青霉素

第二节抗生素生产工艺现代抗生素工业生产过程如下：图2-1现代抗生素生产工艺一般工艺流程图1、菌种从来源于自然界土壤获得能产生抗生素的微生物，经过分离、选育和纯化后即为菌种。菌种可用冷冻干燥法制备后，以超低温，即在液氮冰箱(─190℃～─196℃)内保存。所谓冷冻干燥是用脱脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混在一起，经真空冷冻、升华干燥后，在真空下保存。如条件不足时，则沿用砂土管在0℃冰箱内保存的老方法，但如需长期保存时不宜用此法。另外，也可采用液体石蜡或斜面低温保藏法等保存。同时必须经常进行菌种选育和纯化以防生产用菌株经多次传代后发生退化变异。二、孢子制备生产用的菌株须经纯化和检验，若符合规定，才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，通过严格的无菌操作，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定温度下培养5～7日或7日以上，这样培养出来的孢子数量还是有限的。为获得更多数量的孢子以供生产需要，必要时可进一步用扁瓶在固体培养基(如小米、大米、玉米粒或麸皮)上扩大。三、种子制备其目的是使孢子发芽、繁殖以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中，种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进行逐级扩大培养，或直接将孢子接入种子罐后逐级放大培养。种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。扩大培养级数通常为二级。摇瓶培养是在锥形瓶内装入一定数量的液体培养基，灭菌后以无菌操作接入孢子，放在摇床上恒温培养。在种子罐中培养时，在接种前有关设备和培养基都必须经过灭菌。接种材料为孢子悬浮液或来自摇瓶的菌丝，以微孔差压法或打开接种口在火焰保护下按种。接种量视需要而定。如用菌丝，接种量一般相当于0.1%～2%(接种量的百分比，系对种子罐内的培养基而言，下同)。从一级种子罐接入二级种子罐接种量一般为5%～20%，培养温度一般在25～30℃。如菌种系细菌，则在32～37℃培养。在罐内培养过程中，需要搅拌和通入无菌空气。控制罐温、罐压，并定时取样作无菌试验，观察菌丝形态，测定种子液中发酵单位和进行生化分析等，并观察无杂菌情况。种子质量如合格方可移种到发酵罐中。四、培养基的配制在抗生素发酵生产中，由于各菌种的生理生化特性不一样，采用的工艺不同，所需的培养基组成亦各异。即使同一菌种，在种子培养阶段和不同发酵时期，其营养要求也不完全一样。因此需根据其不同要求来选用培养基的成分与配比。其主要成分包括碳源、氮源、无机盐类(包括微量元素)和前体等。1．碳源主要用以供给菌种生命活动所需的能量，构成菌体细胞及代谢产物。有的碳源还参与抗生素的生物合成，是培养基中主要组成之一，常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂类。对有的品种，为节约成本也可用玉米粉作碳源以代淀粉。使用葡萄糖时，在必要时采用流加工艺，以有利于提高产量。油脂类往往还兼用作消沫剂。个别的抗生素发酵中也有用麦芽糖、乳糖或有机酸等作碳源的。2．氮源主要用以构成菌体细胞物质(包括氨基酸、蛋白质、核酸)和含氮代谢物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。氮源可分成两类：有机氮源和无机氮源。有机氮源中包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉。玉米浆、蛋白胨、尿素、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉和菌丝体等。无机氮源中包括氨水(氨水既作为氮源，也用以调节pH)、硫酸铵、硝酸盐和磷酸氢二氨等。在含有机氮源的培养基中菌丝生长速度较快，菌丝量也较多。3．无机盐和微量元素抗生素产生菌和其他微生物一样，在生长、繁殖和产生生物产品的过程中，需要某些无机盐类和微量元素，如硫、磷、镁、铁、钾、钠、锌、铜、钴、锰等，其浓度与菌种的生理活性有一定影响。因此，应选择合适的配比和浓度。此外，在发酵过程中可加入碳酸钙作为缓冲剂以调节pH。4．前体在抗生素生物合成中，菌体利用它以构成抗生素分子中的一部分而其本身又没有显著改变的物质，称为前体(precursor)。前体除直接参与抗生素生物合成外，在一定条件下还控制菌体合成抗生素的方向并增加抗生素的产量。如苯乙酸或苯乙酰胺可用作为青霉素发酵的前体。丙醇或丙酸可作为红毒素发酵的前体。前体的加入量应当适度。如过量则往往产生毒性，并增加了生产成本。如不足，则发酵单位降低。此外，有时还需要加入某种促进剂或抑制剂，如在四环素发酵中加入M-促进剂和抑制剂溴化钠，以抑制金霉索的生物合成并增加四环素的产量。5．培养基的质量培养基的质量应予严格控制，以保证发酵水平，可以通过化学分析，并在必要时作摇瓶试验以控制其质量。培养基的储存条件对培养基质量的影响应予注意。此外，如果在培养基灭菌过程中温度过高、受热时间过长亦能引起培养基成分的降解或变质。培养基在配制时调节pH亦要严格按规程执行。五、发酵目的是使微生物大量分泌抗生素。一般接种量为10%。1．温度控制温度控制的选择：一般来说，生长温度与生产温度控制有所差别。不同温度将引起向不同的生物合成方向发展。因此，在发酵工艺控制上对温度的掌握要引起注意。通常情况下，在不影响生物合成方向改变的情况下，高温有利于生长，低温有利于生产，但并不绝对。2．溶氧控制好气性微生物深层培养时需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些代谢产物的合成，对多数发酵来说，氧的不足会导致代谢异常，产量降低。一般可通过下述方法提高溶氧：①加大通气量；②适当降低温度；③提高压力；④补水；⑤提高搅拌转速等。3．pH控制每一类菌都有其最适的和能耐受的pH范围。pH变化会引起各种酶活力的改变，从而影响酶与底物的结合；影响细胞膜电荷，膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；引起菌体的代谢过程的不同，影响菌体的生长和产物的合成。虽然菌体本身具有一定调节pH的能力，但往往难以满足生产需求，可通过加入具有缓冲能力的物质或流加氨水、尿素等方法加以调节。无机酸碱调节pH最方便、省事，但也是最无奈的办法。生理酸碱性物质调节pH最困难，不易把握，但只要对症，效果最佳。4．消泡泡沫大都是由蛋白质等易起泡的成份所引起。泡沫大量产生，造成“逃液”现象，给发酵带来严重危害。常利用机械消沫、消沫剂消沫等方法控制泡沫。消沫剂在发酵工程是不可缺少的控制剂，但应越少越好，不可盲目使用，否则，会带来一些副作用。5．抽样检测定时采样进行生化分析、镜检，测定菌体浓度、残糖量、抗生素含量等。六、发酵液的过滤和预处理发酵液的过滤和预处理的目的不仅在于分离菌丝，还需将一些杂质除去。预处理主要去除高价无机离子和蛋白质，过滤主要去除固形物及菌体。1．发酵液的预处理可采用草酸及磷酸去除高价离子钙、镁等。如加草酸与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵液的质量。如加磷酸（或磷酸盐），则既能降低钙离子浓度，也易去除镁离子。Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+加黄血盐有利于去除铁离子，加硫酸锌有利于凝固蛋白质。此外，这二者还有协同作用。它们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。2K4Fe（CN）6+3ZnSO4→K2Zn3[Fe（CN）6]2↓+3K2SO4去除蛋白质可利用等电点法、加热法、絮凝法。（1）利用蛋白质在等电点时凝聚的特点将其除去。（2）某些对热稳定的抗生素发酵液还可用加热法，使蛋白质变性而降低其溶解度。（3）为了更有效地去除发酵液中的蛋白质，还可以加入絮凝剂。絮凝剂分子中电荷密度很高，它的加入使胶体溶液电荷性质改变从而使溶液中蛋白质絮凝。在发酵液中多数胶体离子带正电荷，因而用阳离子絮凝剂功效最高。2．发酵液的过滤宜选用鼓式真空过滤机，如用板框过滤机则劳动强度大，影响卫生，菌丝流入下水道时还影响污水处理。必要时，可在转鼓表层涂以助滤剂硅藻土。另一种设备是自动出渣离心机，但所排出的菌丝滤液中还含有较大量的发酵液，因此如要提高过滤收率，可将此滤渣以水洗后再次以同样型号离心机分离。第一次和第二次离心分离液合并后进入下一工序。再一种设备称倾析器。它既可用于固、液相的分离，也可用于固相、有机溶媒相和水相三者的混合和分离，从而将过滤菌丝和溶媒萃取合并在这一设备中完成。这就简化了发酵液后处理工艺，提高了收率，并缩短了生产周期也降低了成本。七、抗生素的提取常用的抗生素提取方法包括有溶媒萃取法、离子交换法、吸附法和直接沉淀法等。1．溶媒萃取法也叫溶剂萃取法。将培养液（如发酵滤液）和与水不相溶的有机溶剂（如有机溶媒）混合，使抗生素转入有机溶剂中去以达到浓缩和提纯的目的。所选用的溶媒与水应是互不相溶或仅有很小部分相溶，同时所选溶媒在一定pH下对于抗生素应有较大的溶解度和选择性。此法在抗生素工业中广泛应用。目前一些重要的抗生素，如青霉素、红霉素、林可霉素等均可采用此法进行萃取。2．离子交换法这是利用某些抗生素能解离为阳离子和阴离子的特性，使其与离子交换树脂进行交换，将抗生素吸附在树脂上，然后在以适当的条件将抗生素从树脂上洗脱下来，以达到浓缩和提纯的目的。应选用对抗生素有特殊选择性的树脂，使抗生素的纯度通过离子交换有较大的提高。由于此法成本低、设备简单、操作方便，已成为提取抗生素的重要方法之一。如链霉素、庆大霉素、卡那霉素、多黏菌素等均可采用离子交换法。但此法不适用于在pH大幅度变化时，稳定性较差的抗生素等。3．吸附法利用各种吸附剂（如活性炭、大孔树脂等）吸附培养中的活性物质，而后用适宜的有机溶剂（如甲醇、丙酮）或它们的水溶液从吸附剂上洗脱活性物质。必要时可加入稀酸或稀氨水帮助洗脱。4．直接沉淀法有些活性物质（如四环素）可从培养液中借助pH的调节而沉淀下来；有的也可借加入与水相溶的有机溶剂（如丙酮）而沉淀；还有的可借加入某种离子与活性物质形成复合物而沉淀，例如四环类抗生素与尿素形成的复合物沉淀。该法是提取抗生素的方法中最简单的一种。八、抗生素的精制这是抗生素生产最后工序。对产品进行精制、烘干和包装的阶段要符合“药品生产管理规范”（即GMP）的规定。1．脱色色素是在发酵过程中产生的代谢产物，它与菌种及发酵条件有关。可用活性炭脱色。另外，也可采用脱色树脂去除色素（如酚醛树脂）。2．去除热原质热原质是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。革兰氏阴性菌(G-)产生的热原反应高于革兰氏阳性菌(G+)。热原是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体，容易引起恶寒高热，甚至休克。生产中常用活性炭脱色去除热原，但须注意脱色时pH、温度、炭用量、脱色时间等因素，还应考虑它对抗生素的吸附问题，否则影响收率。对某些产品可用超微过滤法去除热原。此外，还应加强在生产过程中的环境卫生以防止热原。脱色及去除热原质是精制注射用抗生素中不可缺少的一步。它关系到成品的色级及热源试验等质量指标。3．结晶和重结晶抗生素精制常用此法来制得高纯度成品。常用的方法有：改变温度结晶、利用等电点结晶、加成盐剂结晶、加入不同熔剂结晶。4．其他精制方法精制抗生素还可采用共沸蒸馏法、柱层析法、盐析法、中间盐转移法、分子筛等。抗生素在目前的制药工业中仍占有举足轻重的地位，尤其是下游半合成抗生素的发展，进一步刺激了上游的工业发酵。一些抗生素的工业生产规模非常大，如β-内酰胺类的青霉素、头孢菌素C，大环内酯类的红霉素、利福霉素，氨基环醇类的链霉素、庆大霉素。其它的一些抗生素，如林可霉素、四环素、金霉素、万古霉素等，单个发酵罐容积越来越大，100m3的发酵罐被普遍采用，200m3甚至更大容积的发酵罐经常可见报道。　　抗生素的工业生产包括发酵和提取两部分。工艺流程大致如下：菌种的保藏、孢子制备、种子制备、发酵、提取和精制。　　种子和发酵培养基的常用碳源有：葡萄糖、淀粉、蔗糖、油脂、有机酸等，主要为菌体生长代谢提供能源，为合成菌体细胞和目的产物提供碳元素。有机氮源多用玉米浆、黄豆饼粉、麸质粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等，硫酸铵、尿素、氨水、硝酸钠、硝酸铵则是常用的无机氮源。另外，培养基中还得添加无机盐、微量元素以及消沫剂，部分抗生素还得加入特殊前体，如青霉素的前体是苯乙酸，大环内酯类抗生素的前体是丙酸盐。发酵过程普遍补加一种碳源、氮源物质，如葡萄糖和硫酸铵。pH值通过流加氨水进行调节，很多抗生素在发酵中后期流加前体，对提高产量非常有益。抗生素发酵绝大多数为好氧培养，必须连续通入大量无菌空气，全过程大功率搅拌。发酵液的预处理，一般加絮凝剂沉淀蛋白，过滤去除菌丝体，发酵滤液的提取常用溶媒萃取法、离子交换树脂法、沉淀法、吸附法等提纯浓缩，然后结晶干燥得纯品。　　下面以青霉素为例介绍抗生素的生产：　　1、青霉素概述　　1.1青霉素的研究　　最初青霉素的生产菌是音符型青霉菌，生产能力只有几十个单位，不能满足工业需要。随后找到了适合于深层培养的橄榄型青霉菌，即产黄青霉（P.chrosogenum），生产能力为100U/ml。经过X、紫外线诱变，生产能力达到1000－1500U/ml。随后经过诱变，得到不产生色素的变种，目前生产能力可达66000－70000U/ml。青霉素是抗生素工业的首要产品。中国为青霉素（penicillin）生产大国，国内生产的青霉素，已占世界产量的近70%，国内较大规模的生产企业有华药、哈医药、石药、鲁抗，单个发酵罐规模均在100m3以上，发酵单位在70000U/ml左右，而世界青霉素工业发酵水平达100000U/ml以上。　　1.2青霉素的作用机理　　作用于细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段，线性肽多糖在转肽酶的催化下进行交联，肽多糖链之间每两条肽链结合时均释放出一个D－丙氨酸，青霉素中与肽多糖的D－丙胺酰－D－丙氨酸二肽相似，竞争性的与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。　　1.3青霉素应用　　临床应用：40多年，主要控制敏感金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。优点：毒性小，但由于难以分离除去青霉噻唑酸蛋白（微量可能引起过敏反应），需要皮试。　　各种半合成抗生素的原料：青霉素的缺点是对酸不稳定，不能口服，排泄快，对阴性菌无效。氨苄青霉素耐酸广谱；对抗绿脓杆菌的磺苄青霉素，耐酸、耐酶、口服的乙氧萘青霉素等。提供头孢菌素母核。　　1.4青霉素的分子结构及其衍生物　　青霉素是6－氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanicacid,6-APA）苯乙酰衍生物。侧链基团不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素G。工业上应用的有钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺盐。2、青霉素生产菌的生物学特性　　2.1生物学特性　　形成绿色孢子和黄色孢子的两种产黄青霉（Penicilliumchrosogenum）菌株；深层培养中菌丝形态为球状和丝状两种，我国生产上采用的是丝状。　　菌落：平坦或皱褶，圆形，边沿整齐或锯齿或扇形。气生菌丝形成大小梗，上生分生孢子，排列程链状，似毛笔，称为青霉穗。孢子黄绿至棕灰色。圆形或圆柱形。　　2.2发酵条件下的生长过程　　第1期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。　　第2期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。　　第3期：形成脂肪包涵体，机理贮藏物，没有空泡，嗜碱性很强。　　第4期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。　　第5期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。　　第6期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状。释放游离氨，pH上升。　　第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。　　镜检：规定时间取样，显微镜观察7个时期的形态变化，控制发酵。　　1－4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。　　4－5期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。　　在第6期到来之前结束发酵。　　3、青霉素的发酵工艺过程　　3.1青霉素生产流程　　3.2发酵工艺过程　　（1）生产孢子的制备　　将砂土保藏的孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经传代活化。最适生长温度在25～26℃，培养6～8天，得单菌落，再传斜面，培养7天，得斜面孢子。移植到优质小米或大米固体培养基上，生长7天，25℃，制得小米孢子。每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。　　（2）种子罐和发酵罐培养工艺　　种子培养要求产生大量健壮的菌丝体，因此，培养基应加入比较丰富的易利用的碳源和有机氮源。青霉素采用三级发酵一级种子发酵：发芽罐.小罐，接入小米孢子后，孢子萌发，形成菌丝。培养基成分：葡萄糖，蔗糖，乳糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。通无菌空气，空气流量1：3（体积比）；充分搅拌300－350r/min；40～50小时；pH自然，温度27±1℃。　　二级发酵罐：繁殖罐.大量繁殖。玉米浆、葡萄糖等。1：1－1.5；250－280r/min；pH自然，25±1℃；0－14h。　　三级发酵罐：生产罐。花生饼粉（高温），麸质粉、玉米浆、葡萄糖，尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰胺及消泡剂，CaCO3等。接种量为12～15%。青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通气比控制0.7～1.8；150－200r/min；要求高功率搅拌，100m3的发酵罐搅拌功率在200～300Kw，罐压控制0.04～0.05MPa，于25～26℃下培养，发酵周期在200h左右。前60h，pH5.7～6.3，后6.3～6.6；前60h为26℃，以后24℃。　　3.3发酵过程控制　　反复分批式发酵，100m3发酵罐，装料80m3，带放6－10次，间隔24h。带放量10％，发酵时间204h。发酵过程需连续流加补入葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。　　在青霉素的生产中，让培养基中的主要营养物只够维持青霉菌在前40h生长，而在40h后，靠低速连续补加葡萄糖和氮源等，使菌半饥饿，延长青霉素的合成期，大大提高了产量。所需营养物限量的补加常用来控制营养缺陷型突变菌种，使代谢产物积累到最大。　　（1）培养基　　青霉素发酵中采用补料分批操作法，对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加，维持一定的最适浓度。葡萄糖的流加，波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶，葡萄糖浓度调节是根据pH，溶氧或CO2释放率予以调节。　　碳源的选择：生产菌能利用多种碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。经济核算问题，生产成本中碳源占12％以上，对工艺影响很大；糖与6-APA结合形成糖基-6-APA，影响青霉素的产量。葡萄糖、乳糖结合能力强，而且随时间延长而增加。通常采用葡萄糖和乳糖。发酵初期，利用快效的葡萄糖进行菌丝生长。当葡萄糖耗竭后，利用缓效的乳糖，使pH稳定，分泌青霉素。可根据形态变化，滴加葡萄糖，取代乳糖。目前普遍采用淀粉的酶水解产物，葡萄糖化液流加。降低成本。　　氮源：玉米浆是最好的，是玉米淀粉生产时的副产品，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代。补加无机氮源。无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁有毒，控制在30μg/ml以下。　　流加控制：补糖，根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。残糖在0.6％左右，pH开始升高时加糖。补氮：流加酸酸铵、氨水、尿素，控制氨基氮0.05%。　　添加前体：合成阶段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可为青霉素侧链的前体，直接掺入青霉素分子中。也具有刺激青霉素合成作用。但浓度大于0.19％时对细胞和合成有毒性。还能被细胞氧化。策略是流加低浓度前体，一次加入量低于0.1%，保持供应速率略大于生物合成的需要。　　（2）温度　　生长适宜温度30℃，分泌青霉素温度20℃。但20℃青霉素破坏少，周期很长。生产中采用变温控制，不同阶段不同温度。前期控制25－26℃左右，后期降温控制23℃。过高则会降低发酵产率，增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至青霉素的转化得率。有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间，生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。　　（3）pH　　合成的适宜pH6.4－6.6左右，避免超过7.0，青霉素在碱性条件下不稳定，易水解。缓冲能力弱的培养基，pH降低，意味着加糖率过高造成酸性中间产物积累。pH上升，加糖率过低不足以中和蛋白产生的氨或其他生理碱性物质。前期pH控制在5.7～6.3，中后期pH控制6.3～6.6，通过补加氨水进行调节。pH较低时，加入CaCO3、通氨调节或提高通气量。pH上升时，加糖或天然油脂。一般直接加酸或碱自动控制，流加葡萄糖控制。　　（4）溶氧　　溶氧＜30％饱和度，产率急剧下降，低于10％，则造成不可逆的损害。所以不能低于30％饱和溶氧浓度。通气比一般为1：0.8VVM。溶氧过高，菌丝生长不良或加糖率过低，呼吸强度下降，影响生产能力的发挥。适宜的搅拌速度，保证气液混合，提高溶氧，根据各阶段的生长和耗氧量不同，对搅拌转速调整。　　（5）菌丝生长速度与形态、浓度　　对于每个有固定通气和搅拌条件的发酵罐内进行的特定好氧过程，都有一个使氧传递速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上达到平衡的临界菌丝浓，超过此浓度，OUR＞OTR，溶氧水平下降，发酵产率下降。在发酵稳定期，湿菌浓可达15~20%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。另外，因补入物料较多，在发酵中后期一般每天带放一次，每次放掉总发酵液的10%左右。　　有丝状生长和球状生长两种。前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基质及氧接触，比生产率高，发酵粘度低，气/液两相中氧的传递率提高，允许更多菌丝生长。球状菌丝形态的控制，与碳、氮源的流加状况，搅拌的剪切强度及稀释度相关。　　（6）消沫　　发酵过程泡沫较多，需补入消沫剂。天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。少量多次。不适在前期多加入，影响呼吸代谢。　　青霉素的发酵过程控制十分精细，一般2h取样一次，测定发酵液的pH、菌浓、残糖、残氮、苯乙酸浓度、青霉素效价等指标，同时取样做无菌检查，发现染菌立即结束发酵，视情况放过滤提取，因为染菌后pH值波动大，青霉素在几个小时内就会被全部破坏。4、青霉素的提炼工艺过程　　青霉素提纯工艺流程简图：　　青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止降解。　　4.1预处理　　发酵液结束后，目标产物存在于发酵液中，而且浓度较低，如抗生素只有10－30Kg/m3，含有大量杂质，它们影响后续工艺的有效提取，因此必须对其进行的预处理，目的在于浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。是进行分离纯化的一个工序。　　4.2过滤　　发酵液在萃取之前需预处理，发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白，然后经真空转鼓过滤或板框过滤，除掉菌丝体及部分蛋白。青霉素易降解，发酵液及滤液应冷至10℃以下，过滤收率一般90%左右。　　（1）菌丝体粗长10μm，采用鼓式真空过滤机过滤，滤渣形成紧密饼状，容易从滤布上刮下。滤液pH6.27-7.2，蛋白质含量0.05-0.2%。需要进一步除去蛋白质。　　（2）改善过滤和除去蛋白质的措施：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶PPB，0.7%硅藻土为助滤剂。再通过板框式过滤机。滤液澄清透明，进行萃取。　　4.3萃取　　青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调节pH，再转入中性水相，反复几次萃取，即可提纯浓缩。选择对青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2～3次。从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择1.～2.0，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择6.8～7.4。发酵滤液与乙酸丁酯的体积比为1.5～2.1，即一次浓缩倍数为1.5～2.1。为了避免pH波动，采用硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。发酵液与溶剂比例为3～4。几次萃取后，浓缩10倍，浓度几乎达到结晶要求。萃取总收率在85％左右。　　所得滤液多采用二次萃取，用10%硫酸调pH2.0～3.0，加入醋酸丁酯，用量为滤液体积的三分之一，反萃取时常用碳酸氢钠溶液调pH7.0～8.0。在一次丁酯萃取时，由于滤液含有大量蛋白，通常加入破乳剂防止乳化。第一次萃取，存在蛋白质，加0.05-0.1%乳化剂PPB。　　萃取条件：为减少青霉素降解，整个萃取过程应在低温下进行（10℃以下）。萃取罐冷冻盐水冷却。　　4.4脱色　　萃取液中添加活性炭，除去色素、热源，过滤，除去活性炭。　　4.5结晶　　萃取液一般通过结晶提纯。青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，在二次丁酯萃取液中加入醋酸钾-乙醇溶液，青霉素钾盐就结晶析出。然后采用重结晶方法，进一步提高纯度，将钾盐溶于KOH溶液，调pH至中性，加无水丁醇，在真空条件下，共沸蒸馏结晶得纯品。　　直接结晶：在2次乙酸丁酯萃取液中加醋酸钠－乙醇溶液反应，得到结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液，得到青霉素钾盐。　　共沸蒸馏结晶：萃取液，再用0.5MNaOH萃取，pH6.4～4.8下得到钠盐水浓缩液。加2.5倍体积丁醇，16～26℃，0.67～1.3KPa下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥后，得到青霉素产品。