棕榈酰化修饰对G蛋白偶联受体功能的调节作用

书书书 ISSN 1007-7626 CN 11-3870 /Q 中国生物化学与分子生物学报 http:/ / cjbmb． bjmu． edu． cn Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2012 年 2 月 28(2) :99 ～ 107 ·综述· 棕榈酰化修饰对 G蛋白偶联受体功能的调节作用 刘 洁， BALOUCOUNE Guillaume A．， 春 雷* ( 华中科技大学生命科学与技术学院，分子生物物理教育部重点实验室，武汉 430074) 摘要 G 蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs) 作为跨膜蛋白，其结构和功能同时受相 互作用的蛋白质和脂质分子调控 ． S-棕榈酰化(S-palmitoylation) 能够影响GPCRs 与信号蛋白及膜 脂分子的相互作用，在 GPCRs 相关的多项生理进程中发挥重要调节作用 ． 棕榈酸与 GPCRs 的半胱 氨酸间形成不稳定的硫酯键，其修饰动力学过程受棕榈酰转移酶(protein acly transferases，PATs) 与 硫酯酶(thioesterases) 之间的可逆性双重调控，与受体活性及生理状态密切相关． 棕榈酰化修饰多 发生在 GPCRs 的 C 末端，通过棕榈酸侧链插入到质膜内侧而形成第 4 和 /或第 5 个胞内环，从而影 响 GPCRs 的构象，促进其正确折叠与成熟，并对 GPCRs 胞内转运、分选、下游信号转导、失敏、内 化、寡聚化等活动产生影响 ． 此外，棕榈酰化还与磷酸化、泛素化及亚硝基化等多种翻译后修饰机 制相互作用，共同参与调节 GPCRs 的功能 ． GPCRs 的棕榈酰化修饰酶学机制以及 GPCRs 蛋白复合 体棕榈酰化修饰胞内动力学过程将是未来的研究热点 ． 关键词 G 蛋白偶联受体; 棕榈酰化修饰; 动力学; 信号转导 中图分类号 Q25;Q291 Palmitoylation Modification Regulates G-protein-coupled Receptors Effects LIU Jie，BALOUCOUNE Guillaume A．，CHUN Lei* (Key Laboratory of Molecular Biophysics of Ministry of Education，School of Life Science and Technology， Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China) Abstract G-protein-coupled receptors (GPCRs)are transmembrane proteins，hence a number of their structural and functional features are modulated by both proteins and lipids． S-palmitoylation，as a classical lipid modification，regulates diverse aspects of GPCRs by affecting the interaction between GPCRs and signal proteins or lipid molecules． It is defined as the addition of saturated 16-carbon palmitate acid to specific cysteine residues through the formation of a liable thioester bond． The palmitoylation / depalmitoylation dynamics is regulated reversibly by both the palmitoyl acyl transferases (PATs) and palmitoyl protein thioesterases under various physiological status． Many GPCRs are palmitoylated on cysteine residues present in their cytoplasmic termini． The insertion of palmitate into the cytoplasmic leaflet of the plasma membrane can create the fouth and / or the fifth intracellular loop，thus profoundly affecting GPCRs structure，trafficking，sorting，signaling，desensitisation，internalization and oligomerisation． Furthermore， the interplay between palmitoylation and other posttranslational modifications，such as phosphorylation，ubiquitination and nitrosylation，can regulate the function of GPCRs coordinatively． It is expected that the identification of enzymes involved in GPCRs palmitoylation dynamics will be a key to delineate the role of palmitoylation in regulating GPCRs functions． Key words G-protein-coupled receptors;palmitoylation;dynamics;signaling 收稿日期:2011-11-09; 接受日期:2011-12-21 国家重点基础研究发展规划(973 计划，No． 2012CB518006) * 联系人 Tel:027-65516629;E-mail:lchuncn@ gamil． com Received:November 9，2011;Accepted:December 21，2011 Supported by Major State Basic Research Development Program of China (973 Program，No． 2012CB518006) * Corresponding author Tel:027-65516629;E-mail:lchuncn@ gamil． com 中国生物化学与分子生物学报 第 28 卷 G 蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors， GPCRs) 作为哺乳动物细胞内最重要的受体家族之 一，其功能受磷酸化、糖基化、泛素化及脂质化等多 种翻译后修饰机制调控 ． 其中脂质化修饰通过影响 GPCRs 与膜脂分子的相互作用而在 GPCRs 的多个 功能输出领域发挥调控作用 ． 棕榈酰化、豆蔻酰化 (myristoylation) 与异戊二烯化(prenylation) 是真核 蛋白常见的 3 种脂修饰方式 ． 棕榈酰化因其动态可 逆的酶促调控机制成为最重要的脂修饰方式，并与 其它多种翻译后修饰机制相互作用，联合调控 GPCRs 的功能 ．自 1984 年首次在牛视紫红质中发现 棕榈酰化修饰以来，已发现多种 GPCRs 中存在棕榈 酰化修饰 ． 因早期研究手段较为单一，其对 GPCRs 的调控作用并未引起重视 ． 近 10 年来，随着棕榈酰 基转移酶及硫酯酶的鉴定，酰基-生物素交换法 (acyl-biotinyl exchange，ABE)、非放射性棕榈酸类似 物代谢标记法的建立，蛋白质棕榈酰化动态调控机 制研究发展迅速，人们对其生理功能及相关病理机 制的认识极大拓展 ． 更多棕榈酰化修饰的 GPCRs 以及修饰位点得到鉴定，其动力学过程与磷酸化、泛 素化、亚硝基化等修饰之间的相互作用获得深入研 究 ． 棕榈酰化修饰是通过自身的疏水性与脂筏亲和 性来影响蛋白质分选，但对跨膜蛋白的调控作用则 更为复杂，已经发现棕榈酰化修饰对 GPCRs 构象、 胞内转运、分选、与 G 蛋白间的相互作用、下游信号 转导、失敏及内化、寡聚化等均有影响 ． 1 GPCRs 内棕榈酰化修饰位点 1. 1 棕榈酰化修饰的检测方法 目前，常用 2 种方法检测目的蛋白的棕榈酰化 修饰状态:棕榈酸脂代谢标记法［1］与 ABE 法［2］． 代 谢标记法适用于在活细胞中追踪目的蛋白的棕榈酰 化修饰动力学过程，并受蛋白棕榈酰化修饰代谢率 的影响 ．一般用放射性3H 标记的棕榈酸标记，新型 代谢标记法则采用非放射性的棕榈酸类似物标记， 并结合 click 化学技术检测［3］． ABE 方法适用于无 细胞体系蛋白抽提物棕榈酰化修饰的原位检测，与 蛋白的棕榈酰化修饰代谢率无关 ． 如与质谱技术联 合使用，可进行蛋白组学棕榈酰化修饰的大规模检 测 ．缺点是羟胺对于跨膜蛋白的硫酯键裂解效率较 差，从而对膜蛋白棕榈酰化修饰检测灵敏度偏低 ． 1. 2 GPCRs 中棕榈酰化修饰的位点 棕榈酸是 16 碳饱和脂肪酸，通过与半胱氨酸的 巯基形成硫酯键而对 GPCRs 进行修饰(S-型棕榈酰 化修饰)．大部分 GPCRs 超家族成员，在胞内 C 末端 近膜区与第 7 次跨膜区相邻的位置存在 1 个保守的 两性 α 螺旋(H8 螺旋)［4］． 在家族 A 中，H8 螺旋的 C 末端含有 1 个到多个保守的半胱氨酸，多数家族 A 成员在此处发生棕榈酰化修饰(Table 1)． 此外， 部分家族 A 成员在 C 末端远膜区还有 1 ～ 2 个半胱 氨酸可发生棕榈酰化修饰，例如 5-羟色胺受体(5- hydroxytryptamine receptor，5-HT) 中的5-HT4(a) ［5］与 5-HT7(a) ［6］等 ．少数家族 A 成员不发生棕榈酰化修 饰 ．在家族 C 中，大多数成员在 H8 螺旋的 C 末端缺 乏半胱氨酸 ．除了代谢型谷氨酸受体 4(metabotropic glutamate receptor 4，mGluR4) ，至今未在其他家族C 成员中有关于棕榈酰化修饰的报道［7］． 在 GPCRs 中，7 次跨膜区所形成的 3 个胞内环 也能发生棕榈酰化修饰 ． 研究发现，μ-阿片受体(μ- opioid receptor，μ-OR)［8］C 末端的 2 个半胱氨酸未 发生棕榈酰化修饰，而在第 2 个胞内环的 C170(C 末端之外唯一的胞内半胱氨酸) 发生棕榈酰化修 饰;将V1a ［9］与 V2 ［10］后叶加压素受体(vasopressin receptor，VR)C 末端全部半胱氨酸突变，仍能检测出 棕榈酰化修饰信号，提示在胞内还存在其它的棕榈 酰化修饰位点 ． 2 GPCRs 中棕榈酰化修饰动力学机制 2. 1 棕榈酰化修饰相关的酶学机制 棕榈酸与半胱氨酸间形成不稳定的硫酯键，棕 榈酸的结合与解离过程受棕榈酰转移酶与硫酯酶的 双重调控，具有可逆性 ． 棕榈酰基转移酶因具有保 守的 DHHC (Asp-His-His-Cys) 结构域而被称为 DHHC 家族［28］．此类酶均为膜蛋白，明棕榈酰化 反应发生在胞浆与膜的交界处 ．目前，已在哺乳动物 基因组中鉴定出 23 种该家族成员，分为 7 个亚族 ． 不同 PAT 具有独特但又交叉的底物特异性，在胞内 不同膜区域广泛分布，以高度可控的协同方式调控 蛋白的棕榈酰化水平 ． 虽然棕榈酰化反应没有严格 的保守序列，但棕榈酰化修饰的半胱氨酸具有某些 共性:(1) 通常与发生豆蔻酰化或异戊二烯化修饰 的位点相邻，(2) 周围氨基酸多为碱性或疏水性氨 基酸，(3) 通常位于跨膜结构域相邻的胞质侧区域． 2011 年，在对生长抑素受体 5(somatostatin receptor 5，SSTR5) 的研究中，发现了第1 个 GPCRs 的棕榈 酰基转移酶 ZDHHC5，其 N 末端与受体的 H8 螺旋 相互作用，影响受体的棕榈酰化修饰［29］． 相比于棕榈酰化酶类，对去棕榈酰化酶的研究 001 第 2 期 刘 洁等:棕榈酰化修饰对G 蛋白偶联受体功能的调节作用 Table 1 Partial list of GPCR palmitoylation Cysteine Receptor Flanking sequences C-termini H8-Helix Bovine rhodopsin ［11］ QFRNCMVTTLCCGKNPLGDDE Human β2 -adrenergic receptor ［12］ DFRIAFQELLCLRRSSLKAYG Porcine α2A -adrenergic receptor ［13］ HDFRRAFKKILCRGDRKRIV Rat LH /CG receptor ［14］ DFLLLLSRFGCCKRRAELYRRK Human ETB endothelin receptor ［15］ RFKNCFKSCLCCWCQSFEEKQ Human muscarinic acetylcholine receptor m2［16］ KKTFKHLLMCHYKNIGATR Human thyrotropin receptor ［17］ VFILLSKFGICKRQAQAYRGQ Human A1 adenosine receptor ［18］ FLKIWNDHFRCQPAPPIDEDL Human D1 dopamine receptor ［19］ RKAFSTLLGCYRLCPATNNAIE Rat bradykinin B2 receptor ［20］ KKSREVYQAICRKGGCMGESV Human chemokine 5 receptor ［21］ FFQKHIAKRFCKCCSIFQQEAP Canine H2 histamine receptor ［22］ FRTAYQQLFRCRPASHNAQET Metabotropic glutamate receptor 4［7］ Human prostaglandin receptor ［23］ VFQRLKLWVCCLCLGPAHGDS Distal 5-hydroxytryptamine receptor 4a［24］ CCDDERYKRPPILGQTVPCSTTTINGSTHLRYTVLRYTVL HSGHHQELEKLPIHNDPESLESCF CQYRNINRKLSAAGMHEALKLAERPERPELVLQKSDYC 5-hydroxytryptamine receptor 7a［6］ CNLRLPGSSDSRASASRAAGITGVSHCARPCMLF CYEMQAQIYRTETSSTVHNTHPRNGHC Thromboxane A2 receptor TPβ ［25］ LLCCARRAARRRHATHGDRPRASGCLA Follicle-stimulating hormone receptor［26］ β1 -Adrenergic receptor ［27］ i-loop μ-opioid receptor ［8］ DRYIAVCHPVKALDFRTPRNAK Rat vasopressin receptor V1a ［9］ LLQDCVQSFPCCHSMAQKFAK Human vasopressin receptor V2 ［10］ SVSSELRSLLCCARGRTPPSLG * C is the cysteine modified by palmitoylation 才刚起步 ．目前发现 2 类去棕榈酰化酶 ． 第一类，蛋 白棕榈酰基硫酯酶 1(protein palmitoyl thioesterase 1，1) ，定位在溶酶体内腔，在蛋白质降解中的去 棕榈酰化步骤中发挥作用 ．另一类，酰基蛋白硫酯酶 1(acyl protein thioesterase 1，APT1) ，定位于胞浆中， 负责调节胞内蛋白棕榈酰化的动态平衡［30］． 目前尚 无作用于 GPCRs 的去棕榈酰化修饰相关酶类的 报道 ． 目前，利用小分子抑制剂及 RNA 干扰技术进行 蛋白质棕榈酰化修饰酶学机制的研究 ． 2-溴代棕榈 酸(2-bromopalmitate，2-BP) 能够抑制蛋白质酰基转 移酶的活性，从而抑制蛋白质棕榈酰化修饰的发 生［31］．缺点是特异性差，几乎对所有胞内蛋白的棕 榈酰化修饰均有影响 ． 近期研究发现的 FD196 与 FD253 则能选择性抑制酰基蛋白硫酯酶的活性，从 而抑制蛋白质的去棕榈酰化修饰 ． 这将有利于棕榈 酰化修饰研究的发展 ． 筛选蛋白质酰基转移酶的特 异性抑制剂，将成为研究目的蛋白棕榈酰化修饰酶 学机制以及相关动力学过程的关键 ． 2. 2 GPCRs 中棕榈酰化修饰动力学过程 蛋白质棕榈酰化修饰的代谢率一般短于蛋白的 半寿期，其棕榈酰化修饰-去修饰发生组成性循环， 或者受胞外信号的动态调控 ． 研究发现，激动剂会 增加某些 GPCRs 棕榈酰化修饰的代谢率 ． 例如，β2 - 肾上腺素能受体(β2 -adrenergic receptor，β2 -AR) 被 异丙肾上腺素激活后，3H 标记的棕榈酸摄入量增 加［32］．其增加的途径有下述 2 种:(1) 激动剂的结合 增加棕榈酰化受体的比例; (2) 激动剂的结合促进 受体所结合棕榈酸的代谢率，3H 未标记的棕榈酸会 被3H 标记的棕榈酸取代 ．后者意味着激动剂的诱导 会加速受体去棕榈酰化，此假说在 β2 -AR ［33］、1 型多 巴胺受体(dopamine D1 receptor1，D1R) ［34］、α1B肾上 腺素能受体(α1B -adrenergic receptor，α1B -AR) ［35］、 α2A肾上腺素能受体(α2A -adrenergic receptor，α2A - AR)［36］和 δ-阿片受体(δ-opioid receptor，δ-OR)［8］的 研究中得到证实 ． 但并非所有 GPCRs 均符合此假 说，例如，血清素 1A 受体(serotonin 1A receptor)［37］ 的棕榈酰化即不受激动剂的影响 ． 101 中国生物化学与分子生物学报 第 28 卷 在静息条件下，某些 GPCRs 的半胱氨酸位点也 发生棕榈酰化修饰的组成性循环 ．最新研究证实，通 过非放射性炔基-16( 棕榈酸类似物) 代谢标记及脉 冲追踪分析，能检测 β1 -肾上腺素能受体 (β1 - adrenergic receptor，β1 -AR) 每个修饰位点的棕榈酸 代谢率［27］． 发现 β1 -AR 的近膜区位点 C392 /C393 与远端 C414 发生棕榈酰化修饰的时间及代谢率具 有显著差异 ．近膜区棕榈酰化修饰发生在蛋白质转 运到中间高尔基体之前，而远膜区棕榈酰化修饰则 发生在蛋白分泌途径的晚期 ． 暗示这 2 个位点的棕 榈酰化修饰受不同蛋白棕榈酰转移酶调控 ． 与之相 对应的是其近膜区位点棕榈酰化修饰非常稳定，在 追踪 90 min 内没有明显变化; 而远端位点则具有较 高的代谢率，标记 15 min 之内仅有少量棕榈酸未发 生代谢［27］．推测近膜区位点可能与蛋白质的正确折 叠及所调控的长时程效应相关，而远端位点则可作 为“开关”调控蛋白组成性内化 ． 3 棕榈酰化修饰对 GPCRs 功能的调控 棕榈酸通过其疏水性及脂筏亲和性来调控蛋白 质的分选 ．对可溶蛋白而言，棕榈酰化修饰能够促进 其与胞内膜系统的稳定结合，并通过棕榈酰化修饰- 去修饰动态平衡调控其在各亚细胞单位间的转运; 对跨膜蛋白而言，棕榈酰化修饰的作用则更加广泛 和复杂 ． 研究表明，棕榈酰化修饰对许多 GPCRs 的 构象有影响，并通过 GPCRs、G 蛋白以及脂质分子的 相互作用调控其下游信号传导、胞内转运及寡聚化 ． 3. 1 GPCRs 构象 应用 棕 榈 酸 荧 光 衍 生 物 标 记 视 紫 红 质 (rhodopsin) 的方法证实，有2 个棕榈酸侧链插入蛋 白外侧的细胞膜中 ．视紫红质 X-射线晶体结构解析 表明，H8 螺旋通过棕榈酸侧链锚定在细胞膜上，形 成了与细胞膜平行的第 4 个胞内环 ． 从而证明近膜 区棕榈酰化修饰在 GPCRs 结构中发挥重要作 用［38］．对 β2 -AR 的 X-射线晶体结构解析进一步支 持了该发现［39］． 但是，H8 螺旋并不是所有 GPCRs 都必须的，对趋化因子受体 CXCR4 (chemokine CXCR4 receptor，CXCR4) 晶体结构的解析发现，其 H8 螺旋序列 C 末端存在可棕榈酰化修饰的半胱氨 酸，但是在晶体结构中并未发现 H8 螺旋的存 在［40］． 部分 GPCRs 的 C 末端远膜区能通过半胱氨酸 的棕榈酰化修饰，或者异戊二烯化修饰形成第 5 个 胞内 环 ． 例 如 环 前 列 腺 素 受 体 (prostaglandin receptor) ，其C 末端近膜区 308 位与 311 位半胱氨 酸的双棕榈酰化修饰形成第 4 个胞内环，再由远膜 区的 C383 的异戊二烯化修饰形成第 5 个胞内 环［23］． 受体通过不同的环与不同的效应分子( 腺苷 酸环化酶和 /或磷脂酶 C) 相偶联． 这些由脂筏修饰 所形成包内环的长度、环内翻译后修饰类型及稳定 性，均会对蛋白质的棕榈酰化修饰产生影响，但相关 机制还有待进一步研究(Fig. 1)． Fig． 1 The model of C-terminal palmitoylation of GPCRs family A For the member of family A，there is a short amphipathic α helix(H8 helix)at the juxtamembranous C-termini and the seventh transmenbrance region，which can form the forth loop by palmitoylation;some of GPCRs also can form the fifth loop by palmitoylation or isoprenylation at the distal site(s)located in C-termini 3. 2 GPCRs 成熟与膜转运 棕榈酰化修饰与某些 GPCRs 的膜表达密切相 关 ．在这些 GPCRs 中，缺乏棕榈酰化修饰将导致受 体膜表达的显著下降 ． 一些成熟或未成熟 GPCRs 的 正确折叠，需要在内质网-高尔基体中间体完成，早 期棕榈酰化修饰即发生在此阶段 ． 当 GPCRs 的早期 棕榈酰化修饰被破坏后，受体的正确折叠受到影响， 不成熟或折叠失败的受体被滞留在胞内，同时被加 速降解并影响其上膜 ． 由于此类棕榈酰化修饰多发 生在蛋白质生物合成过程的早期，对蛋白的正确折 叠及转运十分重要，上述多为组成性修饰，相对比较 稳定，其代谢率较低 ． 另一些 GPCRs 的组成性棕榈 酰化修饰，在正常细胞水平对受体膜表达没有影响， 比如 β1 -AR 的近膜区组成性棕榈酰化修饰位点 C392 /C393 被突变，并未引起细胞水平受体膜表达 下降，但突变体的动物在压力条件下将产生膜表达 下降或受体细胞降解等长时程作用［27］． 近期研究发 现，表达视紫红质棕榈酰化修饰缺失突变体的小鼠， 201 第 2 期 刘 洁等:棕榈酰化修饰对G 蛋白偶联受体功能的调节作用 在强光作用下出现光受体细胞的降解，而在正常光 照条件下则无异常［41］．说明棕榈酰化修饰对 GPCRs 膜转运的影响可能在某些病理或异常条件下具有重 要的作用 ． 3. 3 GPCRs 分选 脂筏是细胞膜上富含胆固醇和鞘磷脂的特殊结 构 ．在静息条件下，不同 GPCRs 在脂筏中的定位有 显著差异 ． GPCRs 作为跨膜蛋白，其在脂筏中的定 位由以下 4 种因素决定: (1) 受体与脂筏脂质组分 ( 胆固醇及鞘磷脂) 的相互作用［42］; (2) 受体与脂筏 骨架蛋白( 比如小窝蛋白caveolin) 的直接相互作 用［43］; (3) 受体跨膜区胞外侧疏水氨基酸与脂筏的 相互作用［44］; (4) 受体饱和脂肪酸侧链与脂筏的相 互作用［45］．棕榈酰化修饰是大部分跨膜蛋白定位在 脂筏中的关键因素［46］． 例如 1 型大麻素受体 (cannabinoid receptor 1，CB1R)C415 发生棕榈酰化 修饰，将 C415 突变后定位于脂筏中的 CB1R 比例减 少 ．此外，1 型大麻素受体还可以与小窝蛋白直接结 合，并含有 CRAC(cholesterol interaction / recognition amino acid sequence consensus，CRAC) 基序而与胆固 醇相互作用 ．因此，棕榈酰化修饰、小窝蛋白及胆固 醇高亲和基序联合调控 CB1R 在脂筏中的定位 ［47］． 部分 GPCRs 被活化后，呈现在脂筏内外定位及 棕榈酰化修饰代谢率的改变 ．例如，β2 -AR 在激活后 会转运出脂筏，其棕榈酰代谢率也加快［32］． 二者之 间是否直接相关还有待进一步验证［48］． 3. 4 GPCRs 与 G 蛋白的偶联及信号转导 在 GPCRs 家族 A 成员中，跨膜区所形成的第 2、第 3 胞内环与 Gα 的 C 末端发生直接相互作用;C 末端近膜区的 H8 螺旋在 Gα 与受体偶联中发挥辅 助作用 ．部分 GPCRs 的 H8 螺旋 C 末端的棕榈酰化 修饰影响其构象及在细胞膜内侧的锚定，并对受体 与 Gα 的偶联产生显著影响 ．例如 M2 毒蕈碱乙酰胆 碱受体(muscarinic acetylcholine receptor 2，M2R) ，去 棕榈酰化修饰能够降低其对 Gαo 与 Gαi2 的激活， 而对受体的磷酸化水平没有影响［16］． 某些 GPCRs 通过棕榈酰化与磷酸化的相互作用，间接调控受体 与 Gα 的偶联 ． 例如 β2 -AR，将棕榈酰化修饰的 341 位半胱氨酸突变为甘氨酸后，C341G 突变体在异丙 肾上腺素刺激下激活腺苷酸环化酶的能力显著下 降［33］，同时还伴有受体对脒基核苷酸的敏感、对激 动剂高亲和力的下降，说明棕榈酰化修饰对于 β2 - AR 与 Gαs 的结合是必须的［12］． 进一步研究发现， 蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA) 能够显著增加去 棕榈酰突变体的磷酸化水平［49］，造成静息状态下受 体的失敏，从而阻碍受体与 Gα 间的相互作用 ． 但 是，有许多 GPCRs 棕榈酰化修饰对受体与 Gα 偶联 没有影响，比如 D1R． 棕榈酰化修饰能对同一个 GPCRs 所激活的多 重信号通路产生不同影响 ． 例如，A 型内皮素受体 (rndothelin receptor A) 与Gαo，Gαi 和 Gαq 偶联 ． 将 所有棕榈酰化修饰位点(C402、C403 与 C405) 突变 后，受体与 Gαq 和 Gαi 的偶联会下降，但不影响 Gαo 通路;如果将受体C 末端 402 位半胱氨酸之后 的序列删除，受体仅与 Gαi 的偶联下降［15］． 上述结 果说明，A 型内皮素受体与 Gαq 的偶联仅需要 402 位半胱氨酸的棕榈酰化修饰，与 Gαi 的偶联同时需 要 3 个位点的棕榈酰化修饰，而与 Gαo 的偶联与棕 榈酰化修饰无关 ． 同样，棕榈酰化修饰会影响后 V2 叶加压素受体与 β-拘留蛋白(β-arrestin) 及其下游 MAPK 通路的偶联，而不影响受体与 Gαs 的偶 联［50］． 3. 5 GPCRs 失敏与内化 激动剂长时间刺激导致许多 GPCRs 失敏 ． 其失 敏机制通常是由 PKA、G 蛋白受体激酶(G-protein- coupled receptor kinases，GRKs) 与β-arrestin 经 ．激动 剂的刺激引发受体在 PKA 或 GRKs 作用下发生磷 酸化的结果，进一步募集 β-arrestin，从而阻断受体 与 G 蛋白间的相互作用，并促进受体内化 ． 尽管部 分 GPCRs 的棕榈酰化修饰能够直接对 G 蛋白的结 合效率产生影响，但在激动剂作用下，GPCRs 靠提 高棕榈酰代谢率来抑制与 G 蛋白结合的研究仍未 见报道 ． 目前对 GPCRs 失敏的研究证实，棕榈酰化 修饰能影响受体的磷酸化水平，修饰后与 β-arrestin 的相互作用能间接调控 GPCRs 失敏 ． 例如，β2 -AR 在 C341 的棕榈酰化修饰将屏蔽 PKA 磷酸化位点而 延迟 失 敏，而 V1a R ［9］ 或 趋 化 因 子 受 体 CCR5 (chemokine CCR5 receptor，CCR5)［51］的棕榈酰化修 饰，则能够促进受体的磷酸化而促进失敏与内化 ．此 外，V2R ［10］的棕榈酰化修饰，则激活 β-arrestin 通路 促进受体失敏、内化和降解，但对受体的磷酸化水平 没有影响 ． GPCRs 通常发生激动剂诱导的内化和组成性 内化 ．对于前者，内化的受体如 V2R ［50］、促甲状腺素 释放激素受体(thyroid stimulating hormone receptor， HSTR)［52］、CCR5［51］等，GPCRs 的去棕榈酰化修饰 突变体，其激动剂诱导的内化效率显著下降，其机制 与受体的磷酸化、与 β-arrestin 相互作用的调控相 301 中国生物化学与分子生物学报 第 28 卷 关 ． 对于后者，5-HT7(a)R ［24］的近膜区位点(C328 / C329) 棕榈酰化修饰，对受体的组成性激活与内化 有抑制作用 ． 将 C328 /C329 突变后，受体发生组成 型激活，与野生型相比具有高度磷酸化水平，且更易 通过 β-arrestin2 依赖的途径失敏和内化 ． 将远膜区 位点(C386) 突变后，受体则不表现组成性活性． 此 外，β2 -AR 的 341 位的棕榈酰化位点突变后，导致受 体的组成性内化 ． 3. 6 GPCRs 的寡聚化 除了调控 GPCR 单体的正确构象，棕榈酰化修 饰还促进 GPCRs 寡聚体的形成及稳定 ． 通过对 β2 - AR 的晶体结构解析，发现部分单棕榈酰化受体通 过脂质链锚定组合成为超分子复合物［39］． 在相邻单 体的交界面存在 2 个胆固醇分子与棕榈酸侧链相互 作用，用以填充相邻单体间的缝隙 ． 由此推测， GPCRs 的二聚化是这种脂质分子相互作用的结果 ． 虽然此发现不符合体内环境( 在纯化的过程中会加 入胆固醇促进结晶形成) ，然而，棕榈酸与胆固醇在 受体二聚化中的作用仍然值得研究 ． 在小鼠 N1E-115 成神经瘤细胞中表达的荧光 蛋白 1A 血清素受体，通过荧光共振能量转移技术 (fluorescence resonance energy transfer，FRET) 发现， 棕榈酰化修饰会影响受体的寡聚化［53］． 激动剂处理 导致野生型受体中 FRET 信号减弱，但在缺乏棕榈 酰化修饰的受体中则导致 FRET 信号增强 ． 这种 FRET 信号的改变，可能是寡聚体内棕榈酰化受体 与非棕榈酰化受体在空间排布的差别所致 ．此外，由 于棕榈酰化修饰促进了 1A 血清素受体在脂筏的定 位，因此 FRET 信号的增强也可能与脂筏中寡聚体 与脂筏外寡聚体的差别有关［53］． 但上述发现的功能 意义还有待阐明 ． 4 棕榈酰化修饰与其它修饰的关系 4. 1 棕榈酰化与磷酸化 多数 GPCRs 的棕榈酰化修饰能够影响受体的 磷酸化水平，并借此调节受体与 G 蛋白之间的相互 作用、受体的失敏与内化 ． β2 -AR ［54］和 A3 腺苷受体 (adenosine receptor 3)［55］的棕榈酰化修饰，能够屏 蔽激酶对其磷酸化作用的位点，使受体的磷酸化水 平降低;V1aR ［9］和 CCR5［51］的棕榈酰化修饰则相反， 能够促进受体的磷酸化水平 ． 有些棕榈酰化修饰则 对 GPCRs 的磷酸化水平没有影响，例如，M2R ［16］和 V2R ［10］．此外，通过对 B2 缓激肽受体(bradykininB2 receptor)［56］的质谱分析发现，其 C356 的棕榈酰化 与 Y352 的磷酸化之间互相排斥，受体仅在去棕榈 酰化后才能发生磷酸化 ．由此可见，棕榈酰化修饰与 受体在激酶作用下的磷酸化水平之间的关系较复 杂，并因受体类型而有所不同 ． 4. 2 棕榈酰化与泛素化 在细胞表面，棕榈酰化与泛素化相互作用对于 Wnt 信号通路非常重要 ． Wnt 通路中的脂蛋白受体 相关蛋白 6(lipoprotein receptor-related proteins 6， LRP6) 近膜处的半胱氨酸发生棕榈酰化修饰，是 LRP6 离开内质网所必须的 ．由于棕榈酰化修饰引起 LRP6 的跨膜区发生倾斜，从而防止疏水错配和内质 网滞留 ．如果跨膜区缺乏棕榈酰化，将导致 LRP6 以 单泛素化形式滞留在内质网 ． 跨膜蛋白胞质区的单 泛素化会引起跨膜蛋白折叠及组装缺陷，从而不能 形成正确构象 ．某些需要棕榈酰化修饰的蛋白，例如 LRP6，在未发生棕榈酰化修饰之前，会不断的发生 泛素化-去泛素化的循环，直到蛋白形成正确的构 象，最终正常分选离开内质网［57］． 目前，仍未见有关 GPCRs 棕榈酰化与泛素化相 互作用的报道，仅在调节 GPCRs 的分选、失敏、内化 等生理过程中，棕榈酰化与泛素化均发挥了重要作 用，它们之间是否存在对话还需进一步实验证明 ． 4. 3 棕榈酰化与亚硝基化 亚硝基化也是 1 种能影响棕榈酰化动力学的翻 译后 修 饰 ． 通 过 一 氧 化 氮 合 成 酶 (nitric oxide synthetase，NOS) 能够从L-精氨酸产生一氧化氮 (nitric oxide，NO) ，从 而 通 过S-亚 硝 基 化 (S- nitrosylation) 直接修饰半胱氨酸，因此亚硝基修饰是 通过竞争机制调控棕榈酰化修饰水平 ． NO 供体 3- 吗啉-斯德酮亚胺(3-morpholinosydnonimine，SIN-1) 能够抑制 β2 -AR 与棕榈酸结合的水平，使去甲肾上 腺素引起的棕榈酸结合水平增高［58］． 大量研究表 明，NO 是棕榈酰化动态修饰的重要调控因素，目前 需要开发更敏感的技术研究亚硝基化，从而更充分 的认识亚硝基化与棕榈酰化之间的作用 ． NO 自产 生位点向胞内扩散的范围是有限的，因此，棕榈酰化 与亚硝基化之间的相互作用，棕榈酰化蛋白与 NOS 之间的相互作用更具有生理相关性 ． 5 展望 棕榈酰化修饰是 GPCRs 信号复合体中普遍存 在的 1 种翻译后修饰，从受体、Gα，到效应分子的各 个层面均可能发生棕榈酰化修饰 ． 已知 GPCRs 的棕 榈酰化修饰是高度可控的动力学过程，对不同 401 第 2 期 刘 洁等:棕榈酰化修饰对G 蛋白偶联受体功能的调节作用 GPCRs 棕榈酰化修饰酶学机制的研究，将有助于了 解 GPCRs 胞内转运及分选的时空动力学;另一方面， G 蛋白通过棕榈酰化-去棕榈酰化机制在胞内不同亚 单位间发生组成性循环，棕榈酰化修饰在受体与 G 蛋 白的偶联及循环过程中所扮演的角色，将是未来的另 一个研究热点． 此外，棕榈酰化修饰与其它翻译后修 饰的相互作用及对 GPCRs 不同层面功能的调控，其 相关研究还有待进一步深入． 棕榈酰化修饰相关技 术的进步，以及特异的棕榈酰转移酶及硫酯酶抑制剂 的开发，将对推动上述研究发挥关键作用． 参考文献(References) ［1］ el-Husseini Ael D，Bredt D S． Protein palmitoylation:a regulator of neuronal development and function ［J］． Nat Rev Neurosci， 2002，3 (10) :791-802 ［2］ Wan J，Roth AF，Bailey A O，et al． Palmitoylated proteins: purification and identification ［J］． Nat Protoc，2007，2 (7) : 1573-1584 ［3］ Martin B R， Cravatt B F． Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells［J］． Nat Methods，2009，6 (2) :135-138 ［4］ Pin J P， Joly C，Heinemann S F． Domains involved in the specificity of G protein activation in phospholipase C-coupled metabotropic glutamate receptors［J］． EMBO J，1994，13 (2) : 342-348 ［5］ Ponimaskin E G， Heine M， Joubert L， et al． The 5- hydroxytryptamine(4a)receptor is palmitoylated at two different sites，and acylation is critically involved in regulation of receptor 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