血管组织工程内皮细胞分离培养新方法

第 27 卷　第5 期 2011年 9月 福建师范大学学报 (自然科学版) Journal of Fujian Normal Univer sity ( Nat ur al Science Edition) Vol. 27　No . 5 Sept . 2011 文章编号: 1000-5277( 2011) 05-0091-05 血管组织工程内皮细胞分离培养新 向　萍, 李　敏, 张超颖 (福建师范大学生命科学学院, 福建 福州　350108) 　　摘要: 建立一种简单高效的血管组织工程内皮细胞分离培养方法. 无菌分离大鼠主动脉, 剪成约5 mm× 2 mm 的组织块, 内膜朝下平铺于含Ⅰ型胶原酶的细胞培养皿中消化30 min, 收集内皮细胞; 其后, 取出组 织块继续内膜朝下置于另一培养皿中贴壁培养, 直至细胞爬出并融合成单层. 观察细胞形态, 并分别对两种 方式获得的传至第5代的细胞进行Ⅷ因子免疫组化鉴定. 酶消化获得的细胞数目约为4. 8×103个, 组织块继 续贴壁培养 5 d 后细胞数目可达5×105mL - 1. 细胞多呈三角形或多角形 , 融合后以 “铺路石”状排列. 两种 方式所获得的细胞均现出内皮细胞特征, 纯度达100% . 酶消化结合组织贴块法为血管组织工程提供了获 取大量高纯度内皮细胞的新方法. 关键词: 大鼠主动脉; 内皮细胞; 酶消化法; 组织贴块法; 血管组织工程 中图分类号: R318　　　文献标识码: A 　收稿日期: 2010-11-01 　基金项目: 福建省科技厅重点资助项目 ( 2010Y0020) 　通讯作者: 李敏 ( 1955- 　) , 博士, 教授, 博士生导师, 研究方向: 生物技术及生物医用材料. ml i@ fjn u. edu . cn A Novel Method of Isolating Endothelial Cells for Vascular Tissue Engineering XING Ping, LI Min, ZHANG Chao-ying ( Colleg e of L if e Sciences, Fuj ian N ormal Univ ersity , Fuzhou 350108, China) Abstract: To establish a simple and highly eff icient method o f iso lating r at aorta endothelial cel ls for vascular t issue engineering. The f resh ao rta w as cut into 5 mm×2 mm lumps under ster ile condit ions and dig ested by collag enase typeⅠfor 30 m in with it s lum inal surface down flat in petr i dishes. T hereafter, the lumps w er e st ill placed luminal side down onto the other cultur e plate w ith medium unt il cells migr at ion and confluence. Inverted micr oscope w as used to observe the mor pholog ic characterist ics of endothel ial cells. Both of the passage 5 cells in above w ays w ere ident ified by immunoreact ivity w ith factor Ⅷ ant ig en. The aver age amounts o f the endothelial cell s isolated by collagenase typeⅠwere 4. 8×103. Af ter 5 day s' culture of the lumps, cells migrat ion can reach 5×105mL - 1 . T he cells w ere shaped as t riang le or polyg onal and show ed cobblestone appearance af ter the fusion. T he purity of passaged endothelial cells w ere both reached up to 100% . This novel method combined enzyme dig est ion w ith tissue at tached method w as more feasible for isolat ing high purity rat aorta endothel ial cells for vascular t issue eng ineering . Key words : rat aorta; endothelial cells; collag enase dig est ion; tissue attached method; vascular t issue engineering 心血管疾病是导致人类死亡的主要原因之一[ 1] , 外科替换或旁路移植手术是治疗冠状动脉或外周 动脉粥样硬化疾病的主要手段. 血管组织工程给心血管疾病患者带来了希望, 但血管组织工程支架由 于缺乏与天然血管相同的内皮细胞血管内层, 易导致血栓形成、内膜增生、阻塞等现象[ 2] . 血管内皮细 胞衬于血管内表面, 对保持血管内表面光滑、血管长期通畅、防止血栓形成、维持血管张力等方面起 着重要作用 [ 3] . 血管组织工程支架内皮化后能减少血小板聚集、白细胞粘附, 提高长期通畅率, 从而解 决此类问题 [ 4- 6] . 因此, 作为重要的种子细胞之一, 获取大量高纯度的血管内皮细胞成为限制血管组织 工程发展的重要因素之一. 大鼠主动脉是血管组织工程内皮细胞的主要来源. 目前对大鼠主动脉内皮 细胞分离培养的方法是用贴块法 [ 7- 8]或酶消化法 [ 9- 10] , 贴块法培养细胞迁出相对较慢, 酶消化法分离的 细胞数量相对较少[ 11] . 本文将酶消化法与贴块法相结合, 大鼠主动脉经酶消化后继续贴壁培养, 从而 实现了简便而又快速、高效的血管组织工程内皮细胞分离培养. 1　材料与方法 1. 1　材料 1. 1. 1　实验动物 Sprague-Daw ley ( SD) 大鼠, 清洁级, 雄性, 220～250 g , 福建医科大学实验动物中心提供. 1. 1. 2　试剂 DMEM 细胞培养基 ( Dulbecco's M odif icat ion of Eagle's M edium Dulbecco , 美国Gibco 公司) , 胎 牛血清 ( Fetal Bovine Serum , FBS, 杭州四季青生物工程材料有限公司) , 兔超敏二步法免疫组化检测 试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司) , DAB 显色试剂盒 (北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司) , 一抗兔抗鼠Ⅷ因子抗体 (北京博奥森生物技术有限公司) , 荧光素异硫氰酸酯( FIT C)标记山羊抗兔IgG ( H+ L) (美国Jacksonimmuno Research Laboratories公司) ,Ⅰ型胶原酶(美国Sigma 公司) , 胰蛋白酶 (美国Gibco 公司) ,乙二胺四乙酸( EDT A, 美国Sigma 公司) ,聚乙二醇辛基苯基醚( T riton X-100,美国 Genview 公司) , Penicillin-Streptomycin Solut ion (美国HyClone 公司) , 3-( 4, 5-Dimethylthiazol-2-y l) - 2, 5-dipheny ltet r-azo li-umbrom ide( M TT ,美国Sigma 公司) . 1. 1. 3　仪器 超净工作台 (苏净集团安泰公司) , HFsafe-1200生物安全柜 (力康发展有限公司) , CKX41相差 显微镜 (日本Olympus 公司) , BX51荧光显微镜 (日本Olympus 公司) , HF90二氧化碳培养箱 (上海 力申科学仪器公司) , ELx 800 型酶标仪 (美国Bio-tek 公司) . 1. 2　方法 1. 2. 1　大鼠主动脉的分离与处理 SD大鼠1只, 用10 mg·mL - 1水合氯醛按5 mL·kg - 1的剂量腹腔注射麻醉, 行胸、腹联合切口, 迅速打开胸腔, 分离大鼠主动脉, 放入0. 1 mol·L - 1的无菌PBS ( pH 7. 2) 中. 1. 2. 2　内皮细胞原代培养 无菌状态下剥除主动脉外膜的脂肪与纤维组织, 无菌PBS冲净内腔, 纵向剪开血管, 并将其剪成 约5 mm×2 mm 小块. 将组织块内膜面朝下置于含有1 mLⅠ型胶原酶液 ( 1 mg·mL - 1, 无血清DMEM 培养液配制) 的细胞培养皿中, 37 ℃, 体积分数5% CO2条件下消化30 min, 收集消化下来的细胞并 计数后移入细胞培养瓶中培养. 消化后的组织块仍然内膜朝下, 置于DMEM 培养液 (含体积分数20% FBS ) 中继续贴壁培养, 细胞爬出并融合成单层时, 用质量浓度 1. 25 mg·mL - 1胰蛋白酶- 0. 01% EDT A ( T E) 消化, 收集, 计数后置于培养瓶中培养. 培养液每3 d更换1次. 1. 2. 3　内皮细胞传代培养及纯化 细胞融合至90%时, 无菌PBS 洗涤2次, T E消化1 min 后, 倒置显微镜观察, 当细胞收缩变圆, 大部分开始脱落时加入DMEM 培养液 (含体积分数20% FBS) 终止消化. 对酶消化后获得的细胞以及 消化后血管块继续贴壁获得的细胞分别进行传代培养. 传代过程中反复利用差速贴壁法[ 12] , 达到纯化 内皮细胞的目的. 1. 2. 4　细胞形态观察 相差显微镜进行细胞的形态学观察. 92 福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 　　　　　　　　　　　2011 年　 1. 2. 5　细胞免疫组织化学鉴定内皮细胞 取第5代细胞进行T E消化, 制备密度为4×105mL - 1的细胞悬液, 预先将处理过的无菌盖玻片置 于六孔板中, 盖玻片上接种300 �L 细胞悬液, 细胞培养箱中培养24 h 后每孔加入1 mL DMEM 培养液 (含体积分数20% FBS) , 继续培养. 当盖玻片上细胞达到70%融合时, 冰上预冷, 弃培养液, 4 ℃ PBS 洗涤3次, 自然干燥, 当细胞面微潮时, 加入4℃预冷的40 mg·mL - 1多聚甲醛固定液, 4℃固定30 min. 盖玻片取出后, 4 ℃ PBS 冲洗3次, 加入体积分数0. 1%T riton X-100溶液, 4 ℃冰箱中10 min, 4 ℃ PBS 洗涤 3次. 分别将酶液消化下来的传代至第5代的细胞进行Ⅷ因子免疫细胞化学染色 ( DAB 显 色) , 对消化后组织贴壁获得的并传至第5代的细胞进行Ⅷ因子抗原的免疫荧光染色. 400倍镜下随机 选5个视野计算细胞阳性表达率 (细胞阳性表达率= 阳性细胞数/细胞总数) . ( 1)酶法消化内皮细胞的免疫细胞化学染色( DAB显色) . 按照兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒、 DAB 显色试剂盒说明进行, 苏木精复染细胞核. 对照组则以PBS 代替一抗. ( 2) 组织贴壁细胞Ⅷ因子抗原FITC 标记山羊抗兔IgG ( H+ L) 免疫荧光染色. 将爬片加入体积分 数3% H2O2 去离子水溶液孵育 10 min, 以阻断内源性过氧化物酶. PBS 冲洗 3次, 实验组添加一抗 (兔抗鼠Ⅷ因子, 体积稀释比为1∶100) 50 �L, 对照组加入50 �L PBS. 37℃恒温箱中孵育2 h, PBS 冲洗3次; 避光加入FITC 标记山羊抗兔 IgG ( H+ L) 二抗 (体积稀释比为1∶50) 50 �L, 37 ℃恒温 箱中避光孵育30 m in. PBS 冲洗3次, 荧光显微镜观察、拍照. 1. 2. 6　MT T 比色法测定内皮细胞生长曲线 第5代细胞, 制备密度为104mL - 1的细胞悬液, 接种于96孔板中, 每孔100 �L ( 1 000个·孔- 1 ) , M TT 比色法测定 ( n = 6) . 步骤: 每孔加入MT T 20 �L, 继续培养4 h, 小心吸出孔内培养液, 每孔 加入150 �L 二甲亚砜 ( DMSO ) . 振荡10 min, 以每孔 100 �L 转入另一 96孔板中, 酶标仪检测 各孔 OD 490nm吸光值, 记录结果, 以平均值±差表示, 以吸光值为纵坐标, 时间为横坐标绘 制细胞生长曲线. 2　结果 2. 1　原代培养细胞 A : 酶消化细胞培养 5 d ( 100×) ; B: 酶消化后组织块贴壁继续培养 5 d ( 200×) 图 1　原代培养获取血管内皮细胞 分离的血管组织块内膜面朝下酶 消化30 min 后, 倒置相差显微镜下可见 有透亮、圆形, 单个或成团的细胞被消 化下来, 细胞计数约为4. 8×103个. 培 养24 h后, 细胞开始贴壁, 5 d后达到 60% 融合 (如图1-A) , 7 d融合成单层. 酶消化后的组织块继续贴壁培养 24 h 后细胞开始从组织块边缘移行并向外 生长, 5 d后融合成单层 (如图1-B) . 细 胞多呈三角形、多角形或扁平状, 融合 后细胞单层排列紧密、互不重叠, 细胞大小均匀、胞核清晰、胞浆丰富, 呈 “铺路石”状排列. 2. 2　传代培养细胞 原代细胞融合成单层后, 以1∶2方式进行传代, 4 h后大部分细胞贴壁, 更换培养液, 去除未贴 壁细胞. 倒置显微镜下可见内皮细胞在传代培养1 d至3 d时细胞多呈梭形, 5 d后部分细胞呈团簇生 长, 中间较密集, 大部分细胞呈多角形, 第7日细胞融合, 且排列紧密, 有接触抑制现象, 呈 “铺路 石”状排列 (如图2) . 2. 3　细胞免疫组织化学鉴定内皮细胞 Ⅷ因子是血管内皮细胞的特异性, 通过细胞免疫组织化学法, 对酶消化获取的细胞Ⅷ因子进 行鉴定, 发现细胞质呈棕黄色, Ⅷ因子相关抗原表达呈阳性, 苏木精复染后细胞核被染成蓝色, 质核 93　第5 期　　　　　　　　　　　　向　萍等 : 血管组织工程内皮细胞分离培养新方法 界限明显 (图3-A) , 对照组只有核被染色 (图片未列出) ; 同时对消化后组织块继续贴壁培养获取的细 胞进行Ⅷ因子免疫荧光染色, 细胞胞浆呈强绿色荧光 (图3-B) , 而对照组未着色. 每张盖玻片400倍 镜下随机选5个视野计数细胞, 所见两种方式下的细胞均为阳性染色细胞, 阳性表达率为100%, 即获 取的内皮细胞纯度为100%. A: 传代 1; B: 传代 3 d; C: 传代 5 d; D: 传代 7 d 图2　内皮细胞细胞传代培养 ( 100×) 　A: 酶法消化的细胞的免疫细胞化学染色; B: 组织贴壁培养的细胞Ⅷ因子 抗原免疫荧光染色 图3　细胞免疫组织化学鉴定内皮细胞Ⅷ因子 ( 400×) 图4　内皮细胞生长曲线 2. 4　MTT法测定内皮细胞生长曲线 SD大鼠主动脉内皮细胞生长曲线如图4所示, 内皮细胞在1 ～3 d时生长缓慢处于潜伏期; 3～5 d后细胞增殖明显加快, 为对 数生长期; 5～7 d后细胞长满培养板孔底, 进入平台期. 3　讨论 作为种子细胞, 血管内细胞对血管组织工程的成功起着至关 重要的作用. 内皮细胞除了能增加组织工程血管支架的血液相容 性外, 还具有多种生物学功能, 如维持正常的血液流动性, 分泌 多种生物活性物质, 在调节细胞生长、改变脂质代谢、维持血管壁完整性、调节血管张力和选择通透 性以及免疫调节等方面起重要作用[ 13- 14] . Zhang 等人发现组织工程支架内表面种植内皮细胞后血小板 粘附数明显少于对照组 [ 15] . 目前实验室研究多以来源丰富、价格经济、取材方便的大鼠为材料. 传统的大鼠主动脉内皮细胞 分离培养方法多为贴块法或酶消化法, 贴块法培养细胞迁出相对较慢, 酶消化法分离的细胞数量相对 较少[ 11] . 作者将酶消化法与组织块贴壁法相结合, 建立了一种简单快速获取数量较多的大鼠主动脉内 皮细胞培养方法. Ⅰ型胶原酶是常用的消化酶之一, 对细胞作用温和, 但长时间消化会使先消化下来的细胞活性降 低[ 16 ] . 通过对酶消化条件的反复实验, 发现消化时间30 m in效果较好, 既能获得较多的细胞又能较好 地维持细胞的活力. 此外, 培养液不能终止Ⅰ型胶原酶的作用, 在收集Ⅰ型胶原酶消化下来的细胞后 须低速离心 ( 1 000 r·min- 1 ) 去除含酶培养液. 在培养过程中, 培养液需加入体积分数20% FBS, 作者曾尝试在传代过程中使用含体积分数10% FBS 的培养液进行培养, 但细胞生长、增殖缓慢, 大量细胞悬浮较难贴壁. 在原代培养阶段, 每3 d 换 液1次, 采用部分换液原则, 首次换1/ 3, 以后逐渐增加; 此外根据文献报道内皮细胞较平滑肌细胞和 成纤维细胞易于贴壁[ 17] , 在传代培养过程中, 采用早换液的原则, 当大部分细胞贴壁后立即换液, 如 94 福 建 师 范 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 　　　　　　　　　　　2011 年　 此反复几次, 提高了内皮细胞的纯度. 有报道证实贴块法获得的内皮细胞纯度较酶消化法高[ 18] , 在实验中观察到, 经酶消化后的组织块 再进行贴壁培养24 h后细胞从组织块边缘爬出, 5 d后融合成单层, 且内皮细胞纯度达100 % ; 而相关 文献中报道的单纯组织贴块法3 d 后细胞才开始爬出, 14 d后才融合成单层[ 12] . 可见, 酶消化法结合 组织贴块法确实是一种简单快速获取大量高纯度内皮细胞的新途径. 参考文献: [ 1] Rosamond W , F legal K , F r iday G , et al. Heart disease and st roke st atistics-2007 updat e: a r epo rt from the american hear t associat ion statist ics committ ee and str oke statistics subcommit tee [ J ] . Cir culation, 2007, 115 ( 5) : e169- e171. [ 2] Hong Y, Ye S H, N ieponice A . 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