_葡萄糖苷酶的研究进展

2009.10 乳品加工Dairy Industry β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase， EC 3.2.1.21）属于纤维素酶类，是能催 化水解芳香基或烃基与糖基原子团之间 的糖苷键生成葡萄糖的酶，其来源不同 底物特异性也不同。 1 β-葡萄糖苷酶的分类 根据氨基酸序列分类，人们将β- 葡萄糖苷酶划分在糖苷水解酶家族1和3 中。家族1中的β-葡萄糖苷酶来源于细 菌、植物；家族3中的酶来自真菌、细菌 和植物。家族1中的酶除有葡萄糖苷酶活 性外，还有很强的半乳糖苷酶活性[1]。 根据高级结构的相似性，糖苷酶 家族可以被分成若干部族（Clan）， 糖苷水解酶家族1属于“clan GH-A” （superfamily 4/7）。其特点是催化 结构域具有（β/α）桶状结构，2个 羧基氨基酸参与催化反应，作为质子 供体和亲核基团，分别位于第4位和第 7位的β折叠上[2]。Moracci 等通过比 较11种糖苷族1的氨基酸序列，发现 了-N-E-P-和-Y-I-E-N- 2个保守序 列，并用定点突变的方法证明了保守序 列中的2个Glu分别是酸键集团和亲核集 团。也有试验通过自杀底物共价修饰和 定点突变试验证明了这种结论[3]。 2 β-葡萄糖苷酶的理化性质 β-葡萄糖苷酶有胞内酶和胞外 酶之分，有些生物体内只含有胞内β- 葡萄糖苷酶，也有的只含胞外β-葡萄 糖苷酶，但是有少部分微生物体内同 时含有胞内和胞外β-葡萄糖苷酶。 β-葡萄糖苷酶的相对分子量一般在 40~250KD之间。不同来源的β-葡萄 糖苷酶的相对分子量由于其结构和组 成不同而差异很大。大部分β-葡萄糖 苷酶的最适pH值都在酸性范围，并且 变化不大，但最适pH值可以超过7.0， 而且酸碱耐受性强。β-葡萄糖苷酶 的最适温度在30~110℃之间，一般来 说，来自细菌的β-葡萄糖苷酶其稳定 性和最适温度要高于普通微生物来源 的β-葡萄糖苷酶。对于工业应用来 说，酶的热稳定性越高越有利，对来 自嗜热性和非嗜热性β-葡萄糖苷酶的 认为，两者在相互演化过程中的 酶修饰作用并不改变酶的活性中心， 也不改变其专一性，只是将酶蛋白结 构作部分调整以适应高温环境[4]。 3 产β-葡萄糖苷酶的生物类群 分布 目前已经发现的产β-葡萄糖苷 酶 的 生 物 类 群 包 括 原 核 生 物 、 真 核 生物。β-葡萄糖苷酶普遍存在于植 物 、 微 生 物 和 哺 乳 动 物 的 肠 道 中 。 植物中很多来源的β-葡萄糖苷酶已 被 纯 化 和 研 究 ， 这 些 来 源 有 植 物 的 种 子 、 果 实 、 叶 苗 、 根 和 花 。 微 生 物有约氏黄杆菌（Flavobacter ium j o h n s o n a e ） 、 多 粘 性 芽 孢 杆 菌 （Bacillus polymyxa ）、肠膜明串珠 菌（Leuconostoc mesenteroides）、 链 霉 菌 （S t r e p t o m y c e s ） 、 镰 刀 菌 （F u s a r i u m o x y s p o r n u m ） 、 假丝酵母菌（Candida peltata ）、 出 芽 短 梗 霉 （ A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ） 、 汉 逊 德 巴 利 酵 母 （Debaryomyces hanseni i ）、木 霉（Trichoderma koningii ）、青霉 （Penincillium aurantiogriseum ）、 黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉 （Aspergillus oryzae ）、干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei）等。现在对真 菌中β-葡萄糖苷酶产生菌研究较多的 是丝状真菌，主要为曲霉属和木霉属， 而细菌中研究较多的是芽孢杆菌属。 β-葡萄糖苷酶的研究进展 ■ 孟宪文 宋小红 陈历俊 刘长江 北京三元食品股份有限公司 【摘要】本文综述了β-葡萄糖苷酶的分类、分布、理化性质及其水解糖苷机制，以及国内外对β- 葡萄糖苷酶分子生物学的研究情况。 关键词：β-葡萄糖苷酶；理化性质；功能 42 2009.10 D a i r y I n d u s t r y □ 乳品加工▲▲ 4 β-葡萄糖苷酶的结构与功能 通过X射线晶体衍生法分析出的β- 葡萄糖苷酶三维空间结构如图1所示。 糖苷水解酶家族1的典型结构具有 8个（α/β）结构围成的桶状结构，也 被称为4/7超家族。糖苷水解酶家族3 由A区和B区2个域构成，B区包括SDW 序列，内有活性位点Asp残基。在分子 水平上，水解酶家族3的编码基因由5 个典型的区域构成，N端区、N端催化 区、非同源区、C端未知功能区、C端 残基。 经研究认为，β-葡萄糖苷酶的 催化机制是保留型的酸催化双置换机 制（double displacement mechanism ）。催化反应需要2个重要氨基酸残基 ：质子供体（Proton donor）和亲核集 团（Nucleophile）。带羧基侧链的氨 基酸位于糖苷键的氧原子的氢键距离 内。水解反应的基本过程是：①酶的 亲核集团在第2个羧基侧链提供酸/碱 催化（提供1个质子）的帮助下，去攻 击底物的糖苷键氧原子，并与其连接 形成酶—底物的过渡态；②酸/碱集团 催化1个水分子攻击酶—底物过渡态， 与之反应以切断糖苷键释放1个β单糖 产物和酶。目前对酶催化糖苷键水解 机理的了解还不是很清楚，普遍认为 酶有2个催化活性中心，一个是亲核中 心，另一个为酸碱催化中心。在糖基 化作用下，酶的亲核中心攻击底物异 头碳原子，形成α构像的糖基酶共价 中间体，然后由水介导酶底物中间体 水解（酶的另一活性中心供给-H+，糖 苷键水解）。β糖基产物形成，酶回 复到其初始的质子状态。通过动力学 标记、序列分析、对特殊的氨基酸进 行化学修饰、点突变等方法来研究酶 的催化底物水解的分子机制，对于酶 的活性中心的一些氨基酸残基的特殊 作用已取得了进展。酸性氨基酸带有 -COOH基团，在β-葡萄糖苷酶的催 化过程中起着重要的作用，酶的亲核 催 化 中 心 和 酸 碱 催 化 中 心 都 含 有 酸 性 氨基酸Asp和Glu。 家族1中的β-葡萄 糖苷酶属于4/7超家 族 成 员 ， 在 其 β 折 叠结构中的C端的第 4位和第7位都是Glu 残基。在家族3的成 员 中 ， 则 发 现 A s p 为保守氨基酸[6，7]。 β - 葡 萄 糖 苷 酶 近 年 来 被 应 用 于 合 成 生 物 寡 糖 以 代 替 化 学 合 成 法 ， 目 前 普 遍认为存在2种反应 类 型 ： 水 解 反 应 的 逆 反 应 和 转 糖 苷 反 应。关于水解反应机制和转糖苷键反 应机制如图2所示。 5 β-葡萄糖苷酶的分子生物学 研究 β-葡萄糖苷酶基因方面的研究 已经有较长的历史，到目前为止，已 经有上百个微生物的β-葡萄糖苷酶基 因得到克隆。早期的β-葡萄糖苷酶 基因的克隆是通过构建DNA文库进行 活性筛选的方式获得的。随着基因工 程技术的发展，PCR技术的应用，利 用种属相似性扩增克隆得到许多β-葡 萄糖苷酶。到目前为止，乳酸菌属（ lactobacillus）就有11种之多。随着基 因工程学的发展，越来越多的微生物 基因组全序列被测定。利用同源序列 筛查定位分析出可能的β-葡萄糖苷酶 ，是获得β-葡萄糖苷酶新基因的有效 手段。 近年来，β-葡萄糖苷酶的高效表 达普遍采用大肠杆菌（Escherichia coli ）和芽孢杆菌（Bacillus）表达系统。 重组表达的酶活量可达野生株的几十 倍乃至上百倍[8]。 6 国内外研究现状 β-葡萄糖苷酶作为纤维素酶的一 个重要组成部分，在医疗、食品、生物 质转化中有重要的应用价值，特别是随 着近年来环境能源等危机的加重，木质 纤维素作为自然界最广泛的碳源受到各 国政府的高度重视。β-葡萄糖苷键的 水解是纤维素彻底降解为单糖的一个瓶 颈。采用基因工程与蛋白质工程手段获 得优良的β-葡萄糖苷酶已经成为研究 热点。国外许多研究机构正致力于β- 葡萄糖苷酶的分子生物学研究，从基础 领域研究酶的催化机制及表达调控机制 ，以期更好地改善纤维素酶的催化效 率。随着表达系统的发展与完善，β- 葡萄糖苷酶已经在大肠杆菌和酵母菌中 得到高效表达。近年来在芽孢杆菌、丝 状真菌以及植物中都有β-葡萄糖苷酶 重组表达的报道。 国内近年来研究β-葡萄糖苷酶已 经成为热点，已由过去的研究β-葡萄 糖苷酶的简单提取到现在的酶的培养条 件优化以及粗酶液的纯化。β-葡萄糖 苷酶基因的克隆表达已经得到实现，新 构建的工程菌已经应用到生产实践中。 图1 β-葡萄糖苷酶分子结构 图2 水解反应机制和转糖苷键反应机制图 43 2009.10 乳品加工Dairy Industry 近年来，我国大型乳品企业的加 工能力、生产规模和乳制品产量都增 长得很快，但是乳制品的品种和企业 的经济效益增长得相对较慢，特别是 有一定科技含量的功能乳制品还比较 少，具有中国特色的功能乳制品就更 少。为此，在加强乳制品营养与功能 等基础理论研究的基础上，应大力查 找和挖掘我国传统的并具有中国特色 的药食兼用资源。莲子就是在这种情 况下被笔者首先应用于新型乳制品的 研发当中的。 1 莲子的属性、特征、化学成 分和药理作用 莲子为睡莲科植物莲的干燥成熟 种子，它属于药食兼用型的中国特有 资源。主要产自长江以南的各省，尤 其以湖南湘潭产的白莲为最佳。据史 具有多种生物功能的 膨化莲子乳制品市场分析 ■ 孔庆伟 赵泽民 郦韬珉 徐亚麦 黑龙江龙丹乳业科技股份有限公司 【摘要】本文从药食同源的角度介绍了莲子的属性、生命特征、化学成分、药理作用、开发利用前 景以及部分莲子乳制品的主要功能。特别详细介绍了以莲子为主要配料的低血糖生成指数营养粉的 主要营养与功能指标。 关键词：莲子；乳制品；营养与功能 7 β-葡萄糖苷酶的应用及前景 展望 β-葡萄糖苷酶除作用β-（1， 4）键外，还能作用β-（1，1）、 β-（1，2）、β-（1，3）和β- （1，6）键，具有转移葡萄糖基的作 用。在水果、蔬菜中除了游离的挥发 性风味物质外，还有大量的以β-葡萄 糖苷形式存在的非挥发性风味前体物 质，β-葡萄糖苷酶能够释放这种香气 的前体物质，因此，开发了将β-葡萄 糖苷酶作为水果风味增香酶的应用领 域。目前，国内对黑曲霉中β-葡萄糖 苷酶研究较多，但由于采用黑曲霉作 为产酶菌株存在食品安全卫生方面的 隐患，所以在食品加工中的应用受到 限制。目前有研究选用德氏乳杆菌亚 种进行β-葡萄糖苷酶的分离和纯化， 并应用于大豆异黄酮的水解过程中， 制备大豆异黄酮苷元。通过该菌株生 产的β-葡萄糖苷酶具有高安全性的特 点，为β-葡萄糖苷酶的应用和开发提 供更广阔的空间。■ 参考文献 [1] Henrissat B.A classification of glycosyl- hydrolases basedon amino acid sequence similarities.Biochem，1991（293）：781~788 [2] Jenkins J，Leggio L L，Haris G，et al.β- glucosidase，β-galactosidase，family A cellulases，family F xylanases and two barley glycanases from a superfamily of enzymes with a 8-fold α/βarchitecture and with two conserved glutamates near the carboxy- terminail ends of β-strands four and seven. 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