顺铂诱导肾小管上皮细胞毒性及曰观．2对抗细胞凋亡

研究2005,24(1) 探讨单纯照射和单纯顺铂以及照射联合顺铂对肺癌细胞凋亡的影响.应用细胞培养技术,分别采用单纯照射,单纯顺铂,照射联合顺铂用于人肺癌细胞 SPC-A4细胞,通过荧光染色法、DNA凝胶电泳分析等检测方法观察其诱导凋亡的差异.并进行量化以比较3种方法诱导细胞凋亡效果差异的程度.结果表明 ,顺铂组、照射组、顺铂联合照射组,DNA琼脂糖凝胶电泳及裂解显示凋亡发生.荧光染色法细胞凋亡的定性观察、定量分析表明,顺铂诱导的细胞凋亡呈时 间依赖性,照射组中以6Gy和8Gy照射12h的凋亡率最高,在24h时凋亡率反而下降,顺铂联合照射与单纯照射及单纯顺铂相比,在对应时间段相比凋亡率前者 明显高于后两者(P＜0.001).结果表明,单纯顺铂和单纯照射及顺铂联合照射均能诱导肺癌细胞凋亡,顺铂联合照射诱导肺癌细胞的凋亡率明显高于单纯顺 铂及单纯照射. 2.学位论文 房朝辉 溶血磷脂酸对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的影响及其抗凋亡机制的研究 2007 卵巢上皮性癌(以下简称卵巢癌)是妇女生殖系统常见恶性肿瘤，是死亡率最高的疾病之一。据统计，2006年在美国约有20，180例新发病例，约 15，310例死于该病。大多数卵巢癌妇女在初次诊断时已经广泛转移。导致这种不幸的原因是，由于大部分患者不能得到早期诊断。目前，早期诊断的Ⅰ A期90％及Ⅱ期70％的卵巢癌是可以治愈的。对于疾病发生及发展过程的理解将有助于我们在早期或可治愈阶段识别卵巢癌以及为进展性卵巢癌发展新型 、有效的治疗方法。溶血磷脂酸(Lysophosphafidic acid，LPA)在90％卵巢癌患者的腹水及血浆中升高，同时这种升高与临床分期无关，Ⅰ期卵巢癌患 者血浆LPA增高近90％，Ⅱ～Ⅳ期及复发性患者血浆LPA增高均达100％。这提示血浆LPA的水平可能成为卵巢癌诊断、预后或监视治疗效果的标志物。LPA 促进肿瘤发生发展机制的研究，提示LPA可能通过基因表达的调节促进肿瘤的增殖、生存、侵袭和转移。LPA具有生长因子样作用，通过细胞膜上特异性 G蛋白偶联受体(G-protein COUpled receptor，GPCR)刺激细胞迁移、增殖、生存、黏附及血管生成因子等的分泌。已知LPA受体有四种，(LPA<,1>/Edg- 2，LPA<,2>/Edg-4，LPA<,3>/Edg-7)以及最近识别的GPR23/p2y9/LPA<,4>。正常卵巢上皮细胞中LPA<,2>/Edg-4和LPA<,3>/Edg-7 mRNA 低表达，在卵巢 癌细胞中高表达；在卵巢癌细胞中LPA<,2>/Edg-4、LPA<,3>/Edg-7 的高表达参与调节LPA的自分泌环，而LPA<,1>/Edg-2在卵巢癌细胞LPA的自分泌过程 中表现为负性调节作用。提示LPA受体可能成为潜在的治疗靶。 卵巢癌发病隐匿，进展迅速，70％～80％的卵巢癌患者发现时已为晚期，5年生存 率在30％左右。在近乎所有的卵巢癌患者中，以铂类为基础的化疗是最有效的标准化学治疗。尽管大多数患者在最初的治疗过程中有效，甚至少数患者 可以治愈，但随着化疗疗程的延长，最终约有80％的患者出现继发性耐药，铂类耐药是卵巢癌化疗治疗失败的主要原因。顺铂(Cisplatin，DDP)作为卵 巢癌治疗的一线化疗药物，其杀伤肿瘤的主要机制是通过诱导细胞凋亡。顺铂能够诱导包括卵巢癌在内的多种肿瘤细胞发生凋亡。研究表明，溶血磷脂 酸在不同细胞类型具有促存活或促凋亡的作用，甚至在同一种细胞在不同的作用条件下，可以产生双重的影响。LPA 对顺铂诱导的卵巢癌细胞的凋亡究 竟是否有影响，是产生协同作用，还是能够拮抗化疗药物诱导凋亡的作用。通过实验发现LPA明显抑制了顺铂诱导的卵巢癌细胞的凋亡。我们推测这可能 是 LPA 拮抗了顺铂诱导的凋亡作用所致。尽管研究发现LPA在许多细胞系具有明显的抗凋亡作用，但其机制尚不明确。 因此我们进一步研究了LPA 抑制顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡的可能机制。由于LPA通过其特异性受体发挥作用，在此基础研究之前，我们首先观察了LPA受体在人卵巢癌组织中的表达 状况及其与顺铂化疗耐药的关系。 第一部分卵巢上皮性肿瘤中溶血磷脂酸受体的表达及临床意义 目的：探讨三种溶血磷脂酸受体在人体卵 巢上皮性肿瘤组织中的表达状况及临床意义，探讨LPA受体在人卵巢癌组织中的表达状况及其与顺铂化疗耐药的关系。 方法：采用免疫组织化学技 术检测LPA受体Edg-2、Edg-4和Edg-7蛋白质在人卵巢上皮性肿瘤组织中的表达水平。并分析LPA受体在人卵巢癌组织中的表达状况及其与顺铂化疗耐药的 关系。 结果：免疫组织化学检测结果显示，LPA受体Edg-2 蛋白在正常卵巢组织，良性卵巢上皮性肿瘤及卵巢癌组织中表达阳性率分别为 (90.0％；83.3％；45.6％)，三组表达阳性率差异有显著性(x<'2>=11.29，P<0.01)；正常卵巢组织及良性卵巢上皮性肿瘤Edg-2蛋白表达水平高于卵巢 癌组织，差异有显著性P=0.001)。正常卵巢组织及良性卵巢上皮性肿瘤 Edg-2蛋白表达水平相比，差异无显著性(P=0.57)。卵巢癌组织中LPA受体Edg- 4蛋白表达阳性率(92.6％)与良性卵巢上皮性肿瘤(33.3％)及正常卵巢组织(30.0％)表达阳性率相比，差异有显著性(x<'2>=27.83，P<0.01)。良性卵巢 上皮性肿瘤与正常卵巢组织 Edg-4．蛋白表达阳性率相比，差异无显著性(P>0.05)。卵巢癌组织中LPA受体Edg-7蛋白表达阳性率(89.7％)与良性卵巢上 皮性肿瘤(41.7％)及正常卵巢组织(40.0％)表达阳性率相比，差异有显著性(x<'2>=22.91，P<0.01)。良性卵巢上皮性肿瘤与正常卵巢组织Edg-7蛋白表 达阳性率相比，差异无显著性(P>0.05)。卵巢癌组织中Edg-2蛋白表达水平明显低于Edg-4和：Edg-7蛋白表达水平，差异有显著性 (x<'2>=10.89，P<0.01)。Edg-2、：Edg-4和Edg-7 蛋白质在人卵巢上皮性癌组织中的表达水平与病理资料的相关分析显示，上皮性卵巢癌组织中Edg- 4和Edg-7蛋白质的高表达与年龄及病理类型无关；与手术病理分期及病理分级有关。手术病理分期为Ⅲ～Ⅳ期的卵巢上皮性癌组织中Edg-4和Edg-7蛋白 质表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期，差异有显著性(P<0.05)；病理分级为中低分化(G2～G3)癌组织中Edg-4和Edg-7蛋白质表达明显高于高分化(G1)组，差异有显 著性(P<0.05)。卵巢癌组织中Edg-4与Edg-7蛋白的表达水平与顺铂敏感性的关系：Edg-4蛋白高表达组出现顺铂耐药的百分率为80％；低表达组出现顺铂 耐药的百分率为24.2％；两组相比差异有显著性(P=0.001)。Edg-7蛋白高表达组出现顺铂耐药的百分率76.7％；低表达组出现顺铂耐药的百分率 34.2％；两组相比差异有显著性(P=0.001)。Edg-2蛋白表达程度与顺铂耐药无明显关系。 结论：在卵巢上皮性肿瘤及正常卵巢组织中存在Edg-2、 Edg-4和Edg一7不同程度的表达；Edg-4和Edg-7可能与卵巢上皮性癌侵袭、进展密切相关；卵巢癌组织中 Edg-4与Edg-7蛋白的高表达与顺铂耐药显著关 联；LPA受体Edg-4和Edg-7可作为判断卵巢癌侵袭、进展及铂类化疗耐药的一项参考指标。 第二部分：溶血磷脂酸对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的 影响 目的：探讨溶血磷脂酸对顺铂诱导的卵巢癌SKOV3和3AO细胞凋亡的影响。 方法：体外培养卵巢癌细胞株SKOV3和3AO；采用四甲基偶氮 唑蓝(MTT)法检测LPA对卵巢癌细胞株SKOV3和3AO增殖活性的影响；用流式细胞术(FCM)分析LPA对顺铂诱导的卵巢癌SKOV3和3AO细胞凋亡的影响。细胞形 态学变化及DNA ladder分析卵巢癌细胞株SKOV3和3AO的凋亡状态。 结果： LPA能够对抗顺铂诱导的SKOV3和3AO细胞的凋亡，用FCM法证实顺铂对 SKOV3和3AO细胞的凋亡具有浓度依赖性的诱导作用，LPA单独作用对SKOV3和 3AO 细胞的凋亡无明显影响，但当2.5μg/ml顺铂与10μmol/L LPA联合作用 时细胞的凋亡率从顺铂单独作用的13.18±1.24％和13.02±1.18％减少至4.89±0.76％和4.99±0.85％(P<0.01)，表明LPA具有对抗顺铂诱导的SKOV3和 3AO细胞凋亡的作用或具有促存活的作用。顺铂诱导SKOV3和3AO细胞凋亡形态学改变表现为细胞染色质浓聚、固缩，细胞数目明显减少；琼脂糖凝胶电泳 梯状DNA检测显示明显的DNA片断化现象。而LPA可明显逆转顺铂诱导的凋亡，形态学改变为细胞染色质浓聚、固缩及细胞数目减少的明显逆转，同时 DNA片断化现象近消失。此外，MTT比色法测定结果显示在含lO％小牛血清的RPMI-1640培养液中加入lOμmol/L LPA，对卵巢癌SKOV3和3AO细胞增殖无明 显影响。 结论：顺铂诱导的卵巢癌SKOV3和3AO细胞的凋亡具有浓度依赖性。LPA具有对抗顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的作用。LPA对抗顺铂诱导的 凋亡不是借助LPA刺激卵巢癌细胞的增殖作用，而主要是通过 LPA拮抗顺铂诱导的凋亡作用。 第三部分：溶血磷脂酸对抗顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡 的机制 目的：探讨溶血磷脂酸对抗顺铂诱导的卵巢癌SKOV3细胞凋亡的机制。 方法：半定量RT-PCR方法检测Bcl-2蛋白家族成员表达 ，WesternBlot的方法检测Caspase-9和Caspase-3的活性；流式细胞术(FCM)及Western Blot分析P13-K/Akt 信号转导通路以及百日咳毒素(PTX)敏感的 Gi通道在LPA抗凋亡作用中的影响。 结论：LPA可以通过影响线粒体的凋亡途径发挥抗凋亡作用。LPA能够激活P13-K/Akt信号转导通路而发挥抗凋 亡作用；百日咳毒素(PTX)敏感的Gi通道参与了LPA对P13-K/Akt信号转导通路的激活作用及LPA的抗凋亡作用。 3.期刊论文 邢盈.王立英.XING Ying.WANG Liying 米非司酮配伍顺铂对卵巢癌耐药细胞株CAOV3/DDP细胞凋亡和性 激素受体的影响 -河北医药2008,30(10) 目的 探讨米非司酮配伍顺铂对卵巢癌耐药细胞株CAOV3/DDP增敏作用以及凋亡率、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的影响.方法 采用RPMIl640培 养液时CAOV3/DDP细胞株进行培养,将CAOU3/DDP细胞株分5组:对照组(不加任何药物)、顺铂组(2μg/ml)、高剂量米非司酮加顺铂组(15μg/ml米非司酮和 2μg/ml顺铂)、中剂量米非司酮加顺铂组(10μg/ml米非司酮和2μg/ml顺铂)、低剂量米非司酮加顺铂组(5μg/ml米非司酮和2μg/ml顺铂).培养结束后 采用MTT法观察不同浓度的米非司酮配伍顺铂对CAOV3/DDP细胞株增殖活力的影响;采用流式细胞术观察不同浓度的米非司酮配伍顺铂对CAOV3/DDP细胞株 凋亡率、ER、PR的影响.结果 与对照组比较,顺铂组对细胞增殖活力、细胞凋亡率以及ER、PR阳性率的影响,差异均无统计学意义(P>0.05);与顺铂组比较 ,各剂量米非司酮加顺铂组对细胞增殖活力、生存率以及细胞凋亡率、PR阳性率的影响,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),且随着米非司酮浓度的升 高,对CAOV3/DDP细胞抑制作用逐渐增强,细胞凋亡率显著上升,PR阳性率下降(P<0.05,P<0.01),各组ER阳性率无统计学意义(P>0.05).结论 米非司酮联合 顺铂对CAOV3/DDP细胞增殖活力均具有显著抑制作用,且与米非司酮的浓度呈剂量依赖关系,米非司酮可提高顺铂化疗的敏感性,其增敏作用与抑制孕激素 分泌,促进卵巢癌细胞凋亡有关 4.学位论文 刘镭 活细胞内可视化研究顺铂诱导细胞凋亡的分子机制 2009 顺铂是一种广谱的抗肿瘤药物，对乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、头颈部癌等都有显著疗效。研究表明，顺铂是一种DNA损伤的药物 ，主要依赖于与DNA形成加合物，通过与DNA分子形成链内或链间交叉联接而抑制DNA的复制，从而杀死细胞。近年来，随着分子生物学、细胞生物学等学 科的发展，对其分子药理学的研究取得了长足的进步，研究认为除了抑制DNA的合成和复制，顺铂对肿瘤细胞的杀伤还可以通过抑制RNA的转录、阻滞细 胞周期、诱导细胞凋亡等方式实现。同时，大量临床实践发现，长期使用顺铂，存在严重肾功能损伤、胃肠道反应、耳毒性等不良反应，同时也会导致 肿瘤耐药性，使化疗效果明显降低。目前，关于其药理作用、药毒性及长期使用导致肿瘤耐药性的具体分子机制尚不完全清楚。因此，研究施药后细胞 内各蛋白分子的动态行为将有助于深入认识顺铂抗肿瘤的药理机制，为临床治疗提供可靠的实验依据，为提高其疗效、降低不良反应作出贡献。 在本研究中，基于FRET、荧光成像等先进的实验手段，我们在无损伤、活细胞生理条件下，实时、直观、可视地研究顺铂诱导细胞凋亡过程中多种可能 事件，检测了Bid、Bax、cytochrome c、AIF、Caspase—3等蛋白分子在该凋亡过程中的动态行为特性，重点探讨了钙依赖性蛋白酶Calpain对顺铂诱导 细胞凋亡的调控作用，主要研究结果如下： 1，Bid、Bax、cytochrome c是关键的促凋亡因子，能够触发线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。本研究中 ，基于FRET原理设计的荧光探针pFRET—Bid被应用于检测Bid的切割活化过程。同时，我们还利用荧光成像在亚细胞水平对Bid和Bax转位线粒体及 cytochrome c释放的动力学特征进行了实时分析。结果表明：顺铂诱导Bid的切割发生在施药后4—5 h，历时120±20 min。Bid被切割活化后会发生空间 易位，即从胞浆内转位到线粒体。顺铂刺激后约7.5 h，Bax被激活，从胞浆内转位到线粒体，且在40±10 min完成。在凋亡后期，可以明显检测到线粒 体肿胀、cytochrome c释放。同时，对Caspase家族蛋白酶活性分析的结果表明，顺铂诱导了Caspase—9、Caspase—3的活化，但是不活化Caspase—2、 Caspase—8。同时，FRET技术被应用于实时检测Caspase—3动态活化，发现其激活发生在药物刺激14 h后，30 mm内即可彻底活化。以上的研究结果表明 ，顺铂刺激后，Bid、Bax等蛋白的活化诱导了线粒体外膜通透性增加，从而使得线粒体功能紊乱，诱导了cytochrome c自线粒体释放，从而诱发了 Caspase—9、Caspase—3的活化，细胞走向不可逆的凋亡。 2，随后，通过在活细胞内可视化分析Calpain对顺铂诱导的细胞凋亡的影响，发现 Calpain对顺铂诱导的细胞凋亡起着重要的调控作用。研究结果显示：顺铂刺激后，Calpain的活化是一个早期事件，发生在经过顺铂处理后4h左右，在 6h左右，活化程度达最大。用抑制剂Calpeptin、PD150606抑制Calpain的活性，可以完全抑制Bid的切割活化、Bid转位线粒体，而抑制Caspase家族蛋白 酶的活化则不影响Bid的激活，说明Bid是Calpain的直接底物，Calpain介导了Bid蛋白的切割活化，而Caspase不参与此事件。更为重要的是，抑制 Calpain的活性，或沉默内源性Bid的表达(使Calpain的调控靶点缺失)等处理手段使cytochrome c释放、Caspase—3活化、细胞凋亡等一系列事件得以延 迟，说明在顺铂诱导细胞凋亡过程中，Calpain是关键的调控因子，它所调控的凋亡通路对顺铂的药理作用机制非常重要。 3，Calpain对多种生命 活动的调节有着重大作用，比如：信号转导、增殖、分化、凋亡、坏死等。在哺乳动物中普遍存在的有两种：μ—Calpain和m—Calpain。在证明了 Calpain对顺铂诱导的细胞凋亡起着重要的调控作用后，进一步的研究表明，Calpain对顺铂诱导细胞凋亡的调控主要来自μ—Calpain活化的贡献，而与 m—Calpain无关。抑制内源性μ—Calpain的表达可以降低Caspase—9、Caspase—3的活性，延缓顺铂诱导的凋亡，而抑制内源性m—Calpain的表达则无 此效应。同时，我们的研究还发现，在顺铂诱导的细胞凋亡过程中，AIF被切割活化，它介导了Caspase—非依赖型凋亡信号通路，与Caspase—依赖型凋 亡信号通路以互为补充的方式共同诱导更为有效的细胞凋亡。而AIF的切割活化则完全依赖于μ—Calpain的活化，与m—Calpain、Caspases、 Cathipsins等没有关联。进一步的研究结果揭示：线粒体内源性的μ—Calpain直接介导了AIF的切割活化。 综上所述，顺铂通过诱导Bid、Bax、 cytochrome c、AIF、Caspases等促凋亡因子的活化，激活了线粒体凋亡途径，从而诱导有效的细胞凋亡。μ—Calpain介导了顺铂诱导的Caspase—依赖 型与Caspase—非依赖型凋亡通路，对顺铂诱导的细胞凋亡起着关键的调控作用。 5.期刊论文 李文瑜.张洹.何冬梅 hTERT基因反义核酸对顺铂诱导Jurkat细胞凋亡的影响 -中国病理生理杂志 2003,19(12) 目的:用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制Jurkat细胞端粒酶活性后,观察化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙 甙)对Jurkat细胞凋亡的影响.方法:采用台盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)联合作用对Jurkat细胞系生 长的影响;姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂情况;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析.结果 :hTERTASODN作用于Jurkat细胞24h再加入柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙,对细胞生长的抑制分别与单用柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙及hTERT正义寡 核苷酸(sense oligodeoxynucleotide,SODN)联合柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙组相比,无显著差异(P＞0.05).hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加 入顺铂,分别与SODN联合顺铂作用组、单用顺铂作用组相比,对细胞抑制明显增强(P＜0.05).hTERTASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂作用48h,细胞 出现典型的凋亡形态学改变,经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带,而SODN与顺铂联合作用组及单独应用顺铂均未见到DNA梯形条带.hTERT ASODN与2.5 μmol/L顺铂联合作用于Jurkat细胞48h的凋亡细胞百分率(25.18±3.63)%分别同SODN与顺铂联合作用组(10.07±2.12)%、单用顺铂作用组 (9.73±2.43)%进行比较有显著差异(P＜0.01).结论:hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导Jurkat细胞凋亡. 6.学位论文 么金平 紫杉醇与顺铂合用对卵巢癌细胞凋亡的影响 2006 目的：卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，严重危害妇女的身心健康，其发病率和死亡率仍在逐年上升。目前，肿瘤的治疗提倡手术 、化疗、放疗等一起的综合治疗，以最大限度的减少治疗的副作用，改善患者的生活质量，延长生存年限。由于许多患者发现时已较晚，加上肿瘤的转 移和复发特点，手术治疗的效果并不理想，因此化疗在恶性肿瘤的治疗中占据着十分重要的地位。研究表明，化疗药物均可通过诱导细胞凋亡而发挥抗 癌作用，对靶细胞凋亡的诱导能力常常是筛选抗癌敏感性化疗药物最客观的指标。近年来，随着细胞分子生物学和肿瘤生物学的研究进展，人们逐渐认 识到肿瘤是一类细胞周期疾病，细胞周期的调控在肿瘤的发生、发展中起到重要作用，许多化疗药物也是针对细胞周期某一时相发挥作用，阻滞细胞周 期的正常运行，从而达到抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡之目的。根据化疗药物作用于细胞周期时相的不同，将其分为周期非特异性化疗药和周期特异性 化疗药。顺铂为细胞周期非特异性化疗药，在卵巢癌的治疗中一直是首选药物，但目前随着顺铂的广泛应用，其耐药现象日渐突出，使它的使用受到很 大限制，因此，选择合理的与之配伍的药物是提高其疗效的关键。紫杉醇可导致G2/M期阻滞，并促进细胞凋亡，它是一种新型抗微管药物，可使微管过 稳定化及排列异常，从而发挥抗肿瘤作用，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤中已有应用。目前，卵巢癌的化疗常选择以顺铂为主的联合化疗，而紫 杉醇也成为卵巢癌化疗中常用的药物。理论上，对不同细胞周期起作用化疗药联合应用可增加药物对细胞周期的阻滞作用，加强对癌细胞的杀伤力。本 实验将通过体外研究从凋亡及细胞周期动力学角度探讨紫杉醇与顺铂合用对卵巢癌SKOV3细胞生长的影响：MTT比色法测定顺铂单用及两者合用对卵巢癌 SKOV3细胞的增殖抑制率；流式细胞仪分析细胞周期的变化以及细胞凋亡情况；免疫细胞化学检测细胞周期因子cyclinB1、survivin蛋白和细胞因子COX- 2的表达。将检测结果进行统计学分析，了解三种因子在细胞凋亡中所起的作用，进一步探讨紫杉醇和顺铂合用引起细胞凋亡变化的可能机制，为临床制 定合理的联合化疗，寻求最佳治疗效果提供理论依据。 结论： 1.紫杉醇和顺铂对细胞生长的抑制作用分组实验显示，24h内，紫杉醇的 血浆峰浓度与DDP的各浓度合用，两药具有明显的协同效应。 临床应用顺铂可对机体产生一定的消化道反应和肾毒性，并且随着浓度的增大，毒副 反应越明显，因此，本研究可为临床制定合理的联合化疗方案，减少顺铂用量及毒副作用，寻求最佳的治疗效果提供理论依据。 2.流式细胞仪分 析紫杉醇和顺铂对细胞周期分布及凋亡率的影响紫杉醇与顺铂合用加强了对G2/M期的阻滞。紫杉醇和顺铂处理SKOV3细胞后，使细胞周期的分布发生了明 显的改变，G0/G1期的细胞比例明显减少，S期和G2/M期比例增多，表明紫杉醇加强了顺铂对细胞周期的阻滞作用，尤其是G2/M期，细胞周期的正常运行 被扰乱，其连续性中断，药物使细胞周期的运行停滞在S和G2/M期，使通过G2/M监测点进入下一个细胞周期的细胞减少，从而抑制了细胞的增殖。 紫杉醇与顺铂合用加强了细胞凋亡作用。紫杉醇和顺铂处理SKOV3细胞后，流式细胞分析仪检测细胞凋亡率结果显示FCMDNA组方图表明除正常对照组外 ，各实验组SKOV3细胞二倍体峰前均出现了明显的细胞凋亡特征的亚二倍体峰，即细胞凋亡峰。FCM检测结果表明：在相同的时间和浓度下，各实验组细 胞凋亡率均明显高于对照组，两实验组细胞凋亡率随药物浓度升高而升高。说明紫杉醇与顺铂合用加强了细胞凋亡作用。 3.紫杉醇和顺铂对 cyclinB1、survivin和COX-2表达的影响目前，关于化疗药物引起细胞周期阻滞和增殖抑制的机理尚不十分明确，本研究应用免疫细胞化学检测发现细胞 周期蛋白cyclinB1、survivin和凋亡相关因子COX-2的表达下降，结合流式细胞仪及MTr检测结果，结果提示：紫杉醇和顺铂作用于SKOV3细胞，引起细胞 生长抑制和细胞周期阻滞；三种因子在细胞增殖和对化疗药的反应上起到重要作用，紫杉醇、顺铂配伍引起S期和G2/M期阻滞的分子机制之一可能与下调 cyclinB1和survivin的蛋白水平有关，紫杉醇、顺铂配伍引起细胞凋亡率增加的机制与S期和G2/M期阻滞以及下调COX-2因子有关。 7.期刊论文 吴小华.李冬秀.李利.郭燕红.杨波.单保恩 αvβ6整合素对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的影响 -中华 妇产科杂志2004,39(2) 目的探讨αvβ6整合素介导的细胞与细胞外基质的黏附,及其对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的影响.方法采用流式细胞仪测定卵巢癌细胞株SKOV3、 AO、3AO细胞表面αvβ6整合素的表达,并利用酶联免疫吸附实验、吖啶橙-溴化乙锭双荧光染色法分析顺铂诱导的细胞凋亡及αvβ6整合素对细胞凋亡的 影响.结果 SKOV3、AO、3AO细胞均表达αvβ6整合素,其相对荧光指数(FI)均为1.03±0.01.顺铂可以诱导SKOV3、AO、3AO细胞凋亡,经顺铂(10 μg/ml)作用48 h后,酶联免疫吸附实验结果显示,生长于αvβ6整合素配体--纤维粘连蛋白(FN)上的细胞的富集系数(EF)分别为2.11±0.04、 2.15±0.06、2.11±0.04,明显低于生长于非整合素配体--多聚赖氨酸(polylisin)上的细胞(分别为3.51±0.03、3.55±0.04、3.66±0.04, P<0.01);吖 啶橙-溴化乙锭双荧光染色法结果显示,生长于FN上的细胞凋亡率分别为(5.0±0.7)%、(5.0±0.7)%、(6.0±0.7)%,明显低于生长于polylisin上的细胞凋 亡率[分别为(28.0±0.7)%、(28.0±0.7)%、(29.0±0.7)%,P<0.001],用αvβ6整合素的特异性阻断抗体封闭过的细胞再次生长于FN上时,细胞凋亡率[分 别为(15.0±0.7)%、(16.0±0.7)%、(15.0±0.7)%]又明显提高(P<0.01).结论卵巢癌细胞株SKOV3、AO