动物细胞的灌注培养方法

动物细胞的灌注培养方法 收稿日期: 1998—06—02 丛春水　邓继先* 　苏志国 (大连理工大学生化工程研究所,大连, 116012) * (军事医学科学院生物工程研究所,北京, 100071) 　　随着基因技术的发展, 细胞融合技术和 杂交瘤技术在细胞中的应用, IFN、EGF、t - pA、UK、EPO 等一些高价值的蛋白,相继在 动物细胞中达成功。但是,同传统的微生物 细胞培养相比, 动物细胞培养存在着细胞倍 增时间长、代谢途径复杂、对营养的要求高、 对外界环境如温度、pH、溶氧、渗透压、剪切 力的敏感性强、细胞状态容易改变等问题, 大 大增加了动物细胞培养的难度。如何完善细 胞培养技术,提高动物细胞大规模培养的产 率,一直是国内外研究的热点之一。 1　灌注培养 　　常用的动物细胞培养方法有分批培养、 补料分批培养、连续培养,但产率一直不高。 直到六十年代,灌注培养技术的出现[ 1] ,为动 物细胞高密度大规模培养开辟了广阔的前 景。在随后的三十年中,灌注培养技术得到了 迅速地发展,已成为动物细胞大规模培养的 主要方法。 在灌注培养中, 细胞保留在反应器系统 中,收获培养液的同时不断地加入新鲜的培 养基[ 2]。灌注培养的主要优点是连续灌注的 培养基可以提供充分的营养成分,并可带走 代谢产物,同时,细胞保留在反应器系统中, 可以达到很高的细胞密度。同其他方法相比, 灌注培养的产率可以提高一个数量级, 并可 大大降低劳动力消耗[ 3]。 灌注培养主要可分为两大类:悬浮灌注 培养和床层培养(图 1)。悬浮灌注培养是在 普通悬浮培养的基础上,加上一个细胞分离 器而成, 以微载体悬浮培养加旋转过滤分离 器最为常见。床层培养则把细胞直接保留于 床层,不需要细胞分离器,其中堆积床和大孔 载体培养的应用较广。 2　灌注培养方法 在灌注培养前, 对动物细胞的生长和生 理特性进行充分的考察,是十分必要的,能为 灌注培养提供有益的参考。以比生长速率为 例,大量实验表明, 细胞的比生长速率降低 时,产物的比生长速率提高。Miller [ 4]控制细 胞的比生长速率为最大比生长速率的 60% 抗体生长速率增加了 97%。一般说来,灌注 培养可以从两个方面入手, 一是改变动物细 胞的培养环境,实行阶段培养;二是进行代谢 调控。 2. 1　阶段培养 一般认为,动物细胞的培养条件应尽量 模拟来源动物体内的条件, 而且在培养中通 常保持不变。而实际上,每种细胞的最适生长 条件和最适产物生成条件是不同的。阶段法 培养就是根据这一点,把培养过程分为细胞 生长期和产物生成期,分别采取不同的培养 生物技术 9( 2) : 26—30, 1999 Biotechnology 条件, 以达到在细胞生长期使接种细胞大量 繁殖,提高比生长速率, 尽快获得高密度细 胞;在产物生成期保持细胞的高密度,维持存 活率,降低细胞死亡速率,持续获得高产率蛋 白的目的。当产物蛋白对细胞有抑制时,阶段 培养尤见优势。具体说来, 可以用以下方法。 2. 1. 1　温度阶段培养 来源不同的动物其最适生长温度不同。 昆虫细胞为 25～28℃,禽类细胞为 3 8. 5℃, 冷、凉、温水鱼细胞各为 20℃、23℃、26℃, 哺 乳动物细胞的最适温度为 37℃。温度越高, 细胞的代谢越旺盛, 但同时细胞的死亡速率 增大。温度降低,细胞的比生长速率降低,当 温度的降低不足以降低细胞的正常生理功能 时,产物蛋白产率增加。所以,细胞的最适生 成速度一般比最适生长速度低。Mer ten等[ 5] 报道, 在较低的温度下培养人—鼠杂交瘤细 胞,增加了细胞的基因稳定性, 提高了存活 率,单抗在较长的时间内保持较高的产率。如 果温度降低太大, 就会使细胞的正常生理功 能不能顺利进行,尽管存活率提高,但目标蛋 白的产率却会下降。 灌注培养 悬浮培养 直接悬浮培养 微载体悬浮培养 + 细胞分离器 过滤装置 反冲过滤器 错流过滤器 涡流过滤 超声过滤 板框过滤 中空纤维 旋转过滤器 液固分离装置 沉降离心 床层培养 流化床 多孔玻璃球培养大孔载体培养 固定床 空中结维床或多孔陶瓷系统 微囊化或包埋培养 堆积床培养 图 1　灌注培养分类 2. 1. 2　pH 值阶段培养 对大多数动物细胞,培养液中合适的pH 为 7. 2—7. 4。低于 6. 8或高于 7. 6对细胞的 生长都不利。近年来,对胞内pH 的研究比较 活跃。实验发现[ 6, 7, 8] ,胞内 pH 对细胞的代谢 影响很大, 胞内 pH 降低 0. 2个单位,就足以 使磷酸果糖激酶失活, 抑制糖酵解途径,使细 胞的生长受阻;而胞内 pH 升高 0. 2个单位, 可以提高糖酵解速度 50%。胞外pH 的降低 和培养液中铵离子浓度的提高,都能引起胞 浆酸化,胞内 pH 降低。研究发现, 胞内pH 降 至 6. 6,会使胞内 pH 下降 0. 2个单位下降; 培养液中铵离子浓度在 3mM, 胞内 pH 下降 0. 1个单位。达到 10mM,胞内 pH 下降 0. 2—0. 3个单位。培养液中乳酸的存在,向培 养液中添加血清或胰岛素, 都会使胞内 pH 上升。有人把 CO2的浓度由 5%降为 2. 5%, 胞内pH 提高了0. 2个单位[ 9]。胞内pH 比胞 外 pH的检测麻烦[ 10] , 所以还没有广泛应用。 但可以预先进行考察,在培养中利用的易检 测的参数间接控制。Miller[ 11]在考察 pH 对 细胞的影响时,发现细胞的 pH 是 7. 1—7. 4, 而在pH6. 8,细胞的比抗体生成速率是pH7. 1—7. 4的三倍。另外, 从理论上讲,由于细胞 是两性物质, 胞外 pH 还应对产物蛋白的分 泌有影响,可并未见报道。 2. 1. 3　溶氧阶段培养 动物细胞利用氧参与三羧酸循环, 产能 27丛春水等:动物细胞的灌注培养方法 供细胞生长, 增殖,合成各种成分。不同细胞 和同一细胞在不同生长时期对氧的需求均不 相同。Reuveny S. [ 3]发现细胞生长的最适溶 氧值为 60%, 但有人发现杂交瘤的最适溶氧 为 100%。一般说来,溶氧主要影响细胞的繁 殖,而对产物的生成无直接影响,通过影响细 胞生长间接起作用。通常在细胞生长初期控 制溶氧的较低的水平, 在对数生长期,当细胞 达到较高的浓度时,提高溶氧水平;在产物生 成期,应控制溶氧的适当水平。溶氧过高, 细 胞就会加速消耗营养物质, 产生许多代谢产 物。这些代谢产物对细胞有抑制作用,会大大 降低细胞的存活率,降低产物的比生成速率。 溶氧过低,细胞过氧的需求得不到满足,依然 会降低产物蛋白的产率。 Reuveny S. [ 3] 采用低于最适溶氧值 ( 60%)之下的溶氧值 25%, 以维持细胞的存 活率,单抗产率提高 50%。Ramir ez O. T . [ 12] 在培养杂交瘤细胞的过程中, 发现摄氧率与 细胞周期的各个阶段密切相关。比耗氧速率 在 G0 和 G1期最小, 而细胞在 G0和 G1 期 的蛋白产率最高。所以在产物生成期的溶氧 浓度应比对数生长期的低。在产物生成期, 控 制溶氧的较低的又不引起溶氧限制的水平, 还可以降低产物蛋白所受的氧化作用和酶解 作用[ 13] , 有利于维持蛋白的稳定性。 2. 1. 4　化学试剂诱导阶段培养 如果构建的细胞上有可诱导基因, 进入 产物生成期后, 就可以添加化学试剂对基因 进行诱导,以实现目的基因的高表达, 比如, 将表达尿激酶原和二氢叶酸还原酶基因的两 个转录单位置于同一载体, 分别受金属硫 (MT )和 SV40早期启动子控制, 具有用氨甲 喋呤(MTX)使基因扩增和利用金属 Zn2+ 诱 导的双重功能,有利于尿激酶的高表达。通常 用的诱导剂还有 IPTG和 IAA。 2. 1. 5　Suzuki[ 14]建立了杂交瘤细胞的细胞 周期模型, 他发现在 G1 期的细胞比其他时 期的细胞抗体产生速率高。因此,在细胞生长 期,应创造条件,使细胞周期尽量缩小, 细胞 大量繁殖;进入产物双重生成期,应寻找使细 胞周期停滞在 G1期并维持 G1期细胞存活 率的方法。可以采用 ILE 缺乏的方法[ 15] , 控 制 ILE的量, 使之既能抑制 DNA 的合成, 又 能维持细胞的蛋白合成功能, 使目标蛋白依 然能够合成。ILE 的量控制要适度,否则, 在 指数期后达到静止期时会降低多核糖体的含 量,降低蛋白的合成能力。还可以添加药物抑 制, 也有报道[ 14]使用胸苷成功地用于停滞 Hela细胞在 G1期达 200h;或使 cAMP 的浓 度过量,停滞杂交瘤细胞 70h,抗体的比生成 速率提高了 37%。还有人用丁酸钠停滞细 胞[ 16]。 细胞在细胞周期的不同时期,不仅蛋白 的分泌速率不同, 而且所分泌蛋白的类型和 糖基化程度也可能不同[ 17]。因此,研究并控 制细胞的生理状态很重要。然而,在细胞培养 中,细胞生理状态的检测很麻烦。有人发现, 细胞大小随各时期变化很明显,因此可以作 电子细胞计数器就行了。 分段培养应结合具体的培养条件进行。 有些细胞的最适生长温度和产物生成温度相 同,就不能进行温度阶段培养,而应寻找别的 差异条件。在细胞生长期有的细胞可能会因 比生长速率过大而产生非生产性细胞[ 20] , 这 时就应控制比生长速率在一个适当的范围。 3　代谢调控培养 乳酸和氨是在培养过程中动物细胞产生 的主要代谢产物[ 21, 22] ,对细胞的正常生理功 能在抑制甚至毒害作用。在分批培养和补料 分批培养中的这一问题尤为突出。尽管灌注 培养可以通过提高灌注速度来去除抑制产 物。但是,一方面由于灌注培养细胞浓度很 高,提高灌注速率, 营养成分的供给十分充 分,氨和乳酸的产生速率也增加了。另一方 28 生　物　技　术　　　　　　　　　　　　9卷 1期 面,过高的灌注速率提高了细胞的比生长速 率,降低产物的比产率,加上细胞对营养的利 用并不彻底, 培养液中会残留大量的蛋白, 造 成提取纯化的不便和培养基的浪费。所以, 在 培养中调控动物细胞的代谢途径一直较受重 视。通过代谢调控[ 23] ,可以减少副产物的产 生,降低细胞的死亡速率,还可以控制灌注速 率和培养液成分, 控制细胞的状态和比生长 速率,以提高目标蛋白的产率。具体有以下方 法。 3. 1　控制葡萄糖浓度法 乳酸是葡萄糖代谢的副产物,一般认为 乳酸对细胞的生长有制作用。乳酸浓度升高, 会导致比生长速率降低, 比死亡速率升高。 Saclet in S. Ozturk [ 9]发现, 在培养液中加乳 酸至 55mM,细胞的比生长速率降低了一半。 乳酸的降低可更换葡萄糖为己糖如果糖或半 乳糖[ 24, 25] , 还可限制葡萄糖减少乳酸的生 成,使初始葡萄糖浓度较低,在培养过程中再 添加[ 26]。以后者较为常用。 在控制葡萄糖浓度法培养中,生长期可 以使葡萄糖浓度稍高, 以促进细胞生长;在产 物合成期降低葡萄糖的浓度, 降低乳酸的产 生速率, 避免乳酸的积累,减少毒害, 降低死 亡速率,维护持活细胞数在较高水平。同时还 可以降低比生长速率,增加目标蛋白的产生 速率。对一些乳酸耐受力强的细胞,这一方法 比较适合。 灌注葡萄糖的同时, 要间歇或连续地加 入其他组分, 以避免营养缺乏,其中谷氨酰胺 要保持在较低水平, 因为细胞的生长不依赖 糖酵解[ 26] , 即使没有葡萄糖,细胞仍可以通 过降解谷氨酰胺获得能量。假如谷氨酰胺的 浓度过高,细胞就会偏向谷氨酰胺酵解,从而 削弱这种方法的效果。由于葡萄糖的价格相 对低廉,这种方法很有前途。 3. 2　控制谷氨酰胺法 上面提到,没有葡萄糖,细胞可以利用谷 氨酰胺作能量物质。因此,控制谷氨酰胺比控 制葡萄糖要容易些, 应用这一方法的报道也 较多[ 27]。控制谷氨酰胺浓度的目的,主要是 减少氨的产生。氨对细胞的毒性比乳酸大得 多,表现为降低比生长速率,增加死亡速率。 氨来自谷氨酰胺生成谷氨酸和谷氨酸生成 A - 酮戊二酸途径。研究[ 28]发现,对MDCK、杂 交瘤细胞、BHK 细胞, 其摩尔 NH4+ /摩尔谷 氨酰胺分别保持为 1、0. 5、1. 55。所以,降低 谷氨酰胺的浓度, 能降低氨的产生。Jan Ljunggren[ 29]详细地研究了动物细胞的代谢 过程, 采用底物限制补料分批工艺对动物细 胞进行代谢控制。他采用这一方法,使氨的浓 度降低了一半。控制谷氨酰胺法与控制葡萄 糖法一样,要维持葡萄糖在较低水平。 3. 3　控制葡萄糖和谷氨酰胺法 在细胞中,葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢 密切相关。Miller [ 11]表明葡萄糖消耗上升,则 谷氨酰胺消耗下降,反之亦然。在相当大的一 个范围内,葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率与 其浓度成正比。控制葡萄糖和谷氨酰胺法可 降低乳酸和氨的产生,还能有效控制比生长 速率。在细胞生长期, 提供充分的营养,供细 胞的需要;在产物合成期,降低葡萄糖和谷氨 酰胺的浓度或流量,降低比生长速率,增加目 标蛋白的产率。Hideo Kurokawa 等[ 30]用 HPLC在线测量葡萄糖、谷氨酰胺或乳酸的 浓度,用“适应控制算法”同时控制葡萄糖和 谷氨酰胺的浓度,减少了乳酸和氨的产生,提 高了抗体的产率。de al Broise, D[ 31]用灌注 培养使产物生成期细胞处于营养限制下, 降 低比生长速率, 增加目标产物的产率。JoEui - Cheol等[ 32]在 RPMI1640培养基的基础上 构建了一种新的“平衡、增强高密度培养基” 用于细胞生长期,显著提高了细胞密度,但同 时发现代谢产物的产生也增加了。尽管如此, 最后产物的产率仍提高了 5—8倍。 3. 4　代谢产物的去除 29丛春水等:动物细胞的灌注培养方法 通常使用透析膜, 超滤腊或吸附剂选择 性去除乳酸、氨或铵离子[ 33]。有人建议加化 学试剂比如钾盐来消除氨的影响[ 34] ,也有人 建议可使用有谷氨酰胺合成酶的细胞[ 35]。 图 2　细胞培养与产物分离的耦合系统 　　灌注培养发展到现在, 还有许多急待解 决的问题。其最大的缺点是培养基的利用不 充分,造成一定的浪费。随着细胞培养技术和 产品分离技术的进一步发展, 建立细胞培养 与产物分离的耦合系统(图 2) , 能充分利用 培养液,降低生产成本,一直是人们追求的目 标,这里就不赘述。 参考文献 [ 1] Himmelfarb P. 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Culter ( Plant Biotechnology I nst itu te, Nat ional Resear ch Council of Canada, Canada) A method for in situ tr ansformat ion, vaccum infilt ration is pr esented. T he approach is vaccum infilt rat ion of a suspension of Agrobacterium cells containing T - DNA vector into Arabidopsis tha liana; thereby the t ransformed seeds can be harvested direct ly. This r epro- ducible, non - t issue cultural procedure yields stably t ransformed A. thal iana seeds and its t ransformat ion frequency is high enough for int roducing foreign genes and characterizing their expr ession. Key Words : vaccum infilt rat ion, in planta t ransformation, Arobidopsis thal iana (接第 30页) [ 25] Immamura, T . , et al. Fructos e as a carbohydrate source yields stab le pH and redox p arameters in mi- crocarrier cell culture, An alytical Biochem. 1982, 124: 353- 358 [ 26] Zielke, H. R. , et al. Recipr ocal r egulat ion of glucose and glutamine ut ilizat ion by cul tu red human diploid fi- broblas ts , J . Cell . 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