10种真菌深层发酵液抑菌活性分析

2010 No．9 Serial No．222 China Brewing 对照组中黑曲霉生长旺盛，菌丝体几乎覆盖整个培养皿， 菌落呈白色；含有Eu-对氯苯氧乙酸-8-羟基喹啉的培养基 抑制圈直径为42mm，抑制圈外菌丝体生长旺盛，菌落呈 白色；含有Yb-对氯苯氧乙酸-8-羟基喹啉的培养基抑制圈 直径为23mm，周围菌丝体生长旺盛，菌落呈白色，这表明 黑曲霉菌落的生长能够被抑制或延迟。培养至第3d，对照 组中黑曲霉生长十分旺盛，菌丝体覆盖了整个培养基；含 有Eu-对氯苯氧乙酸-8-羟基喹啉的培养基，与第2d相比， 菌丝体生长更加茂密，菌落呈棕红色；含有Yb-对氯苯氧 乙酸-8-羟基喹啉的培养基，菌丝体几乎覆盖整个培养皿， 菌丝体延伸至抑菌圈内部，且有黑色孢子生长。培养至第 4d，对照组中黑曲霉菌丝体呈炭黑色，有大量孢子繁殖生 长；含有Eu-对氯苯氧乙酸-8-羟基喹啉的培养基，抑菌圈外 部菌丝体生长茂盛，呈炭黑色，有部分菌丝体延伸至抑菌 圈内部，呈白色和黄色；含有Yb-对氯苯氧乙酸-8-羟基喹 啉的培养基，菌丝体呈炭黑色。由此可见，新合成的三元 配合物对黑曲霉菌的生长具有明显的抑制作用，且这种 抑菌作用随处理时间的延长而减弱。 3 结论 合成的三元配合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黑 曲霉均有抑制作用，随浓度的增加而增强，且抑菌活性较 配体本身增强。 参考文献： [1]邓汝温，张仲生.稀土药物与药学性质[J].稀土，1987（3）：36-47. [2]朱爱平.香豆素化合物在不同荧光溶剂中的研究[J].物理化学学报， 1998（6）：552-555. [3]吕世光.塑料助剂手册[M].北京：中国轻工业出版社，1988. [4]何其庄，杨小飞，钱秀萍，等.稀土间氨基苯甲酸 8-羟基喹啉三元配合 物的合成、表征及抑菌作用研究[J].中国稀土学报，2002，20（20）：1-5. [5]邓 洪，陈超球，梁利芳.稀土、苯氧乙酸与 8-羟基喹啉三元固体配合 物的表征及抑菌试验[J].广西科学，2001，8（1）：40-43. [6]梁福沛，唐献兰，胡瑞祥，等.稀土 -烟酸 -8-羟基喹啉三元配合物合 成、表征及其抑菌活性[J].稀有金属，2000，24（4）：265-269. [7]周德庆.微生物学实验教程[M].北京：高等教育出版社，1989. 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Yantai 264025, China) Abstract: Ten kinds of fungi were tested for their antimicrobial activity by using the disc diffusion method. The results showed that different fermenta- tion broth of fungi had different antibmicrobial activity to different microorganisms using chloramphenicol as control. Flammulina velutipes，Gano- derma sinense and Omphalia lapidescens Schroet showed marked antimicrobial activity to Escherichia coli, and Ganoderma lucidum exhibited low antibmicrobial activity against Escherichia coli. Ganoderma sinense and Agrocybe chaxinggu exhibited high antibmicrobial activity against Staphylo- coccus aureus, and Cordyceps militaris showed no antimicrobial activity to S. aureus. Key words: fungi; fermentation broths; antimicrobial activity 收稿日期：2010-05-10 基金项目：国家科技支撑计划（20058BADA1B04）；鲁东大学人才基金项目（LY20063303）；鲁东大学创新团队建设项目（08CXB003）；鲁东大学 学科建设经费资助 作者简介：张秋胜（1974-），男，湖北黄冈人，讲师，研究方向菌物遗传学。 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Research Report70· · 中 国 酿 造 2010年 第 9期 总第 222期 实验真菌 抑菌圈直径 / mm 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 赤灵芝 18.52±0.17 21.08±0.23 紫灵芝 35.85±0.15 33.51±0.34 杨树菇 32.04±0.22 26.86±0.16 茶树菇 616 31.43±0.31 31.75±0.08 雷丸 33.99±0.13 30.13±0.32 黄伞 31.29±0.27 17.06±0.20 金针菇 35.09±0.24 27.01±0.18 猪肚菇 25.66±0.16 21.26±0.30 木耳 22.09±0.25 23.61±0.22 北虫草 27.02±0.11 - 表1 不同真菌发酵液的抑菌活性 Table 1. Antimicrobial activity of the fermentation broths from different fungi 注：“-”表示无抑菌效果；数据为3次实验的平均值。 菌抑制和杀菌活性的研究多采用其子实体进行，对于其 液体发酵的发酵液进行较少[4]。目前真菌液体发酵的发酵 液抑菌活性研究（如灵芝、榆耳、红菇、杨树菇、鸡腿蘑等） 已见报道[5-8]。对于其他真菌（如茶树菇、紫灵芝、黄伞 等）液体发酵的发酵液抑菌活性，却未见报道[9]。因不同的 真菌材料、研究方法、实验条件，结果缺乏可比性。 本研究基于在相同的实验条件，以灵芝等10种真菌为 研究对象，通过摇瓶深层发酵培养，借助的抗生素， 对其发酵液抑菌活性进行比较分析，为以真菌出发菌株 进行医药、食品防腐剂、饲料添加剂等项目的开发提供理 论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌株 赤灵芝（Ganoderma lucidum），紫灵芝（Ganoderma sinense），杨树菇（Agrocybe aegerita），茶树菇616（Agro- cybe chaxinggu 616），木耳（Agaric），黄伞（Pholiota adiposa）， 雷丸（Omphalia lapidescens Schroet），猪肚菇（Panus gigan- teus），金针菇（Flammulina velutipes），北虫草（Cordyceps militaris），黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），大肠杆 菌（Escherichia coli），供试菌株均由鲁东大学生命科学学 院提供。 1.1.2 培养基 营养琼脂培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%， 琼脂2%，pH 7.0~7.2。 半固体营养培养基：配方同上，琼脂量为0.8%~1%。 PDA固体培养基：去皮土豆20%，葡萄糖2.0g/L， KH2PO4 0.46g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，VB1 10.0mg/L，K2HPO4 1.0mg/L，琼脂2%，pH值自然。 PDA液体培养基：配方同上，未加琼脂。 1.2 方法 1.2.1 真菌菌种活化和发酵培养 将10种真菌菌种接种于改良PDA培养基平板上，28℃ 培养，经2次转接活化后，分别用接种环钩取3块0.5cm2 大小的菌丝块接种于300mL/1000mL三角瓶PDA液体培养 基中，26℃旋转摇床上，150r/min振荡培养8d后，终止发酵。 1.2.2 真菌发酵液的收集和浓缩 4层无菌纱布过滤得菌丝体和发酵液。收集每种真菌 发酵液并用旋转蒸发仪浓缩至10mL，浓缩了30倍，无菌滤 器过滤除菌，4℃保存备用。 1.2.3 细菌活化与细菌悬液的制备 挑取金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠 杆菌（Escherichia coli），斜面培养活化2次后，选取菌落较 大、生长旺盛的菌体于液体肉汤培养基的锥形瓶中。将锥 形瓶置于37℃摇床中培养，当OD值为0.5时，离心收集菌 体，用0.8%无菌生理盐水将其浓度调为106cell/mL菌悬液， 4℃保存备用。 1.2.4 真菌发酵液抑菌活性分析 管碟法：无菌操作，先取无菌定量平皿，下层倒入10mL 营养琼脂培养基，待凝固后，上层加入5mL含有细菌的半 固体营养培养基，然后用镊子将牛津杯放在平板中央。用 可调式移液器往牛津杯中加入200μL的发酵液上清液。每 种真菌发酵液做3个重复。将培养皿放到生化培养箱中培 养，37℃恒温培养24h，取出培养皿除去牛津杯，观察并用 游标卡尺，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，取3个实验数 据的平均值作为实验结果。同时用标准抗生素（氯霉素， AMRESCO产，货号3056B519）为标准品，检测真菌发酵液 的活力。 1.2.5 数据统计分析 方差分析采用SPSS11.5统计分析软件，采用Duncan新 复极差法（p=0.05）检验分析显著性。 2 实验结果与分析 2.1 10种真菌发酵液抑菌活性 取已浓缩的10种真菌发酵液进行抑菌活性测定，空白 平板只加PDA液体培养基作空白对照。抑菌活性实验结 果见表1。 不同真菌发酵液对不同的细菌具有不同的抑菌效 果。真菌发酵液中紫灵芝、金针菇、雷丸对大肠杆菌表现 出显著的抑制效果；紫灵芝、茶树菇，雷丸则对金黄色葡萄 球菌表现出显著的抑制效果。 相同真菌发酵液对不同的细菌具有不同的抑菌效 果。有的真菌（如北虫草等）发酵液对一种细菌有效，而对 另外一种细菌则无效。总体而言，10种真菌发酵液对大肠 杆菌的抑制效果要优于金黄色葡萄球菌。 2.2 真菌发酵液的抗生素生物学效价 将标准的氯霉素样品用无菌生理盐水稀释成5个浓 研究报告 71· · 2010 No．9 Serial No．222 China Brewing 表2 不同浓度氯霉素的抑菌效果 Table 2. Antimicrobial ability of the chloramphenicol with different concentrations 氯霉素浓度 / （mg·mL-1） 抑菌圈直径 / mm 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 1.00 33.33±0.23 27.81±0.30 0.50 24.66±0.12 24.81±0.27 0.25 20.69±0.05 18.93±0.14 0.13 19.33±0.21 16.68±0.25 0.06 17.28±0.15 15.60±0.24 注：氯霉素初始浓度为50.00mg/mL。 表3 真菌发酵液相对氯霉素的生物效价 Table 3. Biological potency of chloramphenicol in fungal fermentation broth 实验真菌 紫灵芝 金针菇 雷丸 杨树菇 茶树菇616 生物效价/（μg·mL-1） 38.6 37 34.6 31 29.6 实验真菌 黄伞 北虫草 木耳 猪肚菇 赤灵芝 生物效价/（μg·mL-1） 29.3 21 11 18 4 度梯度，用以测定真菌发酵液抑菌活性。测定氯霉素对大 肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果（方法同上）。抑菌活 性结果见表2。 根据真菌发酵液的抑菌结果，以氯霉素标准溶液浓 度的自然对数值为横坐标，以抑菌圈半径的平方为纵坐 标，绘制氯霉素标准曲线，即可查得发酵液中氯霉素的生 物效价。 当以大肠杆菌为参比细菌时，各真菌发酵液相对氯霉 素的生物效价见表3。 各真菌发酵液相对氯霉素的生物效价大小不一， 其中最大的为38.6μg/mL，最小的为4μg/mL，其他介于两 者之间，但抑菌活性均远远低于氯霉素，且参比细菌不同， 生物效价也不一样。 3 结论与讨论 3.1 真菌发酵液的抑菌活性与真菌种类密切相关，即不同 种的真菌发酵液对相同的微生物（如细菌）具有不同的抑 菌效果。对大肠杆菌有较强抑菌效果的有金针菇、紫灵芝、 雷丸、茶树菇和杨树菇；但对其抑菌活性较弱的有赤灵芝。 对金黄色葡萄球菌等有较强抑菌效果的有紫灵芝、茶树 菇616；对其无抑菌活性则是北虫草。紫灵芝和赤灵芝同 属于灵芝，但两者抑菌活性差异显著。 3.2 真菌发酵液对不同类型微生物有不同的抑菌活性。黄 伞大肠杆菌抑菌活性较强，但对金黄色葡萄球菌则较弱； 北虫草对大肠杆菌抑菌活性较好，但对金黄色葡萄球菌 却无抑菌活性。因此，在实际应用时，有必要考虑真菌发 酵液的混合使用[10]。 3.3 真菌发酵液相对氯霉素的生物效价差异明显，扩大不 同批次和不同真菌材料可比性。10种真菌发酵液中氯霉 素的生物效价大小不一，其中最大的为38.6μg/L，最小的 为4μg/L，其他介于两者之间，但抑菌活性均远远低于氯 霉素，且参比细菌不同，生物效价也不一样。 参考文献： [1]高锦明.高等真菌代谢产物 [M].杨凌：西北农林科技大学出版社， 2003. [2]康 洁，陈若芸.近 10年药用真菌成分及活性研究进展[J].中国药学 杂志，2005，40（2）：86-89. 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" 中国调味品协会根据卫办监督函[2010]607号文件，接受卫生部的委托，与中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 及有关地方疾控中心共同承担调味品行业食品安全国家标准工作，分别为《酱油卫生标准》、《酱卫生标准》、《食醋卫生标准》、 《水产调味品卫生标准》、《发酵性豆制品卫生标准》和建立香辛料名单。 卫生部工作进度安排，2010年9月，制定完善标准清理工作；2010年10月份启动食品安全标准清理工作；2010年年底，将 完成部分食品产品安全标准草案起草工作。2011年3月底前，完成部分食品产品安全标准草案征求和对外通报。 中国调味品协会将与中国疾病预防控制中心营养与食品安全所及有关地方疾控中心，按照卫生部的工作进度安排进度，以 6项食品安全标准为基础，逐步开展调味品行业食品安全国家标准的制定。 行 业 信 息 将完善调味品行业食品安全国家标准 72· ·