枸杞多糖_牛膝多糖的急性毒性试验

枸杞多糖、牛膝多糖的急性毒性试验 赵德惠 1　何永珍 2　王晓峰 3 3 ( 1 宁夏大武口区隆湖畜牧兽医站 　753400 　2 宁夏平罗县灵沙乡畜牧兽医站 　753407 3 宁夏四正生物工程技术研究中心 　750200 ) 　　枸杞为茄科、茄族、枸杞亚族、枸杞属植物。枸杞子始载 于《神农本草经》,为枸杞的干燥成熟果实 ,历版《中国药典》 均有收载。宁夏枸杞驰名中外 ,誉为我国枸杞的“道地药 材”, 是我国传统名贵药材 , 有“红宝”之称。枸杞多糖 (LBPS)具有免疫、抗衰老、抗肿瘤、降血糖和降血脂、降血 压、保护肝肾等细胞、抗疲劳等作用。牛膝为苋科多年生草 本植物牛膝的干燥根 ,牛膝多糖 (ABPS) 是一种小分子多糖 , 为苋科属植物提取物 ,主要由果糖和葡萄糖组成 ,牛膝多糖 具有提高免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、抗衰老、抑制大肠杆 菌等作用。枸杞品种很多 ,除宁夏枸杞外 ,我国尚有黑果枸 杞、截萼枸杞、新疆枸杞、云南枸杞等品种。本文首次测定了 宁夏枸杞多糖腹腔注射小鼠的半数致死量 ,为多糖的临床小 试及临床应用的安全性提供依据。 1 　与 1. 1 　材料 1. 1. 1 　主要仪器设备 :生物显微镜 ,厦门麦克奥迪公司 , E220 G。数码显微镜 ,厦门麦克奥迪公司 ,B5 型。切片机 ,浙 江科迪仪器设备有限公司 ,轮转式。电热恒温培养箱 ,宁夏 银川市金属制品厂 ,28 YX - 1。电热鼓风干燥箱 ,上海精宏 实验设备有限公司 ,DHG - 9123A。电子天平 ,梅特勒 - 托利 多上海有限公司 ,AL - 204 (0. 0001g) 。可调式移液器 ,德国 　　3 为通讯作者。 eppendorf ,10～100μl。1. 1. 2 　主要试剂 :苏木素 ,北京化工厂 ,批号 001428。伊红 ,北京化工厂 ,批号 010617。中性树胶 ,上海化学试剂公司 ,批号 051016。石蜡 ,上海生物制片厂 ,批号 030425。甲醛 ,西安化学试剂厂 ,批号 031107。冰醋酸 ,北京化工厂 ,批号20040825。二甲苯 ,天津市百世化工有限公司化学试剂厂 ,批号 20011130。丙三醇 ,北京金星化学试剂分装厂 ,批号20030507。浓盐酸 ,广东汕头西陇化工厂 ,批号 051221。甲醇 ,广东汕头西陇化工厂 ,批号 050121。无水乙醇 ,安徽安特生物化学有限公司 ,批号 050907。枸杞多糖、牛膝多糖均为自制。1.1. 3 　供试动物 : 30 日龄 ICR 小鼠 210 只 ,体重约 18～20 g ,购自宁夏医学院实验动物中心。1. 2 　方法1. 2. 1 　苏木精染色液的配制 : Ehrlich’s 苏木精 :将 10 g 硫酸铝钾在碾钵内捣碎 ,放入蒸馏水 100 ml 加温溶解 ,温度控制在 40～50 ℃。取苏木素 2 g 溶解于 100 ml 纯酒精中 ,待苏木素完全溶解后 ,再加 10 ml 冰醋酸 ,然后加入温热的硫酸铝钾溶液 ,并充分摇匀。将溶液倾入三角烧瓶中 ,缓慢加入100 ml 甘油 ,边加边摇动。用棉花纱布做瓶塞塞好 ,在阳光充足 ,比较温暖的地方放置三个月使其自然成熟 ,使用前过滤。1. 2. 2 　0. 5 %盐酸酒精的配制 :0. 5 ml 浓盐酸溶于 99. 5 ml70 %酒精溶液 ,混匀备用。 2. 3 　方法的精密度试验 称取同一预混料样品 7 份 ,按“1. 3. 1”实验方法消解测 定 ,结果如表 5 : 表 5 　方法的精密度　　　(单位 : %) 元素 Cu Fe Zn Mn Pb As Cd Co Se K Mg RSD 2. 35 3. 73 3. 08 1. 97 4. 29 3. 05 2. 57 4. 07 2. 88 1. 32 1. 16 　　相对偏差都在 5 %以下 ,符合元素测定的要求〔3～6〕。 2. 4 　方法的比对试验 取三个预混料样品 ,按“1. 3. 1”实验方法进行预处理 ,用 ICP 法测定表 6 中全部元素 ,另外铜、铁、锌、锰、铅、镉、钴、 钾、镁将溶液稀释用原子吸收法进行测定 ,后与 ICP 法结果 比较。砷用原子荧光法测定 ,硒没有用第二种方法测定 ,两 种仪器测定比对结果见表 6。 表 6 　11 种元素两种仪器比对结果　　(单位 :mg/ kg、%) 元 素 样品 1 样品 2 样品 3 原吸法 ICP法 相对误差 原吸法 ICP法 相对误差 原吸法 ICP法 相对误差 Cu 860 819 4. 88 1000 954 4. 71 13. 8 14. 2 2. 86 Fe 6150 5968 3. 00 5351 5168 3. 48 4905 4757 3. 06 Zn 1500 1447 3. 60 2100 2085 0. 72 55. 8 54. 3 2. 73 Mn 590 574 2. 75 930 924 0. 65 94. 0 96. 0 2. 11 Pb 5. 24 5. 5 4. 84 4. 16 4. 38 5. 15 7. 49 7. 65 2. 11 Cd 0. 25 0. 23 8. 33 0. 10 0. 10 0. 00 0. 12 0. 11 0. 00 Co 4. 21 4. 10 2. 64 4. 52 4. 32 4. 52 4. 01 3. 84 4. 34 K 189 183 3. 23 198 193 2. 55 165 160 3. 09 Mg 580 556 4. 23 400 384 4. 08 418 401 4. 15 As 3 7. 63 7. 64 0. 13 7. 39 7. 39 0. 00 6. 90 7. 07 2. 44 Se / 未检出 / / 未检出 / / 未检出 / 　3 注 :As测定不是用原吸法测定 ,而是用原子荧光法测定和 ICP 法比较。 从表 6 可以得出 :铜、铁、锌、锰、铅、镉、钴、钾、镁元素用 ICP 法与原子吸收法测定比较 ,得出两方法的测定误差小于 国家标准规定的各元素测定的相对误差要求〔3～5〕,砷元素用 ICP 法与原子荧光法测定比较 ,得出两方法的测定误差小于 国家标准规定相对误差要求〔6〕。因此 ICP 法可以替代国家 标准中的原子吸收法、原子荧光法测定饲料产品中 11 种元 素。 3 　结论 通过 ICP 法对 11 种元素进行回收率、精密度的测定 ,得 出用 ICP 法加标回收率在 83 %～108 %之间 ,方法的精密度 小于 5 % ,准确性好 ,精密度高。和原子吸收法、原子荧光法 比较 ,相对误差较小。得出 ICP 法完全可以替代原子吸收 法、原子荧光法测定饲料产品中 11 种元素。而 ICP 法可以 同时测定 11 种元素 ,一方面可以大大缩短分析时间 ,极大地 提高饲料检测的速度 ,另一方面也可以降低成本 ,提高经济 效益。 参考文献 〔1〕邱德仁. 原子光谱分析〔M〕. 上海 :复旦大学出版社 ,175～234 〔2〕刘先国 ,方金东 ,金泽祥. 电感藕合等离子体原子发射光谱法快速 测定动物饲料中的微量元素〔J〕. 国外分析仪器技术与应用 , 2002 , (2) :58～60 〔3〕中华人民共和国农业部 ,中华人民共和国国家标准. 动物饲料中 钙铜铁镁锰钾钠和锌含量的测定 原子吸收光谱法 GB 　 T13885 —2003〔S〕. 北京 :中国标准出版社 ,2003 〔4〕中华人民共和国农业部 ,中华人民共和国国家标准. 饲料中隔的 测定方法 GB/ T13082 - 1991. 北京 :中国标准出版社 ,1991 〔5〕中华人民共和国农业部 ,中华人民共和国国家标准. 饲料中铅的 测定方法 GB/ T13080 —2004. 北京 :中国标准出版社 ,2004 〔6〕中华人民共和国农业部 ,中华人民共和国国家标准. 饲料中砷的 测定方法 GB/ T13079 —2006. 北京 :中国标准出版社 ,2006 ·73·《上海畜牧兽医通讯》　2009 年第 1 期 1. 2. 3 　伊红染色液的配制 :伊红 1 g ,溶于 99 ml 95 %乙醇 , 混匀备用。 1. 2. 4 　病理切片的制作 :采用常规石蜡切片法制作病理切 片。HE染色。 1. 2. 5 　试验分组及给药 :半数致死量 (LD50) 的测定 :采用寇 氏法。通过预试验确定剂量范围 :ABPS :45 g/ kg～8 g/ kg ; LBPS:40 g/ kg～7 g/ kg ,公比分别为 ABPS r1 = 1. 412 ,LBPS r2 = 1. 417 ,设 6 个剂量组和一个对照组 ,每剂量组 10 只小 鼠 ,雌雄各半 ,腹腔注射给药 ,每小鼠注射体积 0. 4 ml ,观察 7 d。分笼饲养 ,自由采食和饮水 ,给药停止后观察 7 d 内小 白鼠的死亡情况 ,以此来验证此药液有无急性毒性作用。观 察临床表现 ,动物死亡数 ,死亡后病理变化 ,按由小到大浓度 梯度的剂量腹腔注射 ,测定 LD50 ,结果见表 1、表 2。 1. 2. 6 　统计方法 :寇氏法。数据表达采用 X ±SD 表示。 2 　结果 2. 1 　半数致死量 (LD50)的测定结果 表 1 表明 ABPS 的 LD50为 19. 05 ,95 %可信限为 12. 71 ～28. 58 g/ kg ;平均可信限为 LD50 ±(LD50 高限 - LD50 低 限) / 2 = 19. 05 ±7. 935 g/ kg。 表 2 表明 LBPS 的 LD50为 20. 42 g/ kg ,95 %可信限为 17. 05～24. 46 g/ kg ;平均可信限为 LD50 ±(LD50高限 - LD50 低限) / 2 = 20. 42 ±0. 08 g/ kg。 2. 2 　小鼠临床表现 注射单组分多糖 (ABPS、LBPS)后小鼠出现症状相似 ,均 为被毛杂乱 ,身体蜷缩 ,多个小鼠聚集在一起 ,精神沉郁 ,饮 食欲消失 ,无排尿、排粪。呼吸加快 ,呈明显腹式呼吸。在注 射药物后 4～16 h 后死亡 ,对照组和未死亡小鼠刚注射后虽 有上述症状 ,但呈短期表现 ,随后未见任何异常表现。 2. 3 　病理剖检结果 对照组小鼠各脏器未见任何变化 ,注射药物组眼观各脏 器体积无变化 ,心冠有出血点 ,肺部局部充血 ,膀胱积尿 ,肝、 脾、肺、肾无眼观变化。 表 1 　ABPS 的 LD50的测定结果 组 别 动物数 (只) 剂量 (g/ kg) 对数剂量 (X) 动物死亡数 (只) 死亡率 ( %) LD50 P 2 1 10 45. 00 1. 65 10 100 1 2 10 31. 88 1. 50 10 100 1 3 10 22. 56 1. 35 5 50 19. 05 0. 25 4 10 15. 97 1. 20 4 40 0. 16 5 10 11. 3 1. 05 1 10 0. 01 6 10 8 0. 90 0 0 0 表 2 　LBPS 的 LD50的测定结果 组 别 动物数 (只) 剂量 (g/ kg) 对数剂量 (X) 动物死亡数 (只) 死亡率 ( %) LD50 P 2 1 10 40 1. 60 10 100 1 2 10 28. 22 1. 45 8 80 0. 64 3 10 19. 92 1. 30 4 40 20. 42 0. 16 4 10 14. 06 1. 15 2 20 0. 04 5 10 9. 92 1. 00 0 0 0 6 10 7 0. 85 0 0 0 2. 4 　病理组织学观察结果 对心、肝、脾、肺、肾各器官进行病理组织学观察。见图 1 ～5 ,表明各个脏器以充血、出血为主 ,心肌细胞间有出血 ,横 纹存在但闰盘不清楚 ,细胞间的连接有断开的情况。肝脏细 胞细胞索凌乱 ,中央静脉充血 ,细胞间出血。脾脏细胞间出 血。肺脏肺泡间隔出血 ,基膜不完整。肾脏肾小球 ,肾小管 间出血明显 ,肾小球囊腔有出血。 3 　讨论 穆冰等从新疆枸杞中提取的枸杞多糖的急性毒性试验 , 按 10 g/ kg 的剂量给昆明小鼠经口灌胃后 ,测得 LD50 > 10 g/ kg ,属实际无毒类。杨青雅等按 6. 7～40 g/ kg 给小鼠腹腔 注射牛膝多糖 ,测得 LD50为 15. 63 g/ kg ,本次试验首次测定 了宁夏中宁枸杞多糖对小鼠的急性毒性 ,半数致死量为 20. 42 g/ kg ,牛膝多糖的半数致死量 (LD50)为 19. 05 g/ kg ,根 据兽药安全性评价标准 ,当 LD50 > 1. 5 g/ kg 属无毒性物质。 由此说明牛膝多糖和枸杞多糖均为无毒物质 ,可以进行临床 小试和临床应用。 ·83· 《上海畜牧兽医通讯》　2009 年第 1 期