枸杞多糖作为甲型肝炎疫苗佐剂免疫效果的实验研究

枸杞多糖作为甲型肝炎疫苗佐剂免疫效果的实验研究! 祝 峥"，钱子刚#，胡云章$，胡凝珠$，朱常成# （"%中国医科大学药学院，辽宁沈阳 ""&&&"；#%云南中医学院中药学院，云南昆明 ’(&#&&； $%中国医学科学院中国协和医科大学生物学研究所，云南昆明 ’(&"")） 摘 要：目的：探讨枸杞多糖（*+,-）作为甲型肝炎（./0）疫苗佐剂的效果。：设./0含铝佐剂疫苗阳性对照组、./0 不含任何佐剂的抗原阴性对照组、生理盐水空白对照组、*+,-（#&12、"&12、(12）$个剂量分别与./0含铝佐剂疫苗联合、分别 与./0不含任何佐剂的抗原联合成’个实验组免疫小鼠，于免疫后3周、)周、"#周、"’周、#&周尾静脉采血，4*5-/法小鼠血 清抗6./052水平。结果：*+,- "&12剂量作为./0疫苗佐剂免疫效果最佳，与阳性、阴性对照组比较差异均有显著性意义。结 论：*+,-与铝佐剂有相似的疫苗佐剂效果，且与铝佐剂合用有佐剂协同作用。 关键词：枸杞多糖；疫苗；佐剂；甲型肝炎；免疫效果 中图分类号：7#)(%’ 文献标识码：/ 文章编号："&&&6#8#$（#&&’）&&#)6&$ 目前铝化合物是批准的人用疫苗唯一佐剂，而 铝佐剂只能引起体液免疫，不能诱导机体有效的细 胞免疫，存在着对某些小抗原免疫原性物质佐剂效 果差，且结合抗原的能力批间差异较大的缺点，安 全性、有效性不够理想［"］。传统补益类中药有效成分 既能增加腹腔巨噬细胞（9!）、自然杀伤细胞（:;）、 细胞毒<细胞（=<*）、淋巴因子激活的杀伤细胞 （*/;），促进白介素"#（5*6"#）、粒细胞6巨噬细胞集 落刺激因子（>96=-?）、干扰素（"?:）等细胞因子的 分泌，加强细胞因子的作用，又能激活<细胞、+细胞， 活化补体促进提高机体的免疫功能，产生免疫调节 作用［#］，在作为重组乙型肝炎疫苗［$］、流感病毒［3］、钩 状螺旋体病毒［(］等疫苗佐剂的研究中明：补益类 中药有效成分具有良好的免疫佐剂特性，因此将其 研制开发为新型人用疫苗佐剂将具有广阔前景。 ! 材料与方法 "%" 疫苗 ./0 活疫苗：抗原滴度 "#)&4*@ A 1B，含铝佐剂 &%)12 A 1B；./0 浓缩灭活抗原：抗原滴度 "#)&4*@ A 1B，不含佐剂，均由中国医学科学院医学生物学研究 所提供。 "%# 佐剂 枸杞多糖（*+,-）：由本院药用植物实验室提制。 "%$ 实验动物 雄性 5=7 小鼠，$C3 周龄，"#C"’2，由中国医学 科学院医学生物学研究所实验动物中心提供，动物 合格证号：云动管第［D8$3］。 "%3 检测盒及仪器 ,EFGHIJ KHGHLGFE 9ILEFMHBB ;IG，.7, 9F@NH 抗体 诊断试剂盒、4*5-/ 检测酶标板由深圳晶美公司提 供；./0652> 抗体诊断试剂盒：由昆明医学生物学 研究所提供；四甲基联苯二氨（<9K）底物液：由 ;,* 公司提供；辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠 52> 抗 体：由 ;,* 公司提供；牛血清白蛋白（+-/）：由 -I2O 1P公司提供；+IF67/K 3(& 9ILEFQBPGH EHPRHE，+IF6 7PR *PSFEPGFEIHN，5JL% "%( 实验方法 "%(%" *+,6./0疫苗悬液的制备及动物免疫 配置 "&&12 A 1B 的 *+, 贮备液，=F’&辐射灭菌， 6#&T冰箱保存。用时依次用生理盐水进行稀释，配 置成（(&、#(、"#%(12 A 1B）*+, 使用液，于 3T冰箱冷 藏，待用。 雄性昆明小鼠 D& 只（$C3 周龄，"#C"’2），随机 分为 D 组，每组 "& 只，分别腹腔注射（I%Q%）进行免 疫。设 ./0 疫苗（铝佐剂）阳性对照、./0 抗原（不 含佐剂）阴性对照组，为使免疫剂量一致，用生理盐 水稀释 &%"1B 疫苗、&%"1B 抗原至 &%(1B A只；设 *+, 作为佐剂的高（(&12 A 1B）、中（#(12 A 1B）、低（"#%( " 基金项目：云南省卫生厅科学研究基金资助项目（#$%&’(’&)） 收稿日期：#&&’6&"6&( 修回日期：#&&’6&$6"# 作者简介：祝峥（"D88C），女，辽宁沈阳人，硕士，助教，主要从事生药学教学及研究工作。 第 #D卷第 #期 #&&’年 3月 云南中医学院学报 UF@EJPB FV W@JJPJ =FBBH2H FV $":+⋯⋯>$":;）#;））。 )’*’% 统计分析 采用 7:77))’* 统计软件对数据结果进行析因 设计的方差分析。 ! 结果 结果显示，除空白对照组外各实验组小鼠在 ( 周均产生抗,-./ 0"1，并随时间推移呈上升趋势， 到第 )+周达到抗体滴度的峰值，此后逐渐下降。 6?:7)&!"、+&!" 两个剂量与 -./ 抗原分别联 合，6?:7*!"、)&!"、+&!"% 个剂 量 与 -./ 含 .$ （@-）%疫苗分别联合的免疫效果均较良好，抗,-./ 0"1 水平与阴性对照组比较差异有显著性意义； 6?:7+&!"、)&!" 与 -./ 含 .$（@-）%疫苗联合诱导 的抗,-./ 0"1 水平与阳性对照组比较差异有显著 性意义，其中 6?:7)&!" 效果最佳，且小鼠体内抗体 滴度能维持在较高水平，维持时间较长。 " 讨论 6?: 各剂量分别与含 -./ 铝佐剂疫苗联用诱 导小鼠产生的抗体水平均明显优于 6?: 各剂量与 无佐剂 -./ 疫苗合用所诱导产生的抗体水平，也 明显优于单用铝佐剂疫苗的免疫效果，表明 6?: 与 .$（@-）%合用有协同佐剂作用。提示使用 6?:7 联合 .$（@-）% 作为佐剂可以使达到同样免疫力的 疫苗抗原用量减少或降低铝佐剂的用量，其经济效 益明显，安全性也更加可靠。6?:作为甲型肝炎疫苗 佐剂免疫小鼠后，动物体内抗体滴度能维持在较高 水平，且维持时间较长，显示了 6?: 多糖类成分在 体内有一定的库存效应，这一结果应与中药多糖类 成分作用机体后可以动员机体的免疫系统，刺激机 体的细胞免疫和体液免疫有关。 机体免疫系统受到外来抗原刺激后，辅助 9 细 胞的分化程度决定了机体产生体液免疫还是产生 细胞免疫反应。分子免疫学表明，9A)细胞与细胞免 疫有关，而 9A+细胞主要诱导产生体液免疫［3］。铝佐 剂主要激活 9A+ 细胞，因而主要刺激机体产生体液 免疫应答［B］。理想的新型疫苗佐剂不仅要能增强机 体的免疫应答，更需要其能作用于特定免疫细胞从 而选择性的诱导机体形成针对特异性抗体的免疫 应答［%］。研究已表明 6?:7 可促进 C7D 的分泌或活 性，影响 9 细胞亚群比例的消长，具有 ? 细胞丝裂 原样作用，可影响 .:C 摄取抗原和分泌 06,)、诱导 9A$、9A+ 转换［2］，与疫苗佐剂的作用机理具抗原递呈 作用及促进细胞因子分泌的同功之处。本实验只初步 探讨了 6?:7对体液免疫所介导的抗体生成的影响， 结果显示 6?:7可以提高抗体水平，对于其对细胞免 疫的影响等问题的研究正在进行中。同时本实验还提 示从具有良好的免疫佐剂特性的补益类中药有效成 表 # $%&’作为 ()* 疫苗佐剂的佐剂效果 与阳性组比较：!!E&’&* !!!E&’&) 与阴性组比较 F!E&’&* FF!E&’&) 第 +期 祝 峥，等：枸杞多糖作为甲型肝炎疫苗佐剂免疫效果的实验研究 +G （上接第 !" 页）新发展的一门技术［!］，值得推广应 用。 ［参考文献］ ［"］黄泰康#常用中药成分与药理手册［$］#北京：中国医药科 技出版社，"%%%#&’()&’’# ［*］何进，毕殿洲，刘宝庆#大蒜油!)环糊精包合物的稳定性 观察［+］#中国药学杂志，"%%,，(*（!）：*"’)*"&# ［(］卢智玲，徐德生，冯怡，等#!)环糊精及其衍生物在药物制 剂中的应用［+］#中国药师，*--.，&（%）：,&&),%-# ［!］李军，彭向前，张鉴#!)环糊精在中药制剂中的应用［+］#中 国药业，*--.，"!（’）：*’)*,# （编辑：岳胜难） #$%&’( )* +,$-.$/)* )0 $1’ 2)3.$/3’ 4/3( .*& 5-’6.-.$/)* 7’81*)3)9: )0 $1’ !;<= <:83/&’,$-/* .>)%$ $1’ ?%.*9 =/ @/ A/.* 53.* /012 34)54，1612 /7)89:8 ，;612 <4:8)=>? （@4:A?:8 2>:>B75 C9DE?F75 9G HI>:8J4 $?5?F7BK，/4::7: @4:A?:8 ’.--(*，HI?:7） BC#7DB<7：LMN>OF?P>：Q9 J>O?J> FI> M>DF >RFB7F?9: F>OI:9598K 9G P957F?5> 9?5D 7:J FI> M>DF ?:J4D?9: F>OI:9598K 9G !)HS OKT O59J>RFB?:#$>FI9JD：QI> P957F?5> 9?5DUD O955>OF?:8 V47:F?FK ?: FI> J?GG>B>:F I94BD =7D DF4J?>J MK O9:FB7DF?:8 F>DF ，7:J P957F?5> 9?5D !)HS OKO59J>RFB?:UD WB>E7B7F?P> F>OI:9598K O9:J?F?9: =7D D?GF>J =?FI 9BFI989:75 F>DF# X>D45F：QI> M>FF>B I94BD 9G P957F?5> 9?5D ?D >?8IF I94BD，FI> M>DF F>I:9598K 9G P957F?5> 9?5D !)HS OKO59J>DFB?: ?D " Y’，F99 DFBB?:8 DE>>J ?D "--B Z A?:，?:O54D?9: 7:J O9:F7?: F>AE>B7F4B> ?D !-[，7:J FI> F?A> ?D FIB>> I94BD# H9:J4D?9:：QI?D >RFB7OF?9: ?D B>7D9:7M5> 7:J M> 4D>J G9B EB7OF?O75 EB9J4OF?9:# E+F G4D=#：\957F?5> L?5>；!)HS HKO59J>RFB?:；WB>E7B7F?9: Q>OI:9598K 分中研制开发新型人用疫苗佐剂将具广阔前景。 ［参考文献］ ［"］欧阳洁，胡云章，钱子刚#中药免疫活性多糖作为疫苗佐剂 的研究进展［+］#云南中医学院学报，*--*，*.（*）："!)",# ［*］祝峥#补益类中药有效成分作为人用新型疫苗佐剂的研究 ［+］#生物技术通讯，*--!，".（"）：%*)%!# ［(］姚伟，李玉，任魁，张岩锐，等 #0W] 作为重组（HCL 细胞） 乙型肝炎疫苗佐剂的安全性及免疫效果［+］#中国生物制 品学杂志，*--*，".（!）：*"")*"(# ［!］]O785?9:> ^，H7FF7:>9 2，05>DD7:JB?7 $ >F 75# _GG?O7OK 7:J ]7G>FK 9G FI> ]F7:J7BJ?‘>J 2?:D>:8 _RFB7OF 2"". G9B W9F>:F? 7?:8 \7OO?:7F?9: 087?:DF FI> 6:G54>:‘7 ]K:JB9A> 7:J WB9F>O F?9: 087?:DF FI> H9AA9: H95>［+］# SB48D _RE H5?: X>D，"%%’ **（*）：’.),*# ［.］X?P>B7 _#，C4 ]， H9:OI7 H#2?:D>:8 7:J 054A?:?4A CK JB9R ?J> 0OF ]K:>B8?DF?O755K 7D \7OO?:>7 0J?4P7:FD［+］# \7O O?:>，*--(，*"：""!%)"".,# ［’］a?5557A _# W745，X9M>BF 0# ]>J>B#3KAEI9OKF> X>DE9:D>D 7:J HKF9b?:>D［+］# H>55，"%%!，,’（*）：*!")*."# ［,］汤一苇#疫苗佐剂研究进展［+］# 国外医学（预防、诊断、治 疗用生物制品分册），"%%’，"%（(）："-,)""-# ［&］倪峰#免疫活性的中药多糖［+］#福建中医学院学报，*--"， "（"）：.,).&# （编辑：迟越） +,6’-/H’*$.3 #$%&: )* IHH%*’ +00’8$ )0 JC5 .( B&K%L.*$ )0 ?B2 2.88/*’ cCd cI>:8"e;601 c?)87:8*eC4 /4:)‘I7:8(eCd 1?:8)‘I4(ecCd HI7:8)OI>:8* f"#]OI995 9G EI7BA7OK，HI?:7 $>J?O75 d:?P>BD?FK，]I>:K7:8 ""---"eHI?:7；*#]OI995 9G WI7BA7OK e/4::7: H955>8> 9G QH$， @4:A?:8 ’.-*--，HI?:7；(#6:DF?F4> 9G $>J?O75 g?9598K ，HI?:>D> 0O7J>AK 9G $>J?O75 ]O?>:O>D，W>b?:8 d:?9: 9G $>J?O75 H955>8> ，@4:A?:8 ’.-""&h BC#7DB<7：LMN>OF?P>iQ9 DF4JK FI> >GG>OF 9G 3gW]（FI> E95KD7OOIB7?J> >RFB7OF>J GB9A !"#$%& ’()’()%& ）M>?:8 4D>J 7D FI> 7JN4P7:F 9G C0\ P7OO?:># $>FI9J：6AA4:?‘?:8 A?O> =?FI -#"A5 9G ?:7OF?P> C0\)7:F?8>:（I>E7F?F?D 0 P?B4D）O9AM?:?:8 =?FI 3gW] ?: J9D>D 9G *-A8，"-A8，.A8 B>DE>OF?P>5K 7:J ?AA4:?‘?:8 =?FI -#"A5 9G ?:7OF?P> C0\ P7OO?:> O9:D?DF>J 9G 05（LC）()8>5 7JN4P7:F O9AM?:?:8 =?FI 3gW] ?: J9D>D 9G *-A8，"-A8，.A8 B>DE>OF?P>5K# _36]0 F>DF FI> 7:F?)C0\（682）9G FI> A?O> 7GF>B !，&，"*，"’ 7:J *- =>>bD# X>D45F：3gW] ?: J9D> 9G "-A8 I7D FI> D?8:?G?O7:F P7OO?:75 7JN4P7:F >GG>OF# H9:O54D?9:：3gW] ?D 7 E9F>:F 7JN4P7:F 7EE5?>J G9B I4A7: P7OO?:>D# QI> 7OF475 G4:OF?9: 9G P7OO?:75 7JN4P7:F >GG>OFD ?D O9AE7B7M5> 9G 05（LC）()8>5 7JN4P7:F# E+F G4D=#：3gW]；\7OO?:>；0JN4P7:F *--’年 云南中医学院学报 第 *%卷 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 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