大肠埃希O157_H7等致病菌多重PCR法快速检测试剂盒的研制

第11卷第3期 201 1年6月 中国食品学报 JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTecIlIlo】0科 V01．1lNo．3 Jun．201 1 大肠埃希0157：H7等致病菌多重PCR法快速检测试剂盒的研制 王文娟1赵宏坤l’鲈 (1山东农业大学动物科技学院 山东泰安271018 2青岛农业大学食品科学与工程学院 山东省肉类食品质量安全工程技术研究中心 山东青岛及衢109) 摘要 目的：研制一种能够同时快速检测大肠埃希0157：H7、志贺氏茵和致病性蜡样芽孢杆菌的三重PCR试 剂盒。方法：以大肠埃希0157：H7的htyA曰基因、痢疾志贺氏茵的如讲基因和致病性蜡样芽孢杆菌的拍M 基因作为目的基因片段0157：H7、痢疾志贺氏茵和致病性蜡样芽孢杆菌的特异性抗原基因序列．分别1对 引物，并对其反应条件进行优化，建立1种多重PCR检测试剂盒。结果：本试剂盒可准确检测出生肉和即食肉 制品中的上述3种致病菌，0157：H7检出极限为19．8cfu／mL，志贺氏茵检出极限为17cfu／mL．蜡样芽孢杆菌检 出极限为17．7cfu／mL。可在5h内完成全部反应过程，得出检测结果。结论：本试剂盒在理论和实际应用方面 均具有优越性，能够同时检测上述3种病原茼，可用于食品及其原料的生物安全检测，也可用于兽医临床诊断。 关键词 多重PCR；食品检测；大肠埃希0157：H7；志贺氏茵；致病性蜡样芽孢杆茵沙门氏茵 文章编号 1009—7848(2011)03—0144-08 大肠埃希0157：H7为近年报道的食源性强致 病菌，其轻度感染者会出现短暂腹泻、恶心、呕吐 等症状，重者导致剧烈腹痛、出血性结肠炎、溶血 性贫血、血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合症。 甚至死亡【1】。鸡肉和牛肉被认为是传播0157：H7 主要的载体tzl。志贺氏菌是一类具有高度传染性且 危害严重的革兰阴性肠道致病菌．是导致感染性 腹泻的主要病原菌之一，全球每年约有1．6亿人 患病，110万人死亡，绝大多数为5岁以下儿童[31。 致病性蜡样芽孢杆菌极易污染食物而引起食物中 毒，特别是在蛋白质和碳水化合物含量丰富的食 品，如肉类、米饭等中，通常引起腹泻综合征和呕 吐综合征。由于其在临床上与产肠毒素的葡萄球 菌，产气夹膜梭菌感染有相似的症状，所以常常造 成误诊[41。目前这些致病菌污染问已成为普通饮 食以及公共餐饮业存在的一个突出问题。本文研 究了同时检测大肠埃希0157：H7、志贺氏菌和致 收稿日期：2010-06—27 基金项目：国家“食品安全”科技支撑重大项目(2006BAK 02A21)；国家肉鸡产业技术体系建设专项；山东 省科技支撑项目(2007GG20009001) 作者简介：王文娟，女，1985年出生，硕士生 通讯作者：赵宏坤 病性蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌的PCR方 法，研制快速检测试剂盒，为监测食品及其原料的 生物安全，减少食源性感染和食物中毒以及兽医 临床快速诊断提供技术手段。 1材料与方法 1．1 材料 1．1．1 菌株大肠埃希(Escherichiacoli0157： H7，编号ATCC35150)、痢疾志贺氏菌(肌妇姚 spp．CMCC51252)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus ATCCll778)，购于青岛海博公司；金黄色葡萄球 菌(Sta．aureusATCC25923)、单细胞增生性李斯 特菌(ListeriamonocytogenesCVCC1597)、沙门 氏菌株(SalmonellasppCVCC542)、肠炎沙 门氏菌(50041)，由本实验室保存。 1．1．2主要试剂TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg- C12、10xPCRbuffer、DLl00DNA、2kDNAMarker。 大连TaKaRa生物技术公司；Chelex一100，美国 Sigma公司；其它试剂均为国产纯试剂。 1．2方法 1．2．1模板DNA的制备lO％Chelex树脂法。本 方法按照“MicroSeqTM”16SrRNA检测试剂盒151所 述。取菌液200斗L于1．5mL离心管中，12000r／ 万方数据 第11卷第3期 大肠埃希0157：H7等致病菌多重PCR法快速检测试剂盒的研制 145 in离心3min，弃上清液。于沉淀中加入245斗L0． 1 mol／LTE(pH8．0)，12000r／m离心5min，弃上 清液。处理食品样本时按以上步骤做2次。在细菌 沉淀物中加入250斗L提取液(10％ehelex，0．5％ NP40，TE缓冲液配制，pH9．O)，5斗L溶菌酶(50 mg／mL)。在食品样本中加入500IJ,L0．1mol／LTE (pH9．0)，10斗L溶菌酶(50mg／mL)，56℃温浴45 min，取出，震荡10s，加入3．8此20mgCmL蛋白 酶K，于37℃孵育1h，100℃水浴10min，取出， 震荡15s，8000rim离心2min．取上清液即模板 DNA，直接用于PCR反应。 1．2．2引物设计大肠埃希0157：H7的溶血素 基因htrA8圈、志贺氏菌的侵袭质粒抗原H基因 ipaHN和致病性蜡样芽孢杆菌的溶血素肋以基 因171，采用引物设计软件Primer5．0进行分析。引 物合成由上海生工生物技术公司完成，见表l。 表1 多重PCR引物设计 Table1 Designforprime玛ofmultiplexPCR 1．2．3 重组质粒的构建 以大肠埃希0157：H7、 志贺氏菌和致病性蜡样芽孢杆菌的标准菌株基因 组DNA为摸板．分别用各自引物进行常规PCR 检测。扩增产物纯化后分别与pMDl8-T载体连接 转化进入大肠杆菌DH50t中。37℃培养过夜后，挑 取克隆进行快速PCR检测。挑取阳性克隆菌落， 37℃摇菌过夜，用OMEGA质粒提取试剂盒提取 质粒，并测序验证。测序由上海生工服务公司完 成。将测序结果输入NCBI进行网上在线blast同 源性比对。计算所提取质粒的拷贝数。10倍系列 稀释，一20℃保存，作为PCR扩增的模板。 1．2．4多重PCR反应条件的优化经L16(45)正 交试验确定多重PCR的最佳反应体系。3种模板 的质量浓度固定在104“g，汕L，M92+浓度以及50 灿反应体系中引物的终物质的量(pm01)，见表2。 1．2．5随机组合人工染菌试验3种致病菌随机 组合人工染菌鸡肉Isl。将无菌肉样10g、灭菌生理 盐水89mL以及随机组合的3种致病菌分别加入 拍击式均质器中均质2min。均质过程中使用无菌 袋及特制滤膜分离菌体和体积较大的杂质，回收 含有菌体的过滤稀释液，离心提取模板，直接提取 DNA。进行多重PCR检测，检验结果的特异性以 及是否发生强抑制现象。 1．2．6多重PCR反应敏感度试验将3种细菌 过夜，用PBS进行10倍梯度稀释，需氧乎板培养， 计数。同时以双蒸水作为空白对照，按以下方式感 染经灭菌处理的鸡肉。 1)大肠埃希0157：I-17：1．98x104、1．98x10s、 1．98x102、1．98x101、1．98efu／mL； 2)志贺氏菌：1．70x104、1．70x10s、1．70x102、 1．70x101、17efu／mL； 3)蜡样芽孢杆菌1．77x104、1．77x102、1．77x 102、1．77x101、1．77efu／mL。 置于拍击式均质器中均质2min，直接提取 DNA，进行PCR检测。 2结果与分析 2．1优化的多重PCR反应条件 采用L16(45)正交试验对3对引物的浓度、模 万方数据 146 中国食品学报 2011年第3期 板量、退火温度和镁离子浓度进行优化，结果15 号试验效果较好，但其中志贺氏菌条带过弱。若提 高ipaH引物终物质的量到5pmol，则3条带清晰 完美。优化的三重PCR反应：50斗L反应体系中， 柳卵终物质的量为10pmol，M92+75pmol，5U Taq酶．hlyAB、ipaH和硒M终物质的量分别为5、 5和20pmol，5xPCR反应缓冲液5仙L；PCR增强 剂4．5“L。扩增条件：预变性(94℃，5min)；28个 循环：变性94℃，30s，退火(58℃，40s)延伸(72 ℃，70s)；延伸(72℃，12min)。 2．2多重PCfl特异性试验 在优化的三重PCR扩增反应条件下，不同菌 株的特异性检测结果显示，大肠埃希0157：H7、痢 疾志贺氏菌和致病性蜡样芽孢杆菌出现各自的目 的条带。而其它细菌均为阴性。将本试验中构建的 标准质粒测序结果输入NCBI，在线blast同源性 对比，结果显示，与GeneBank中的基因序列同源 性为100％。上述结果所选大肠埃希0157： H7的基因溶血素基因hlyAB、痢疾志贺氏菌的侵 袭质粒抗原H基因加胡和致病性蜡样芽孢杆菌 的溶血素胁组基因是特异的。 2．3随机组合人工染菌试验 对3种致病菌随机组合人工染菌鸡肉进行多 重PCR检测，可以检出3种致病菌，其特异性很 强，未发生交叉影响。见图1。 2。4多重PCR敏感性 最低检测限：0157：H719．8cfu／mL。志贺氏菌 17cfu／mL，蜡样芽孢杆菌17．7cfu／mL。 2．5组装试剂盒 经反复试验，组装多重PCR试剂盒组分：细 菌提取液(10％chelex—100，0．5％NP40，TE缓冲 液，蛋白酶K，溶菌酶)；2xPCR浓缩液(染料，缓冲 溶液，PCR增强剂，M92+，dNTP，引物)，琼脂糖粉， Taq酶，标准质粒作为阳性对照。 万方数据 第11卷第3期 大肠壤希0157：H7等致病茵多重PCR法快速检测试荆盒的研制 ＆：】100DI．Matker 2EHECOl57：H7ATCC35150 3自戎女姐＆苗CMCC512524致病性蜡#芽趣杆苗^1℃c11778 5 E}mCOl57：117+自疫志贺＆目6EHEC0157：H7+致病性蜡样芽孢杆苗 7确羲恚贺＆自+&病性蜡##孢杆自8EHEC0157：H7+自《{贺＆镕+致病#蜻##抱轩茁 92kMarken 固1人工随机组合染苗的多重PCR扩增结果 Figl MultiplexPCRamplificationre8mIofthecontaminatedmeat—ples ＆：1 2k Mark*”；20157：H71．ggxllPefu／mL．女自＆目1．70x10'd1I／mL．蛞样芽孢杆菌L77x104efu／mL；30157：H7 LgSxl&efu／mL±拙＆苗l70x101。¨mL．蜡#芽孢杆∞1．77xlO’cfu／mL；40157：H71．98x10kfu／mL．{贺R苗1．70× lOkfu／mL镕样》m杆苗I77x10Zefu／mL：50157：H71．98xlOlefu／mL志贺＆∞1．70x101eftCraL．蜡样#孢杆自1．77× 10。efu／mL：60157：H71 98cfu／mL．{女＆菌170cfu／mL，蝽#*孢杆菌177efutmL；7±理#水作时月。 围2多重PCR敏癌性检蔫 Fi92SemitifitydetectionofMultiplexFCR 2．6使用试剂盒 于泰安中百超市购买新鲜生牛肉．即食肉制 品——烤肠、烤牛肉，作为染菌样品。分别将3种 细菌过夜培养．用生理盐水进行10倍梯度稀释： 同时以生理盐水作为空白对照，3种菌按lOs、10'、 10’、lOs、101efu／mL5个浓度感染样品。均质后直 接提取DNA．进行PCR检测．见图3一图5。 万方数据 中国食品学报 2011年第3期 ＆ ＆：M 2kDNAMarker l 0157：H71蚰xl口efu／mL、女贺＆茁1．70xl口曲dmL、蜡样芽孢杆苗l77×I口cfa／mL感染龙大烤肠 20157：H7I．98x10'cfu／mL、毒担＆苗I．70xl∥曲dmL、蜻样#孢#∞l77xIFc“lI|L缚女龙女垮自 3 0157：H71．98xl口efw'mL、女赞＆苗170xl口dWmL、蜡样芽月杆苗I77x1口cfa／mL感染龙太烤局 40157：H7I．98xl口c^dmL、毒贺＆*I．70xl口商√mL、蜡样#孢#*I77x10=e“mL感染龙女坶肠 5 0157：H71．98x101cfu／mL、女贺＆苗170x101曲血L、蜡样芽孢#茼177×10。c叫mL感染龙大烤肠 6±理盐水对月。 田4多tPCR试剂盒检测染菌{0157：H7．志赞氏曹．蜡样芽孢杆曹l龙大烤肠结果 Fig．4AguegelelectrophomsisofthemultiplexPCRkittestingmsoltsfi,omL0Ⅱgda哪usngeinsulated withEco／／0157：H7．Sh咖／／aspp”d日∞mB⋯w 万方数据 第11卷第3期 大肠埃希0157：H7等致病菌多重PCR法快速检刹试剂盒的研制 149 l∞ ’一 ·3d 三置0二 点 M 1 、 { l 、 “ ＆M2 kDNAMme7 1 0157：H7198x1口efu，mL、{贺＆苗170xl口cfu／mL、镕样#孢杆目l77xI口c埘ⅡIL雕巢烤+自 2 0157：H7l98xl口曲dⅢL、☆贺＆茼170x10'cfta=L、蜡样芽孢杆菌l77xl口cullIL感m烤}冉 3 0157：H71 95×i口efu，mL、$贺＆苗170xl口cfu／mL、S样#孢扦∞l77xl口cfidmL感女坶+自 4 0157：H7l98x10：cfut=L、{贺＆蓠170xl口efu／mL、蜡#芽孢杆菌177xl口efutmL感女坶}冉 5 0157：H7lj8×101efu／mL、志贺＆苗170xlO’cfu／mL、###孢扦苗I77x101cfu／mL感m*+自 6±4≈木埘H。 田5多重PCR试剂盒检测染菌{0157：H7、志贺氏菌、螬样芽孢杆菌l烤牛肉结果 Fig5 Ag舯segelelectrophomsisofthemultiplexI?CRkitkm”g”sultsfromm∞tbeefinsulated withEc“0157：H7Shigdlaspp¨dkⅢw一Ⅲ 27试剂盒重复性、稳定性和保存期试验 将3套试剂盒分别于一20℃冻存1、2、3个月． 同时检测标准质粒．每个试剂盒重复测定3次。试 验结果均为阳性．条带亮度无显著变化．见图6。说 明这些试剂盒的重复性好．在一20℃条件下可稳 定保存3个月以上。 ＆M2kMathe”；la—lb-lc婊存1十月目∞试剂盒检目标准质粒；知一2b—k％存2十月B∞ 试*i检月标准质垃．3a-3b一3c珠存3十月后的试剂盒检测标准质粒；m蒸水作目性对目。 圈6试射盘保存期限的检测 Fig6 SheⅡllfetestingofthemst蛐tmultiplexPCRkit 3讨论 本试验中选用目标菌高度保守的序列．根据 大肠埃希0157：1／7的溶血索htyAB基因8、志贺氏 菌的侵袭质粒抗原H基因加以一和致病性蜡样芽 孢杆菌的溶血素hblA基因171设计PCR引物．特异 地扩增出目的基因．从而实现对3种致病菌的快 万方数据 150 中国食品学报 2011年第3期 速检测。多重PCR影响因素复杂，反应体系中的 各组分都可以对扩增结果产生综合效应。Hene． gariuw等191对多重PCR中的模板、引物、聚合酶、 循环条件、M矿浓度等参数进行量化研究，提出一 个系统的调整方案。根据这个方案。在本试验中选 取对扩增效率影响较大的退火温度、M92+浓度和 引物浓度3个参数设计L。。(45)正交试验，通过优 化研究，获得较好的敏感性结果。 本试剂盒是即用型PCR试剂盒，其优点是： ①细菌提取液的主要成分是Chelex一100，用于微 量DNA提取，它是一种螯合型的离子交换树脂， 由交联聚苯乙烯凝胶和亚胺基乙酰乙酸等组成。 后者为螯合集团，可与金属离子结合，其对二价金 属离子的亲和力是单价离子的5000倍，阻止金 属离子在高温和低离子强度条件下使DNA降解。 螯合金属离子的Chelex一100颗粒可通过离心去 除。不影响带有MS+的PCR反应。本试验中用 Chelex一100结合溶菌酶水解致病菌中黏多糖，裂 解菌体，快速提取基因组DNA，缩短了检测时间， 并保证低丰度样品DNA的扩增，不需要前增菌。 ②反应的灵敏度高，特异性强。③成分中PCR增 强剂使试剂更稳定，并且进一步保证低丰度样品 DNA的扩增。④本试剂盒附带标准质粒作为阳性 对照，便于设计和监控实验，分析实验结果。⑤快 捷，操作简便，减少污染，降低实验误差。 试剂盒中的阳性对照是构建的重组质粒，为 裸露的螺旋缠绕的双链闭环DNA，化学性质稳 定。其物理结构易碎。在受到搅拌、振荡或反复抽 吸时，DNA双链容易被拉断。结构被破坏后，DNA 序列不完整．参与PCR反应时扩增效率降低。在 反复冻融过程中，液一固状态的体积发生变化，对 DNA质粒结构产生力学作用。为避免多次操作和 反复冻融对试剂盒的不利影响，根据实际使用情 况将试剂盒分装成数份，每份于一个月内使用完。 为避免核酸污染．操作过程应尽量在超净台上进 行。 快速检测试剂盒，可在5h内(包括样品前处 理时间)检出食品或其原料中的大肠埃希0157： H7、志贺氏菌和致病性蜡样芽孢杆菌，具有特异、 快速、灵敏的特点。0157：H7检出极限为19．8cfu／ mL，志贺氏菌检出极限17cfu／mL，蜡样芽孢杆菌 检出极限17．7cfu／mL。该试剂盒为监测食品及其 原料的生物安全。以及兽医临床快速诊断上述3 种菌的感染提供了技术手段。 参考文献 【1】PhilipSCA．卟eepidemiology，detectionandcontrolofEscherichiacoli0157明．JournaloftheScienceofFood andAgriculture，1999，79：1367—1381． 【2】 朱英莲，李远钊，张培正，等．食品中大肠杆菌0157：H7的预测模型和风险评估阴．食品安全，2005，26(9)：159-161． [3】 GolovhovI，SjostedtA，MokrievichA，eta1．AmethodforallelicreplacementinFranciseUatularensis阴．FEMS MicrobiolLett，2003，222(2)：273—280． [4】 王振国，刘金华，肖成蕊，等．利用PCR技术检测致病性蜡样芽孢杆菌的研究明．生物技术，2005，15(5)：45却． 『51 FratamicoPM．DetectionofEscher／ch／aco／／0157：H7bymulti#exPCR叨．ClinMicrobiol，1995，33：2188． [6】 蔡亦红．PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立叨．中国人兽共患病学报，2008，24(2)：150—153． [7】 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cere[1。5bymultiplexesPCRatthe881netime．Methods：Characteristicgenessucha8hlyAB，审胡and|116Mwerechosen 88thetargetgenesforduplexPCRsystem．ManyfactorsofduplexPCRwereoptimized．AmultiplexPCRdetectionkit WaSestablished．Results：Thiskitc蚰accuratelydetecttllosetllleepathogensbothinrawandRTEmeatproducts．The sensitivityW88upto19．8cfu／mLofEscherichiacoli0157：H7，17cfu／mLofShigellaspp．and17．7cfu／mLofBac／／／us cere础inthesystem．。Ihewholetestcallbecompletedin5h．Conclusion：皿edetectionkithasthesuperiorityintlleo- ryandpracticalapplication，andalsoexaminesthosethreepathogensonce．ItCanbeusedforfoodandraWmaterials’ bio-safetymonitoringandalsoCanbeusedinclinicaldiagnosis． KeywordsmultiplexPCR；fooddetection；Escherichiacoil0157：H7；Sh洳Uaspp．；Bac／／／uscereu3 露酾羽 中国大豆蛋白企业应诉欧盟反倾销调查 针对欧盟委员会对中国出口到欧盟的大豆蛋白产品进行的反倾销调查。日前国内包括山 东谷神集团等10余家大豆蛋白生产与出口企业向欧盟应诉。 4月19El，欧委会发布公告称，对中国输欧大豆蛋白产品进行反倾销立案调查，理由是中 国出口到欧盟的上述产品在价格和数量上已经对欧盟同类企业造成了实质性伤害。这是欧盟 今年以来对“中国制造”发起的第3起贸易救济调查。 有关方面统计．中国的大豆蛋白出口已经在国际贸易中占据50％的份额。欧盟反倾销调查 或将对国产大豆和大豆深加工业产生深远影响。 有关业内人士透露，我国大豆蛋白食品在欧美市场上近年来正以10％的速度增长。种类增 加到万余种，发展前景相当可观。 此次牵头向欧盟委员会提出反倾销调查的索莱公司实际上是美国杜邦公司的子公司，其 在欧盟有加工厂，欧盟市场蛋白粉的供应此前主要来自该公司。业内人士提出，即便中国大豆 蛋白粉对欧盟市场造成了影响，实际上影响的是美国公司，而不是欧盟的企业，索莱公司能否 代表欧盟企业提出调查申请值得质疑。 欧盟委员会的相关文件指出，与美国大豆蛋白产品的价格相比，中国同类产品价格偏低， 因此存在倾销的嫌疑。业内人士反驳道，中国非转基因大豆的价格低于美国的非转基因大豆， 人力成本也低于美国，大豆蛋白粉的出口价格自然要比美国低，以美国大豆蛋白粉的价格作为 参照依据并不合理。 (消息来源：中国食品报) 万方数据 大肠埃希O157:H7等致病菌多重PCR法快速检测试剂盒的研制 作者： 王文娟， 赵宏坤， Wang Wenjuan， Zhao Hongkun 作者单位： 王文娟,Wang Wenjuan(山东农业大学动物科技学院,山东泰安,271018)， 赵宏坤,Zhao Hongkun(山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018;青岛农业大学食品科学与工程学院山 东省肉类食品质量安全工程技术研究中心,山东青岛266109) 刊名： 中国食品学报 英文刊名： JOURNAL OF CHINESE INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 年，卷(期)： 2011,11(3) 参考文献(9条) 1.Kong R Y;Dung W F;Vrijmoed L L Co-detection of three species of water-borne bacteria by multiplex PCR[外文期刊] 1995(04) 2.Y.Li;S.Zhuang;A.Mustapha Application of a multiplex PCR for the simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7,Salmonella and Shigella in raw and ready-to-eat meat products 2005 3.Monika Ehling-Schulz;Martina 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