枸杞多糖对大鼠心室肌细胞L型钙电流的影响

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　第 30 卷 第 1 期2009 年 1 月 武汉大学学报 (医学版) Medical Journal of Wuhan University Vol. 30 No. 1 Jan , 2009 课题来源 :湖北省自然科学基金资助项目 (编号 :301130565) 作者简介 :刘淼 ,男 ,19822 ,医学硕士 ,主要从事心脏电生理学研究 通讯作者 :唐其柱 ,男 ,19632 ,医学博士 ,教授 ,主要从事心脏电生理学及扩张性心肌病的研究 枸杞多糖对大鼠心室肌细胞 L 型钙电流的影响 刘 　淼 　唐其柱 　王晓玲 　汪晶晶 　王 　腾 武汉大学人民医院心血管病研究所 　湖北 　武汉 　430060 摘要 　目的 :探讨枸杞多糖对大鼠心室肌细胞 L2型钙通道的作用。方法 :用急性酶解法获得大鼠的单个心肌 细胞 ,用标准的全细胞膜片钳技术记录钙通道电流。结果 : ①枸杞多糖能使 I2V 曲线明显上移。②枸杞多糖对 ICa2L 呈浓度依赖性的抑制作用。③50 mg/ L 枸杞多糖能使 ICa2L稳态激活曲线右移、还能增加失活后恢复的τ值 ;但对失 活曲线无影响 ,不改变 ICa2L失活特性。结论 :枸杞多糖对 ICa2L有阻断作用 ,主要作用于钙通道激活和恢复过程。 关键词 　枸杞多糖 ;全细胞膜片钳 ;钙电流 中图分类号 　R331. 3 + 8 　文献标识码 　A 　文章编号 　167128852 (2009) 0120057204 Effects of Lycium Barbarum Polysaccharides on L2Type Calcium Channel Current in Rat Ventricular Myocytes L IU Miao , TANG Qizhu , WANG Xiaol ing , WANG Jingjing , WANG Teng I nst i t ute of Cardiolog y , Renmi n Hos pi t al of W uhan U ni versi t y , W uhan 430060 , Chi na Abstract Objective : To study the effect s of L ycium Barbarum polysaccharides (LBP) on L2type calcium channel current ( ICa2L ) in rat vent ricular myocytes. Methods : Standard whole2cell patch clamp technique was used. Results : ①LBP could make t he I2V curves upward. ②LBP reduced t he ICa2L in a concent ration2dependent manner . ③LBP in t he concent ration of 50 mg/ L made t he steady2 state activation curves shif t to right , and increased t heτ value of recovery duration obviously. But inactivation curve of ICa2L was not affected significantly. Conclusion : LBP could inhibit t he L2 type calcium channel , mainly acting on t he activity and recovery processes. Key Words 　L ycium Barbarum Polysaccharides ; Whole Cell Path Clamp ; L2Type Calcium Current s 　　枸杞多糖 (L ycium Barbarum polysaccharides , LBP) 是中药枸杞子中提取的多糖 ,被证实为提高免 疫活性和抗衰老的有效成分。枸杞多糖可以清除羟 自由基所致的丙二醛的产生 ,抑制羟自由基所致的 膜流动性下降和减轻羟自由基所致的线粒体膨胀程 度 ,明显抑制羟自由基引起的线粒体氧化损伤。枸杞 多糖还可能通过抑制原癌基因的表达 ,抑制细胞凋 亡 ,最终达到延缓衰老 ,提高机体生命力[1 ] 。其在分 子和细胞水平上促进免疫功能的作用近几年得到深 入的研究。已有报道通过共聚焦显微镜观察到枸杞 多糖具有明显降低细胞内钙的作用 ,但其作用机制 尚不清楚。本研究用膜片钳技术研究枸杞多糖对 L 型钙通道的影响 ,从离子通道水平研究其作用机制。 1 　材料与方法 1 . 1 　材料 　成年建康 SD 大鼠 30 只 (武汉大学医学 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 武汉大学学报 (医学版) 第 30 卷 院实验动物中心) ,体重 2002300 g 雌雄不拘 ; Ⅰ型胶 原酶 , 蛋 白 酶 E , H EPES , CSO H , CSCl , BSA , EGTA ,Na2 A TP ( Sigma 公司) ;枸杞多糖 (宁夏启元 药业) ;其余为国产分析纯。无钙台氏液 (mmol/ L) : NaCl 135 , KCl 5. 8 , MgCl2 ·6 H2 O 0. 5 , Na HPO4 · 2 H2 O 0. 33 , Glucose 10 , HEPES 10 , p H 7. 38 (NaO H 调节) ; 电极外液组成 ( mmol/ L) : NaCl 35 , Choline Chloride 100 , CaCl2 1. 8 , MgCl2 ·6 H2 O 0. 5 , HEPES 10 , Glucose 10 , KCl 5. 8 , Na H2 PO4 0. 33 , p H 7. 3 (CsO H 调节) ;电极内液组成 ( mmol/ L ) : CSCl 120 , CaCl2 1. 0 ,MgCl2 5 ,Na2 A TP 5 , EGTA 11 , H EPES 10 , Glucose 11 ,p H 7. 4 (CsO H 调节) 。 1 . 2 　方法 1 . 2 . 1 　心肌细胞的分离 　将大鼠腹腔注射肝素 500 U/ kg , 头 部 击 昏 , 迅 速 开 胸 , 取 出 心 脏 置 于 1 000 ml/ L O2饱和的 4 ℃生理盐水中冲洗 ,去除脂 肪和心包膜后置于 Langendorff 心脏灌流装置上逆 行灌流 ,灌流压维持在 70 cm H2 O , 灌流液始终给予 1 000 ml/ L O2饱和 ,整个灌流过程温度 37 ℃。用无 钙台氏液灌流 325 min ,冲出心脏内残留血液 ,心脏 完全停跳后 ,改用含 0. 33 g/ L Ⅰ型胶原酶 ,0. 1 g/ L 蛋白酶 E 的低钙液 ( Ca2 + 0. 2 mmol/ L ) 灌流约 10 min ,至心脏膨大松弛流出液成丝后取下 ,除去心房 , 在含 BSA 1 g/ L 氧饱和的无钙台氏液中剪碎心室 肌 , 37 ℃温孵 ,稀释 ,倒出上清液 , 此为第一份细胞 贮存液。剩余的沉淀部分继续用含 BSA 1 g/ L 的台 氏液温孵 ,稀释 ,倒出上清依次可以得到多份细胞存 储液。将存储液复钙至 0. 8 mmol/ L ,静置 1 h 观察 细胞状态。 1 . 2 . 2 　全细胞记录技术 　吸数滴细胞保存液加于 2 ml 灌流槽 ,置于倒置显微镜 (Olymp us IX70) 载物台 上 ,待细胞静置贴壁 ,细胞外液灌流清洗细胞 ,电极 选用硬质玻璃 (上海神经生理所提供) ,经微电极拉 制 (Narishige PB27)二次拉制而成 ,电极充以内液后 阻抗 3. 525 MΩ。选取横纹清晰 ,表面无颗粒 ,无收 缩的细胞 ,采用微电极操纵仪 (Narishige MD320) 移 动电极 ,当电极尖端与细胞表面形成高阻抗封接后 ( > 2 GΩ) ,补偿电极与细胞膜之间的电容 ,进一步 给负压吸破细胞膜 ,经电容电流和电极串联补偿即 可行全细胞记录。所有实验均在室温下进行。用全 细胞膜片钳记录方法 ,脉冲信号由 Pulse + Pulsefit 软件 (Version 8. 31 ,德国 H E KA 电子公司生产) 控 制 ,经 EPC9 放大器 (德国 H E KA 公司生产) 放大后 通过 Ag2AgCl 电极丝和填充电极内液的玻璃微电 极导入细胞 ,产生的电流信号经 EPC29 放大器转换 , 信号为 Pulse 软件收集并存储于计算机的硬盘中。 1 . 2 . 3 　试验分组 　共分为 4 个浓度组 ,分别为对照 组 ( n = 7) , 25 mg/ L ( n = 7) ,50 mg/ L ( n = 7) , 100 mg/ L ( n = 7) ,记录药物灌流前后 ICa2L ,50 mg/ L 组还 需记录通道激活 ,失活和失活后恢复电流。 1 . 2 . 4 　统计学处理 　数据分析采用 Pulse 8. 31软 件对全细胞记录进行图形与数据转换 ,数据以珔x ±s 表示 , Origin 7. 0 软件对数据进行统计学处理 ,并进 行曲线拟合。不同浓度药物作用前后间比较采用 Oneway ANOVA 及 L SD2t 检验 , P < 0. 05 为有统 计学差异。 2 　结果 2 . 1 　对 ICa2L浓度依赖性阻断作用 　采用保持电位 - 40 mV ,指令电压 - 40 至 + 60 mV ,钳制时间 200 ms , 阶跃 10 mV 的刺激程序引出 ICa2L ,并且记录 30 min 内“rundown”现象 ,得出在 12 min 内衰减明显 , 所有的电流记录均在电流稳定后进行。灌流给药 5 min 后药效稳定。结果显示枸杞多糖对 ICa2L 具有浓 度依赖性的阻断作用 (图 1) ,25 ,50 ,100 mg/ L 枸杞 多糖作用时对 ICa2L 的抑制率分别为 ( 48. 21 ± 5. 01) % , (67. 76 ±4. 23) % , (85. 47 ±7. 45) % ( P < 0. 05) 。 图 1 　枸杞多糖对 ICa2L浓度依赖性 Fig. 1 　Concentration2dependent inhibition of LBP on ICa2L in ventricular myocytes a :对照组 ;b : 25 mg/ L LBP ; c : 50 mg/ L LBP ; d : 100 mg/ L LBP 2. 2 　枸杞多糖对 ICa2L电流2电压( I2V) 曲线的影响 　 I2V 曲线的测定 ,在电压钳方式下保持电位 - 40 mV ,施予 200 ms ,阶跃 10 mV , - 40 至 + 60 mV 的 系列去极化脉冲 ,可引出 ICa2L 电流。以各脉冲下电 流密度 (pA/ p F)幅值对相应测试电压作图得 I2V 曲 线 ,将各细胞给药前后 I2V 曲线的最大激活电压进 行统计分析。结果得到 ,正常对照组细胞的最大激 活电压为 0 mV ,给药后各测试电压水平 ICa2L减小 , I2 85 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　第 1 期 刘 　淼 ,等. 枸杞多糖对大鼠心室肌细胞 L 型钙电流的影响 V 曲线上移 (图 2) 。 图 2 　枸杞多糖电流2电压( I2V)曲线的影响 Fig. 2 　I2V curves of ICa2L 2 . 3 　对稳态激活动力学曲线的影响 　根据上述脉 冲刺激得到的电流值 ,按 Boltzmann 方程进行拟合 : G/ Gmax = 1/ [ 1 + exp (V T2 V1/ 2 /κ) ] ( G 为电 导 , V1/ 2为曲线中点的电压 ,κ为曲线的斜率) 。G = ICa2L / (V2Vrev) ,Vrev 为翻转电位。将各激活曲线所 对应的 V1/ 2进行统计分析 ( n = 7) ,结果得到稳态激 活曲线右移 (图 3) 。给予 50 mg/ L 枸杞多糖前后 , V1/ 2分别为 ( - 14. 38 ±0. 74) mV , ( - 7. 73 ±1. 23) mV ,κ分别为 4. 27 ±0. 72 ,3. 23 ±0. 51 ,用药前后 V1/ 2差异具有显著意义 ( P < 0. 05) 。 图 3 　枸杞多糖对 ICa2L稳态激活动力学曲线的影响 Fig. 3 　Effects of LBP on the steady2state activation of ICa2L 2 . 4 　对稳态失活动力学曲线的影响 　稳态失活曲 线的测定 ,保持电位 - 60 mV ,施予 1 000 ms ,阶跃 为 10 mV , - 60 至 + 30 mV 的系列去极化脉冲 ,在 每一条件脉冲后紧跟一固定去极至 10 mV ,300 ms 的刺激脉冲 ,然后再回到 - 60 mV ,记录 ICa2L 。将记 录到的 ICa2L 值按 Boltzmann 方程进行拟合 I/ Imax = 1/ [1 + exp (V T2V1/ 2 /κ) ] ,给予 50 mg/ L 枸杞多 糖前后 V1/ 2 分别为 - 25. 22 ±1. 14 , - 28. 21 ± 1. 18 mV ,κ分别为 12. 38 ±1. 04 , 15. 65 ±1. 56。枸 杞多糖对 ICa2L稳态失活曲线无影响 ( P > 0. 05) (图 4) 。 图 4 　枸杞多糖对稳态失活动力学曲线的影响 Fig. 4 　Effects of LBP on the steady2state inactivation of ICa2L 2. 5 　对 ICa2L失活后恢复的影响 　失活后恢复曲线 测定 ,采用双脉冲刺激法。保持电位 - 60 mV ,施予 10 mV ,300 ms 的除极脉冲 ,回到保持电位后持续 50 ms ,再给予同样除极脉冲 ,前后两个脉冲的间隔 时间逐渐增加 ,每次增加 50 ms ,共 7 次脉冲。将记 录到的电流值按单指数方程进行拟合 : I ( %) = A + B exp (2t/τ) ,求出恢复曲线的时间常数 (τ)值 ,式中 I ( %)为第 2 次以后的方波脉冲引出的电流与条件测 试电流的比值 , t 为两脉冲之间间隔的时间 ,τ为灭 活后再激活的时间常数。将各细胞失活曲线所对应 的τ进行统计分析。失活后恢复曲线右移 ,枸杞多 糖使 ICa2L 从失活中恢复的τ值由给药前 (95. 01 ± 3. 65) ms增加至 (125. 28 ±7. 41) ms ,两者差异有显 著意义 ( P < 0. 05) ,用药后通道从失活状态恢复至能 被再激活的时间延长 (图 5) 。 图 5 　枸杞多糖对 ICa2L失活后恢复的影响 Fig. 5 　Effects of LBP on the recovery from inactivation of ICa2L 95 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 武汉大学学报 (医学版) 第 30 卷 3 　讨论 枸杞自古就被誉为生命之树 ,流传于中国秦汉 时代的《神农本草经》上就有记载。近年来 ,枸杞中 有效成分的药用价值倍受国内外研究者的关注 ,其 研究进展迅速 ,其在分子和细胞水平上促进免疫功 能的作用近几年得到深入的研究。枸杞多糖作为枸 杞的一种主要有效成分 ,具有广泛的生理作用 ,如抗 衰老、抗肿瘤、促进造血、降血脂、保肝。已有报道通 过共聚焦显微镜观察到枸杞多糖具有明显降低细胞 内钙的作用 ,且能对抗缺氧和 KCl 诱导的钙超载[ 2 ] 。 由于对其电生理方面的研究较少 ,许多作用机制尚 不清楚。本研究利用全细胞膜片钳技术从细胞离子 水平探讨其对通道动力学的影响。 本实验研究了枸杞多糖对心肌细胞 L 型钙通道 的影响 ,发现枸杞多糖呈浓度依赖性的抑制 ICa2L ,其 效应主要是通过作用于 L 型钙通道激活和恢复动力 学有关的位点 ,减慢通道的激活 ,延长其失活后恢复 的时间。L 型钙通道是钙离子内流的单向转运系 统 ,参与动作电位平台期的形成 ,激活细胞内肌浆网 的钙释放 ,对兴奋2收缩耦联起重要调节作用 ,是心 肌细胞兴奋和收缩的重要机制之一 ,具有重要的生 理和病理生理意义。枸杞多糖通过阻滞 L 型钙通道 不仅可以减少细胞内钙离子浓度 ,减少钙超载的发 生 ,减少降解酶类的激活释放而引起的的心肌缺血 再灌注损伤 ;还可以缩短动作电位时程 (A PD) ,减少 兴奋性折返引起的早后去极化 ,减少心律失常的发 生。 心肌缺血导致心肌细胞钙超载 ,一方面细胞内 Ca2 + 增加使 A PD 延长导致兴奋性折返引起早后去 极化 ,形成触发性心律失常。另一方面 ,细胞内高 Ca2 + 状态下 ,心肌收缩力增加 ,心肌耗氧量增加 ,从 而加重心肌损伤 ,同时心肌 A TP 大量耗竭。因此 , 钙通道阻断剂已被广泛用于心肌缺血、冠心病和心 律失常等疾病的治疗。目前 ,枸杞多糖对心肌细胞 离子通道的影响还未见报道 ,但有文献报道枸杞多 糖对于缺氧和 KCl 诱导的钙超载有抑制作用。枸杞 多糖对钙超载损伤具有保护作用 ,这些均显示它具 有是抗心律失常和钙超载的药用价值。 心肌病变往往涉及多种离子通道 ,枸杞多糖对 心脏的保护作用是否作用于其他离子通道有待于进 一步研究。 参考文献 [1 ] 　朱彩平 ,张民. 枸杞多糖的组成及结构分析 [J ] . 中草 药 ,2006 ,37 (6) :8722874. [2 ] 　徐顺霖 ,黄峻 ,田庚元. 枸杞糖肽对缺氧及 KCl 诱导的 心肌细胞钙超载的影响 [J ] . 中国中药杂志 , 2005 ,30 (7) :5342538. [3 ] 　Fung ML , Li H Y , Wong TM. Forskolin fails to acti2 vate L2type calcium current in hypert rophied cardio2 myocytes of chronically hypoxic rat s [ J ] . Life Sci , 2002 , 70 (15) : 1 80121 809. [4 ] 　L uo Q , Li ZN , Huang XL , et al. Lycium barbarum polysaccharides : Protective effect s against heat2induced damage of rat testes and H2 O22induced DNA damage in mouse testicular cells and beneficial effect on sexual be2 havior and reproductive function of hemicast rated rat s [J ] . Life Sci , 2006 ,79 (7) :6132621. (2008201217 收稿) 编辑　孙孝云 06