养的缺氧海马神经元的预防保护作用

人参皂苷对体外培养的缺氧海马 神经元的预防保护作用 李安庆!"王双燕#"王守彪#"沈若武# $!淄博市临淄区人民医院"山东淄博 #%%&’’(#青岛大学医学院) *摘要+ 取新生 ,-./01大鼠海马神经元体外培养 !&2"随机分为对照组3尼莫地平 %456789组3人参皂苷 :;#’<’#%556789组3:;#’<’%556789组=将药物加入到培养液中 &>后"连续冲以 ?%@A#B?%@CD#混合气体" 建立急性缺氧细胞模型=台盼蓝染色细胞计数"吉姆萨染色观察细胞形态并计算其凋亡率"EAF9022G1测定细 胞凋亡程度=结果提示"人参皂苷:;#可显著降低体外培养大鼠缺氧海马神经元的细胞凋亡率而发挥对其保护作 用= *关键词+ 人参皂苷 :;#(缺氧(海马神经元(EAF9022G1 *中图分类号+ H&#! *文献标识码+ I *文章编号+ !’’#J#KKL$#’’K)’MJ’’#NJ’# #’’&年 !月O#’’%年 K月"我们观察了人参皂 苷 :;#对缺氧海马神经元凋亡情况的影响"旨在探 讨其对体外培养缺氧海马神经元的保护作用和机 制"为缺血性脑血管病的临床治疗提供理论依据= P 材料与方法 !后更换 维持培养液$%@胎牛血清3!’@马血清)"以后每 W2 半量换维持培养液 !次"第 &天加入阿糖胞苷"终浓 度 为 %5;89$#%478皿)=细 胞 培 养 至 !’2"经 ’<’#56789]IV$^_M<&)漂洗 !O#次"&@中性福尔 马林溶液固定 !>"]IV漂洗后"置于 !@甲苯胺蓝染 液中染色 #’5-["?%@酒精分色"WM\干燥"二甲苯透 明"中性树脂封片=行尼氏染色鉴定神经元= !<& 给药及缺氧处理 将培养 !’2的海马神经元 分为四组"即对照组3尼莫地平 %456789组3人参皂 苷 :;#’<’#%556789组和 ’<’%556789组=每组 & 个六孔板"将相应的药物加入细胞培养液中进行孵 育"对照组加等量的维持培养液=缺氧模型的制 备X#Y‘将已分组给药的细胞继续培养 &>后"移入 WM\恒温密闭容器中"连续充以 ?%@AD#B%@CD# 混合气体"流速为 #’5785-["持续 !>= !<% 姬姆萨$S-G5.0)染色 将已经过上述处理的 海马神经元贴片细胞"经甲醇8冰乙酸$a8a)bWc! 混合液固定 !’5-["浸入 S-G5.0染液中 !’5-["晾 干"中性树脂封片= !>?@-大小相当于 56$78或 56$78的整 数倍-提示 *+,在核小体连接处断裂-细胞发生凋 亡(本实验对照组在紫外灯下出现长距离的条带-人 参皂苷 ./0组条带几乎没有-尼莫地平组出现较短 的条带-说明缺氧造成了海马神经元的损伤-而人参 皂苷 ./0有保护细胞免受缺氧损伤的作用( A参考文献B C5D+EF=FG@EH-I=FG+-J=/K@EI-?F=L%*?L=M?>N?K@GN=L>?=FOEN FO?P,58M@=QE>=LR?LLL=M?@GSFO?/?@7ELOE88GR=Q8KTSGLLGUEN/ F@=NTE?NFETRO?QE=ET=8G8FGTETCVD%V+?K@GIRE-533&!0’-5&) 5$$5W5$55% C0D杜其峰-张晨-等 %新生大鼠海马神经细胞原代培养方法的改良 CVD%第二军医大学学报-533X-56!0’)565W56Y% !收稿日期)0$$&W55W56’ Z经验交流Z 中西医结合治疗慢性心功能不全 [5例临床观察 宋鲁成-吕 燕-王红艺 !山东省千佛山医院-山东济南 0&$$5[’ 0$$5;0$$[年-我们采用中西医结合方法治疗慢性心功 能不全 [5例-疗效满意(现

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如下( 临床资料)本文 X3例患者-其中男 [&例2女 Y[例-年龄 Y\;X&岁2平均 \Y]6岁(基础病)冠心病 [6例-高血压病 03 例-风心病 0例(病程 &个月;53=(心功能按 +^ _,分级-‘ 级 50例-a级 &6例-b级 3例(左心衰竭 [\例-右心衰竭 5X 例-全心衰竭 5\例(随机分为治疗组 [5例和对照组 Y6例-两 组一般资料具有可比性( 方法)对照组采用常规治疗-低流量吸氧2抗感染(卡托普 利 0&Q/c次-Y次c>口服d倍他乐克 50%&Q/c次-0次c>口服d 速尿 0$Q/c次-0次c>口服d氯化钾 5%$/c次-0次c>口服(另 外-根据患者病情需要给予地高辛 $%50&Q/c次-5次c>口服( 必要时可给予极化液 5次c>静滴(治疗组在常规治疗的基础 上用益气活血利水方治疗-处方)党参 0&/2生黄芪 [$/2葛根 Y$/2丹参 Y$/2麦冬 5$/2五味子 Y/2茯苓 0&/2泽泻 0&/2冬瓜 皮 Y$/2当归 5$/2陈皮 5$/(痰多呈泡沫状2喘促不安者加葶 苈子2桑白皮-胸痛者加瓜蒌2薤白-形寒肢冷者加制附子(浓 煎取液 [$$QL-每次 0$$QL-分 0次口服(两组均以 5&>为一个 疗程-两个疗程后统计疗效( 疗效标准)显效)症状明显减轻-颈静脉怒张消失-两肺湿 罗音明显减少-水肿完全消退-心功能进步 0级以上d好转)症 状减轻-颈静脉怒张减轻-两肺湿罗音减少-心功能进步 5级d 无效)症状未减轻-心功能无明显改善甚至恶化( 结果)治疗组显效 6例-好转 Y$例-无效 Y例-总有效率 30%\64d对照组分别为 \25625[例-\Y%5&4(两组有效率比 较有显著性差异!"#$%$&’( 讨论)慢性心功能不全属于中医的心悸2怔忡2喘证和胸 痹等范畴(其病变在心-与肺脾肾关系密切-证属本虚标实-以 心脾肾三脏之虚为本-以痰饮2瘀血为标-治疗当标本同治(益 气活血利水方中党参2黄芪益气健脾养心-化气行水d丹参2当 归活血化瘀通利脉道d葛根升举清阳以降饮d茯苓2泽泻和冬 瓜皮健脾渗水利湿d麦冬2五味子和党参相配益气养阴并可防 渗利药物伤阴(现代药理研究证实-党参2黄芪以及生脉散均 可增加心肌收缩力( 卡托普利治疗慢性心力衰竭主要通过抑制激肽酶‘-抑 制缓激肽降解-从而提高缓激肽水平而扩张血管(速尿通过利 尿而遏制心力衰竭的钠潴留-减少静脉回流而减轻肺淤血-减 低前负荷而改善心脏功能(倍他乐克可防止心肌重塑的加速- 防止心肌病的发展(正性肌力药可以增加心肌收缩力-减慢心 率-提高射血分数-减轻心衰患者的临床症状(因此-中西药合 用疗效满意( !收稿日期)0$$&W$&W$3’ 30 山东医药 0$$\年第 [\卷第 X期 万方数据 人参皂苷对体外培养的缺氧海马神经元的预防保护作用 作者： 李安庆， 王双燕， 王守彪， 沈若武 作者单位： 李安庆(淄博市临淄区人民医院,山东,淄博,255400)， 王双燕,王守彪,沈若武(青岛大学医 学院) 刊名： 山东医药 英文刊名： SHANDONG MEDICAL JOURNAL 年，卷(期)： 2006，46(7) 引用次数： 0次 参考文献(2条) 1.Nitatori T.Sato N.Waguri S Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis 1995(15) 2.杜其峰.张晨 新生大鼠海马神经细胞原代培养方法的改良 1997(2) 相似文献(7条) 1.期刊

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王守彪.王双燕.沈若武.金毅.Wang Shoubiao.Wang Shuangyan.Shen Ruowu.Jin Yi 人参皂苷Rg2对体 外培养的海马缺氧神经元的预防保护作用 -神经解剖学杂志2006,22(1) 为观察人参皂苷Rg2对缺氧大鼠海马神经元的保护作用,选取Wistar大鼠海马神经元体外培养14 d,随机分为对照组、5μmol/L尼莫地平组(尼莫地平 组)、Rg2 0.025 mmol/L组(Rg21组)、Rg2 0.050 mmol/L组(Rg22组).将相应药物加入到培养液中孵育4 h后,建立急性缺氧细胞模型.采用流式细胞仪检测 各组神经元缺氧后的细胞凋亡情况,用酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)的含量,并对所得结果加以比较.结果发现 ,离体条件下人参皂苷Rg2可显著增强海马神经元的活性,降低其凋亡率及死亡率;提高细胞上清液中超氧化物歧化酶的活性,降低MDA及NO的含量,且呈量效 比例关系.以上结果提示,人参皂苷Rg2在体外有抗缺氧损伤的作用.其作用机制可能是通过抑制细胞凋亡、提高抗氧化酶的活力、清除自由基而发挥作用. 2.学位论文 张荔 拟VD大鼠学习记忆与NMDA、AMPA受体亚单位、离子通道关系探讨及人参皂苷Rg<,2>的干预 2006 目的：在慢性脑低灌注拟血管性痴呆(VD)大鼠模型上，探讨相关兴奋性氨基酸受体-谷氨酸受体的离子型受体NMDA受体亚型NR1、NR2A、NR2B和 AMPA受体亚型GluR2的基因表达和对学习记忆影响关系的可能机制和人参皂苷Rg2干预作用以及人参皂苷Rg2对脑神经元电压门控K+、Na+、Ca2+离子通道 的影响。兴奋性氨基酸(EAA)在血管性痴呆(Vasculardementia，VD)的发病机制中起着一定的作用，其中谷氨酸可能起着更重要的作用。由于谷氨酸 (Glu)及其受体(GluR)参与了突触的发生、延伸及以突触可塑性为生理基础的学习、记忆等过程的诸多机制，而且Glu的神经毒性通过它的受体发挥作用 ，所以探讨GluR的异常与痴呆的发病关系具有十分重要的意义。 VD为一临床常见慢性进行性疾病，主要与缺血性脑病有关。脑缺血后钠、钾和钙 离子通道的通透性异常和神经细胞内外离子平衡的紊乱是缺血性脑损伤的重要机制之一，离子稳态的失衡发生在缺血的早期阶段，引发了随后的一系列 级联反应，最终导致VD患者出现智力和行为的异常。该病的发生机制复杂，目前尚未完全阐明，迄今为止尚无理想的治疗VD的有效药物，因此我们探讨 上述机制的同时，还观察了人参皂苷Rg2的干预作用，分析其神经保护作用的可能途径。 方法：(1)2-VO法(双侧颈总动脉永久性结扎)造成慢性脑 低灌注前脑缺血，制成拟血管性痴呆大鼠模型。(2)动物模型评价标准及检测方法：手术后1d，分别对术后大鼠进行卒中指数、神经病学症状评定。 (3)开场行为(Openfiled)法：分别给予不同剂量的人参皂苷治疗，并与钙拮抗剂尼莫地平进行对照。术后5d，检测模型大鼠的探究反应和自发活动。用 以检测其行为变化及为下一步水迷宫作准备。(4)水迷宫(Watermaze)行为学检测：Openfiled之后，然后分别于术前、术后6、7d采用水迷宫法检测各组 大鼠行为变化。(5)RT-PCR方法，以β-actin为内参，检测NMDAR1、NR2A、NR2B、GluR2的mRNA水平表达的变化。(6)在以上研究的基础上，用膜片钳技术 进一步观察人参皂苷Rg2对脑神经元电压门控K+、Na+、Ca2+离子通道的影响。 结果：(1)通过对动物模型卒中指数和神经病学症状观察，证明带有 血管性痴呆行为特征的动物模型成功。(2)Openfield试验显示：模型鼠垂直运动和水平运动均减少，与假手术鼠相比有显著性差异(P＜0.01)。 (3)Watermaze检测：学习和记忆能力明显降低，表现为：模型组信息游泳时间延长，选择游泳时间延长，正确率降低，与正常组及假手术组比较有显著 性差异(P＜0.01)。(4)人参皂苷Rg22.5，5，10mg/kg可以剂量依赖性缩短大鼠的信息游泳和选择游泳时间，和模型组相比有显著性差异，尼莫地平未见 明显缩短大鼠的信息游泳和选择游泳时间。(5)采用RT-PCR方法，以β-actin为内参，模型组与正常组相比，NMDAR1表达增强(P＜0.05)，而NR2A、 NR2B、GluR2的表达减弱(P＜0.01)；与模型组相比，人参皂苷Rg2组NMDAR1基因表达减弱(P＜0.01)，而NR2A、NR2B、GluR2表达增强 (P＜0.05，0.01)；尼莫地平组未见明显改变。(6)在非缺氧条件下，膜片钳显示人参皂苷Rg2对正常海马神经元细胞K+、Na+、Ca2+离子通道无明显影响 。 结论：(1)本研究证实了慢性脑低灌注拟血管性痴呆大鼠的探究能力和自发活动显著降低、学习记忆能力下降，脑组织NMDAR1的基因表达增强、 而NR2A、NR2B、GluR2降低。(2)人参皂苷Rg2通过调控NR1，NR2A，NR2B，GluR2相关基因的表达，减轻兴奋性氨基酸的毒性，对拟血管性痴呆大鼠学习记 忆能力及行为学障碍有显著的改善作用。(3)人参皂苷Rg2对正常脑神经元电压门控K+、Na+、Ca2+离子通道无明显影响。非缺氧状态下，其作用不是通过 影响离子通道而产生神经保护作用的。 3.期刊论文 田建明.郑淑秋.郭伟芳.叶金梅.李浩.李龙云 人参皂苷Rg2对心肌细胞搏动幅度和存活率的影响 -中国 新药杂志2003,12(11) 目的:研究人参皂苷Rg2对心肌细胞搏动幅度和存活率的影响.方法:采用体外培养心肌细胞法,制备心肌细胞缺氧缺糖模型.结果:人参皂苷Rg2在10和 40μmol·L-1浓度时对正常培养心肌细胞搏动幅度和存活率无影响,而对缺氧缺糖心肌细胞均有增加搏动幅度和存活率的作用,但其增加搏动幅度作用不 及毒毛花苷G(Str),而其存活率在相同浓度下(10μmo·L-1)略高于Srt.结论:人参皂苷Rg2明显增加缺氧缺糖心肌细胞搏动幅度和存活率. 4.学位论文 王双燕 人参皂苷Rg<,2>对体外培养的大鼠海马缺氧神经元的预防保护作用 2005 目的:采用体外培养海马神经元的方法，研究人参皂苷对缺氧大鼠海马神经元的预防保护作用。脑缺血是临床上常见的一种疾病，流行病学调查表明 ，脑卒中同肿瘤，心脏病一起成为疾病的三大死因，而且脑卒中发病后的幸存者中70﹪存在不同程度的残疾，给家庭、社会带来了沉重的负担。经典理 论认为，中枢神经系统损伤后不能恢复，但随着科技手段和分子生物学的高速发展，许多学者证实，当给损伤的中枢神经提供适当的条件后中枢神经系 统也是能够恢复的，从而使人们认识到对脑缺血的治疗和预防是可行的。本实验着重探讨：人参皂苷Rg2在脑缺血中的保护作用及机制，寻求预防和治疗 脑缺血发生的药物。 　　方法:出生1～3天的新生Wister大鼠，分离双侧海马组织，消化，接种，培养。选用10～14d的海马神经元，将不同剂量的人 参皂苷Rg2及对照药物尼莫地平加入到培养液中，4小时后建立95﹪N2+5﹪CO2混合气体急性缺氧模型。台盼兰染色细胞计数法测定细胞活性；流式细胞仪 测定细胞凋亡率；荧光分光光度计法测胞内[Ca2+]i含量；吉姆萨染色法从形态上观察凋亡情况并计数测凋亡率；DNALadder测定细胞凋亡程度及凋亡率 以及酶法测定抗氧化酶(超氧化物岐化酶)的抗氧化能力及丙二醛、NO的含量。 　　结论:人参皂苷Rg2对体外培养大鼠海马神经元有抗缺氧损伤的作用 。其作用机制可能是通过减少Ca2+内流，抑制细胞凋亡，提高抗氧化酶的活力，清除自由基，而发挥作用。 5.学位论文 张敏 脑缺血再灌注大鼠学习记忆与海马NMDA受体亚单位表达关系的探讨及人参皂苷Rg<,2>的干预 2006 目的：利用pulsinelli四血管法体建立脑缺血，再灌注损伤模型，观察前脑(海马)缺血损伤后谷氨酸(Glu)、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体亚单 位NR<,1>、NR<,2B>表达的变化及学习记忆的改变，从兴奋性氨基酸的兴奋毒作用尤其是其受体的表达方面探讨脑缺血，再灌注损伤引起的学习记忆功能 障碍的发生机制，并观察人参皂苷Rg<,2>对脑缺血缺氧损伤引起的学习记忆障碍的干预机制。 方法：本实验采用pulsinelli四血管法烧灼阻断大 鼠椎动脉，暂时夹闭颈总动脉制备大鼠前脑缺血，再灌注损伤模型，SD大鼠56只，随机分成7组(各8只)。人参皂苷高剂量组(10.0mg/kg注射)中剂量组 (5.0mg/kg注射)、低剂量组(2.5mg/kg注射)。通过水迷宫大体动物行为学检测大鼠学习记忆能力的改变、免疫组织化学和图象分析方法观察神经元细胞 Glu、NR<,1>和NR<,2B>的表达及人参皂苷Rg<,2>干预作用。 结果：前脑(海马)脑缺血/再灌注损伤模型组大鼠谷氨酸释放量比假手术组明显增加 ，NR1/NR2B表达增强，人参皂苷Rg<,2>干预组的表达则明显减弱，差别比较有统计学意义(P<0.01)。人参皂苷Rg<,2>中高剂量组水迷宫逃避潜伏期明显 缩短，与模型组比较差别有统计学意义(P<0.01)。 结论：脑缺血/再灌注损伤后，能量代谢紊乱诱发谷氨酸的大量释放，过度激活NMDA受体 ，NR<,1>/NR<,2B>亚单位表达增强，致受体功能发生变化，引起细胞内Ca<'2+>超载，介导了细胞内一系列依赖Ca<'2+>的生化反应，导致神经元损伤 ，大鼠学习记忆能力降低。人参皂苷Rg<,2>可通过抑制谷氨酸释放，干预兴奋性氨基酸受体亚单位的表达和影响受体的功能变化，从而发挥脑缺血再灌 注损伤后学习记忆功能的保护作用。 6.期刊论文 王双燕.王守彪.沈若武.李安庆.杨学伟 人参皂苷对体外培养低氧海马神经元的保护作用 -青岛大学医 学院学报2006,42(1) 目的观察人参皂苷(Rg2)对大鼠低氧海马神经元的保护作用及其机制.方法取新生Wistar大鼠海马神经元体外培养14 d,随机分为对照组、5μmol/L尼 莫地平组(尼莫地平组)、Rg2 0.025 mmol/L组(Rg2 1组)、Rg2 0.050 mmo1/L组(Rg2 2组).将相应药物加入到培养液中孵育4 h后,连续充以体积分数0.95 N2+体积分数0.05 CO2混合气体,建立急性低氧细胞模型.台盼蓝染色计数存活细胞,吉姆萨染色观察细胞形态,荧光分光光度计法测细胞内Ca2+浓度.结果 尼莫地平组、Rg2两个剂量组的细胞死亡率均明显低于对照组,以Rg22组最低,差异均有显著性(χ2=3.37,P<0.05).海马神经元细胞内Ca2+浓度在尼莫地平 组、Rg2两个剂量组均明显低于对照组,以Rg2 2组最低,差异均有显著性(F=466.58,q=6.76～48.82,P<0.01).结论 Rg2可显著降低体外培养大鼠低氧海马 神经元的细胞死亡率,其机制可能是通过减少Ca2+内流而发挥作用. 7.学位论文 赵冰 拟人参皂苷元对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用 2008 目的：缺血性脑血管疾病(ischemia cerebralvascular dieases，ICVD)是一类常见的严重危害人类健康的疾病，其发病的病理生理机制复杂，涉及 环节多，且尚无公认的有效治疗药物。因此对其发病机制的研究及积极寻找有效药物显得尤为重要。众所周知，溶栓及脑保护治疗仍然是治疗缺血性脑 血管疾病的两大主要治疗手段，而中药及其有效成分在缺血性脑血管病治疗中的作用正逐渐受到重视。 人参具有“大补元气，复脉固脱，补脾益 肺，生津安神”之功效，药用历史悠久。近代医学研究证明，人参含有人参皂苷(ginsenoside)、人参素、人参烯、脂肪酸、挥发油、维生素、酶等多种 成分。其中人参皂苷的研究较多，其抗衰老、抗炎症、调节机体免疫功能、抗肿瘤、清除自由基损伤、抑制神经细胞凋亡等的作用已经得到了肯定。研 究发现20(S)-人参皂苷Rg3具有良好的抗脑缺血、保护神经细胞的作用，并且对缺血脑细胞线粒体的损伤也有明显的保护作用。Kim等研究显示，人参皂 苷单体在谷氨酸诱导的神经元缺氧模型中具有保护大鼠皮层细胞的作用，还能抑制海马神经元中NMDA受体介导的信号传递。 拟人参皂苷元 (Ocotillol，Ocot)是从人参皂苷的碱降解成分中分离得到一种新型的半合成辛醇型人参皂苷，是拟人参皂苷Fu的衍生物，后者为原人参三醇型皂苷—人 参皂苷Rg2的侧链双键氧化环合产物，在体内具有相当的稳定性。作为传统中药的有效单体成分，本研究通过观察拟人参皂苷元对局灶性脑缺血大鼠行为 学评分、脑梗死面积、脑组织病理学改变、血清与脑组织匀浆SOD、T-AOC、GSH-Px活性以及MDA含量等的影响，明确其对脑缺血性损伤的影响，并探讨其 作用机制。 方法：wistar大鼠240只，随机分成假手术组、缺血损伤组、尼莫地平组、拟人参皂苷元1.25、2.5、5、10、20mg·kg-1剂量组，共 8组。缺血前分别给予尼莫地平6mg·kg-1，拟人参皂苷元1.25、2.5、5、10、20mg·kg-1，假手术组、缺血损伤组分别给予等容量质量分数为0.5％的羧 甲基纤维素钠(CMC-Na)，灌胃7d，末次给药1h后制备大鼠大脑中动脉栓塞局灶性缺血模型(MCAO)，12h后进行大鼠行为学评分，测定大鼠脑梗死面积并进 行脑组织病理观察，测定血清与脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。 结果：大鼠脑缺血12h后，行为学评分升高，脑组织出现大面积梗死灶，且MDA含量显著增加，SOD、T-AOC、GSH-Px活力显著降低。拟人参皂苷元 (5mg·kg-1)能显著降低行为学评分，减小脑梗死面积，改善缺血损伤所致的脑组织病理形态学改变，降低血清与缺血脑组织中MDA含量，升高SOD、T- AOC、GSH-Px的活性。 结论：拟人参皂苷元对大鼠局灶性脑缺血损伤具有明显保护作用。该作用可能与抑制脂质过氧化、提高抗氧化酶活性有关。 拟人参皂苷元有希望开发成具有自主产权的治疗缺血性脑血管病的药物。 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_shandyy200607013.aspx 下载时间：2010年2月3日