菜青虫幼虫肠道细菌的分离及鉴定

�收稿日期 �2008�07�26 �基金项目 �科技部 环境微生物菌种资源整理 ! 整合项目 ∀ ( 2005DKA21201�1�1) �作者简介 �姬小雪 ( 1986�) ,女,从事环境生物学与昆虫资源学研究; 刘玉升,通讯作者, Em ai:l ys@l sdau. edu. cn 文章编号: 1005�376X( 2009) 09�0841�03 �论 # # 著 � 菜青虫幼虫肠道细菌的分离及鉴定 姬小雪 1,刘玉升 2, 周真 3,郑继法 2 ( 1.肥城市农业局农业技术推广中心,山东 肥城 # 271600; 2山东农业大学植物保护学院 环境生物与昆虫资源 研究所,山东 泰安 # 271018; 3.淄博市农业技术推广中心,山东 淄博 # 255033) # # �摘要�# 目的 # 为深入研究菜青虫肠道的营养生理, 分析其取食消化机制,对菜青虫肠道细菌进行了研究。 方法 # 从自然种群的菜青虫肠道环境中按传统分离、纯化、培养, 获得细菌 5个菌株 ,对其菌体形态、染色反应、培 养性状、生理生化反应进行了系统研究。结果 # 鉴定结果 1号菌株为李斯特菌属 ( L is teria ), 2号菌株为皮杆菌属 (Dermabacter), 3号菌株为丙酸杆菌属 (P rop ionibacter ium ), 4号菌株为沙雷菌属 ( Serratia ), 5号菌株为短状杆菌属 (B rachybacter ium )。结论 # 在菜青虫肠道环境中分离出 5个菌株, 鉴定出分类地位。其菌株之间的数量具有明显 差异,以皮杆菌属数量最多 ( 2 ∃ 108 ) ,需进一步研究该菌的功能及其在菜青虫肠道中的作用。 �关键词�# 菜青虫; 肠道细菌;分离鉴定 �中图分类号 �R378 # # # # �文献标识码 �A The isolation and identification of intestinal bacteria ofP ieris rapae JIX iao�xue1, L IU Yu�sheng2, ZHOU Zhen3, ZHENG Ji�fa2 ( 1. AgriculturalT echnology Ex tension Cen ter of Feicheng City, Feicheng 271600, China; 2. Institute of Env ironm ental B iolo� gy and InsectR esources, Co llege of P lantP rotection, Shandong Agriculture Univer sity, Taian 271018, Ch ina; 3. Agricultural T echno logy Ex tension C enter of Z ibo City, Z ibo 255033, China) �Abstract�# Objective# To intensively study the nutr itional phy sidogy o fP ien%s larvae gut and ana lyze its d igestion m echanism.M ethod# F ive bacte ria stra ins w ere iso lated from the intestine o fP ieris larvae by trad itiona lm ethods of separa� tion, pur ification and cultivation. The irm orpho logy, staining reac tions, cu lture tra its, physio log ica l and b iochem ica l reac� tions w ere stud ied system atica lly. R esu lt# The five stra ins we re identified asL ister ia, D erm abacter, P rop ionibacter ium , Serra� tia, and B rachybacterium respec tive ly. Conclusion # S ign ificant differences among the coun ts o f the 5 stra ins were ob� served. Dermabacter w as the predom inant species ( 2 ∃ 108 ), the function o fw hich in the intestina l tract o fP ieris rapae nee� ded to be stud ied furthe r. �Keyw ords� # P ier is rapae; Intestina l bacter ia; iso lation and iden tification # # 菜青虫的寄主植物已知有 7科 35种, 有十字花 科、菊科、苋科等,但偏嗜十字花科植物。菜青虫仅以 幼虫为害,苗期受害严重时可导致整株死亡。被害的 伤口, 易诱发软腐病, 降低了蔬菜产量和质量。昆虫 进化历史悠久、分布环境广、食性杂, 其中昆虫与其共 生物的关系十分复杂 [ 1]。对于虫菌之间关系的研 究,以往多集中于昆虫病原微生物及其应用的研究, 而以微生态学理论为指导探讨昆虫营养生理而开展 的昆虫肠道环境微生物的研究较少。近些年来,对一 些重要昆虫的肠道研究日渐活跃。国内外研究的种 类有家蚕 [ 2~ 6]、桑粒肩天牛 [ 7]、日本龟蜡蚧 [ 8]、黄粉 虫与黑粉虫 [ 9]、东亚飞蝗 [ 1]等。本研究通过对菜青 虫胃肠微生物群落取样、生理生化测定和鉴定, 目的 是了解菜青虫肠道中寄居的微生物种类和作用及肠 道菌群的组成对机体的消化、吸收的影响, 为研究菜 青虫的生命活动打下基础。 1# 与方法 1. 1# 材料 # 虫源: 试虫从山东农业大学校园甘蓝上 采集。培养基: NA和 NB培养基及各种生理生化培 养基。 1. 2# 实验方法 1. 2. 1# 肠道微生物的分离 # 选取健康的菜青虫活体 10只, 分别放入 75%酒精溶液中浸泡 10 s杀死, 在 无菌操作下取出虫体并放在 0. 1% 升汞液中消毒 2 m in, 移入灭菌水中清洗, 然后在蜡盘中进行无菌解 剖,取出肠道,称取 1 g研磨,加无菌水 10 m ,l制成研 磨液,稀释至 10- 1 ~ 10- 8。取 1 ∃ 10- 6、1 ∃ 10- 7、1 ∃ 10 - 8 3个稀释度、各吸取 0. 2 m ,l用涂抹法进行分离, 重复 3次,分别置于 30 & 的 GXZ型智能光照培养箱 和 YQX型厌氧培养箱中培养 72 h, 挑取表征各异的 菌落在 NA平板上划线、纯化, 培养。将纯化后菌落 分别在移植斜面培养, 并按出现数量依次编号。 1. 2. 2# 菜青虫肠道细菌的鉴定 # 菜青虫肠道稀释液 经分离纯化出 5个细菌菌株。将分离的 5个菌株进 行菌体形态、染色反应、培养性状和生理生化测定。 841中国微生态学杂志 # 2009年 9月第 21卷第 9期 根据 伯杰氏细菌鉴定手册 ∀第 8版和 ∋一般常见细 菌系统鉴定手册 (等文献进行鉴定 [ 10~ 13]。 2# 结果 2. 1# 菌体形态和培养性状 # 供试菌株在 NA培养基 上培养 24 h,按照革兰染色法和 3%新 KOH简易法, 4个细菌菌株, 呈革兰阳性反应, 4号菌株呈革兰阴性 反应。经观察, 5个菌株均为杆状菌, 并均无鞭毛, 无 芽胞。将分离纯化的供试菌株在 NA和 NB培养基 上, 28 & 培养 48 h后观察记载, 5个菌株在 2种培养 基上各呈不同的表现 (见表 1)。 2. 2# 供试细菌菌株生理性状 # 供试细菌菌株在不同 温度 ( & )、不同氢离子浓度 ( pH )和不同 N aC l浓度 条件下, 接种培养不同时间, 观察检查记载结果 (表 2)。从表 2可知,供试菌株在不同温度、不同 pH 和不同 N aC l浓度下培养, 1、2、3、4号菌株在 30~ 37 & 条件下, 5号在 37 & 条件下生长良好; 1~ 5号菌在 高于 55 & 时无法生长, 4、5号菌在低于 10 & 时无法 生长; 1、2、4号菌株在 pH为 7时生长良好, 1 ~ 5号 菌株在 pH为 2时不生长, 1、2、4、5号菌株在 pH为 11时不生长; 1、2、3、4号菌株在 NaC l 7%的条件下生 长良好, 1、3、4、5号菌株在 N aC l为 10%的条件下不 生长 (见表 2)。 表 1# 菜青虫肠道细菌形态特征及培养性状 菌株 菌体形态 鞭毛 芽胞 革兰染色 需氧情况 培养性状 # # # # # # # # 1 杆状 无 无 G+ 兼性厌氧 菌落圆形,边缘整齐,稍突起,表面光滑,半透明,灰白色。沉淀,浑浊。 2 杆状 无 无 G+ 兼性厌氧 菌落圆形,较小,边缘不规则,稍突起,表面光滑,不透明,白色。沉淀,浑浊。 3 杆状 无 无 G+ 兼性厌氧 菌落圆形,边缘不规则,稍突起,表面光滑,不透明,乳白色。菌膜,沉淀,浑浊。 4 杆状 无 无 G- 兼性厌氧 菌落圆形,边缘缺刻,稍突起,表面褶皱,不透明,白色。菌膜,沉淀,浑浊。 5 杆状 无 无 G+ 好氧 # # 菌落圆形,边缘不规则,扩散,表面褶皱,不透明,乳白色。沉淀,浑浊。 # # 注: ∋ + (表示实验阳性; ∋ - (表示实验阴性 表 2# 菜青虫肠道细菌生理性状 菌株 温度 ( & ) 10 20 30 37 42 55 pH 2 5 7 9 11 NaC l含量 (% ) 2 5 7 10 1 + # + + + + + + + - # - # + + # # + + + # + # - # + # + + # + + # - 2 + + + + + + + - # - # + + # # + + + # + # - # + # + + # + + # + 3 + + + + + + + - # - # + + # + # # - # - # + # + + # # + + + # - 4 - + + + + + + - # - # + # # + + # + # - # + # + # # + + # - 5 - + + # + + + - # - # + + # + + # + # - # # + + # + + # + # # - # # 注: ∋ + (表示实验阳性; ∋ - (表示实验阴性 2. 3# 供试菌株生化性状 # 对供试 5个菌株生化性状 测定,其实验结果见表 3。从表 3结果可知, 供试 5个 菌株都产生过氧化氢酶、H2 S, 都能使明胶液化、七叶 灵水解。不产生苯丙氨酸脱氨酶、脲酶、精氨酸双水 解酶, 吲哚、V. P试验都呈阴性, 都能利用葡萄糖、蔗 糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、果糖、肌醇、甘露醇, 不 能利用乳糖。其他生化测定项目各异 (见表 3)。 2. 4# 细菌菌株鉴定及其存在数量状况 # 经对应检查 菌体形态、染色反应、培养性状、生理生化反应等各项 指标鉴定,结果见表 4。由表可知 5个细菌菌株分别 属于李斯特菌属、皮杆菌属、丙酸杆菌属、沙雷菌属、 短状杆菌属。表 4可见,菜青虫肠道细菌各菌株存在 的数量差别很大。 3# 讨论 昆虫纲种类多、食性杂、生存环境多变、进化历史 悠久 [ 17] , 昆虫与共生物之间建立了复杂的协同进化 关系, 不同类型均有代表性种类并行使不同的功 能 [ 1]。早于 1850年,人们就已发现有些昆虫的内部 器官含有共生的微生物,它们一般位于某些特殊的细 胞内,尤其以消化道和脂肪体内最为常见。沃尔巴克 菌 (Wolbachia )最早在库蚊 ( Culex p ip iens)的卵巢中发 现 [ 4 ] ,为细胞内共生菌; 类酵母共生菌是稻飞虱体内 脂肪体细胞中的共生菌 [ 15] ; 冰核细菌广泛存在于自 然界,能够提高棉铃虫、天牛、谷螟等越冬昆虫的过冷 却点 [ 16, 17]。通过选择不同生存环境与食性的的昆虫 种类加以系统比较研究,分析土壤昆虫、杂食性昆虫、 植食性、捕食性昆虫种类的肠道微生物区系的动态变 化,进一步定向分析主要细菌菌株的功能, 并与食物 的营养成分进行关联性分析 [ 18, 19]。 本实验分离鉴定了菜青虫消化道内 5种细菌,分 别属李斯特菌属、皮杆菌属、丙酸杆菌属、沙雷菌属、 短状杆菌属, 明显与菜青虫特性特别是消化道对食物 消化利用的特性有关。昆虫肠道微生物的研究,不但 有利于昆虫资源的开发利用,而且有利于从昆虫肠道 这一特殊环境中获得特殊功能的细菌资源。同时,可 以通过检测肠道微生物区系的变化测定一些特殊影 响因素的作用,并在重要经济昆虫的生产中研制、应 用微生态制剂。 842 Chinese Journa l o fM icroecology, Sep�2009, Vo l�21N o�9 表 3# 菜青虫肠道细菌生化测定结果 项目 # # # 1 2 3 4 5 CK 过氧化氢酶 # # + + + + + - 苯丙氨酸脱氨酶 - - - - - - 脲酶 # # # # # - - - - - - 鸟氨酸脱羧酶 # + + + + - - 赖氨酸脱羧酶 # + + - - - - 精氨酸双水解酶 - - - - - - 硝酸盐还原 # # - - - - + - H 2 S产生 # # # + + + + + - 吲哚产生 # # # - - - - - - 甲基红试验 # # - - + - + - V. P试验 # # # - - - - - - 明胶液化 # # # + + + + + - 葡萄糖 # # # # + + + + + - 蔗糖 # # # # # + + + + + - 麦芽糖 # # # # + + + + + - 乳糖 # # # # # - - - - - - 纤维二糖 # # # + + + + + - 木糖 # # # # # - + + + + - 半乳糖 # # # # + - + + + - 鼠李糖 # # # # - - - + + - 海藻糖 # # # # + + + + + - 阿拉伯糖 # # # - + - - + - 棉籽糖 # # # # + + + - + - 果糖 # # # # # + + + + + - 甜醇 # # # # # + - - - - - 肌醇 # # # # # + + + + + - 甘露醇 # # # # + + + + + - 山梨醇 # # # # + + + + - - 七叶灵水解 # # + + + + + - 淀粉水解 # # # + + + - + - 丙二酸钠 # # # - - - - + - 柠檬酸钠 # # # + + - + - - 表 4# 菜青虫肠道细菌鉴定结果及存在的数量 菌株 鉴定结果 # # # 数量 1 # # 李斯特菌属 ( L isteria ) 4∃ 107 2 # # 皮杆菌属 (D erm abacter) 2∃ 108 3 # # 丙酸杆菌属 ( Propion iba cterium ) 1∃ 108 4 # # 沙雷菌属 (S erra tia ) 5∃ 107 5 # # 短状杆菌属 (B ra chybacterium ) 4∃ 107 # # 肠道微生物对宿主昆虫有两方面的作用: 一是它 们帮助消化食物,为昆虫提供各种营养物质; 二是它 们起着益生素的作用,调控胃肠道微生物区系本身之 间的平衡,保证昆虫的健康。益生菌能够从肠道微生 态角度提高乳酸菌、双歧杆菌等有益菌的含量, 维持 肠道正常的有益菌数量, 抑制病原菌,这对昆虫机体 具有防治消化道疾病和促进生长的双重作用。由于 对昆虫肠道菌群的研究中每种方法都有一定的选择 性和局限性, 得到纯培养的物种并不一定是肠道环境 中的真正的优势类群, 它们或许只占环境中细菌总数 的一小部分。对菜青虫肠道菌群的后续研究可以在 以下几方面展开: ( 1) 对菜青虫不同龄期肠道细菌有 何异同有待于进一步研究。 ( 2) 对共生菌群进一步 的分离和鉴定,以完全确定菜青虫体内的菌群组成。 �参考文献� [ 1 ]刘玉升,李明立,刘俊展, 等.东亚飞蝗肠道细菌的研究 [ J] . 中国 微生态学杂志, 2007, 19( 1) : 34�39. 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