结果较好，回收率 在90—102％间，平均为 96．4％，样品重复测定 12 次的变异系数为0．54％。此方法检出限为4ng，计 算可得婴幼儿配方奶粉专用维生素添加剂中维生 素Bl2的检出限为lpg／g，可满足任何奶粉专用维生 素添加剂中维生素Bl2的测定。 综上所述，采用 HPLC法测定婴幼儿配方奶粉 专用维生素添加剂中维生素B。2其测定精密度和准 确度能满足乳制品分析的要求。因此，可作为常规 检测方法应用。 参考文献 1．黄伟坤．食品检验与分析(M)．北京．中国轻工业出版社． 2OOO．132—134． 2．中华人民共和国国家标准．婴幼儿配方食品和乳粉通用检 验方法．标准号：GB／T5413．14—1997 3．国家药品监督管理局．国家药品标准．注射用多种维生素 (9)．标准号WS1一XG一一20O2 4．中华人民共和国国家标准．婴幼儿配方食品及婴幼儿补充 谷粉通用技术标准．标准号：GB10767—1997 5．L．R．施奈德．实用高效液相色谱法的建立．北京．科学出版 社 ．2OOO．27． 维普资讯 http://www.cqvip.com