重组人红细胞生成素对骨髓间充质干细胞红细胞生成素受体的上调作用

重组人红细胞生成素对骨髓间充质干细胞 红细胞生成素受体的上调作用 李长岭 1 , 樊友启 1 , 傅国胜 1 , 范伟民 2 , 孙 　勇 13 (1. 浙江大学医学院附属邵逸夫医院心内科 , 浙江 杭州 　310016; 2. Patholog ica l and M edicine D epartm en t, M edica l U niversity of Sou th Carolina, Sou th Carolina　29403, USA ) 摘要 : 目的 　研究重组人红细胞生成素 ( rhEpo)处 理骨髓间充质干细胞 (MSCs)后对 Epo受体 ( EpoR ) 的影响。方法 　含 rhEpo 0, 5及 10 kU·L - 1的培养 基培养 MSCs 24, 48及 72 h后 ,MTT法检测细胞增 殖 ; 6 d后 ,免疫荧光染色检测 EpoR阳性的细胞百 分率。 rhEpo 预处理 24 h, 再缺氧处理 48 h, Hoechst染色 ,通过形态变化检测细胞凋亡率 ; rhEpo 预处理 6 d,再缺氧处理 48 h,W estern蛋白印迹法检 测 EpoR,磷酸化 Janus激酶 2 (p2Jak2) ,磷酸化转导 及转录活化蛋白 (p2Stat5)及缺氧诱导因子 21a (H if2 1a)蛋白表达。结果 　MTT结果显示 , rhEpo处理的 MSCs增殖能力增强 ;免疫荧光结果显示 ,随 rhEpo 浓度的增加 , EpoR阳性细胞数增加 ;对照组 , rhEpo 5及 10 kU·L - 1组 EpoR 阳性细胞百分率分别为 (8. 3 ±4. 2) % , (24. 7 ±8. 1) %和 (30. 8 ±10. 5) %。 rhEpo预处理能增强 MSCs抗缺氧凋亡的能力 ,缺氧 处理后 , 对照组、rhEpo 5及 10 kU·L - 1组细胞核固 缩率分别为 (42. 2 ±8. 7) % , (21. 9 ±8. 0) %和 (20. 1 ± 7. 9) %。W estern蛋白印迹结果显示 , rhEpo预处理 及预处理后行低氧培养的 MSCs,随 rhEpo浓度的增 加 , EpoR及下游抗细胞凋亡蛋白 p2Jak2, p2Stat5和 H if21a蛋白表达增加。结论 　 rhEpo可以促进 MSC EpoR的表达 ,并增加 EpoR下游抗细胞凋亡蛋白的 表达。 关键词 : 受体 , 红细胞生成素 ; 骨髓间充质干细胞 ; 蛋白表达 ; 细胞凋亡 中图分类号 : R966 文献标识码 : A 　 　　收稿日期 : 2008209218　接受日期 : 2009201221 　　作者简介 : 李长岭 (1973 - ) ,男 ,浙江杭州人 ,主治医 生 ,硕士 ,从事心血管药理临床和基础研究。 　　 3 联系作者 　 E2mail: richard2002 @ zj. com 　 Tel: (0571) 86006248 文 章 编 号 : 100023002 (2009) 0220122206 DO I: 10. 3867 / j. issn. 100023002. 2009. 02. 007 　　骨髓间充质干细胞 ( bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)是重要的组织修复候选干细胞 , 有实验 ,MSCs在体内可以修复损伤的心肌组织 并改善心脏功能 [ 1 ]。然而 ,损伤组织微环境的改变 及炎症反应 ,促进了 MSCs的凋亡 ,不利于 MSCs局 部存活和修复作用 [ 2 ]。使用转 bcl22基因的 MSCs 移植到损伤区域 ,虽然能够减少 MSCs的凋亡 ,但是 转基因细胞存在致瘤性可能 [ 3 ]。重组人红细胞生 成素 ( recombinant human erythropoietin, rhEpo)除了 对造血系统的影响外 ,还有抑制细胞凋亡作用 [ 4 ]。 本研究采用 rhEpo 处理 MSCs, 观察 Epo 受体 ( EpoR)及下游抗细胞凋亡蛋白变化 ,了解其对 MSC 抗缺氧凋亡的影响。 1　材料与方法 1. 1　试剂和仪器 rhEpo购自美国 Sigma公司 ;兔抗鼠 EpoR (一 抗 ) ,磷酸化 Janus激酶 2 (p2Jak2) ,磷酸化转导及 转录活化蛋白 ( p2Stat5 )及缺氧诱导因子 21a ( H if2 1a)购自美国 Santa Cruz公司 ;罗丹明标记山羊抗兔 IgG(二抗 )、碱性磷酸酶标记山羊抗兔 IgG(二抗 )及 NBT/BC IP显色液购自美国 Pierce公司 ; Hoechst染 色剂购自北京海德生物公司 ; CKX41232PH型荧光 显微镜 :日本 O lympus公司 ; Heracell250二氧化碳培 养箱 :德国 Heracell公司 ; Model550酶标仪和 Facs2 calibur流式细胞仪 :美国 BD公司。W estern蛋白印 迹积分吸光度测定使用 Bandscan 5. 0软件。 1. 2　M SC s的分离培养 [ 5]及处理 C57 BL /6小鼠氟烷过度麻醉后 ,在无菌条件下 分离股骨 ;使用消化液 (0. 25%胰酶 + EDTA液 ) ,冲 ·221· 中国药理学与毒理学杂志 Chin J Pharm acol Tox icol 　　2009年 4月 ; 2009　　Ap r; 　 23 (2) : 122 - 127 23 (2) : 122 - 127 刷股骨髓腔得到骨髓 ;使用消化液反复冲击离散骨 髓。消化 10 m in后 , 10 ×g离心 5 m in,留上清液 ,置 于 70% Percoll液上层 , 400 ×g离心 30 m in。取中 层 ,接种培养。使用含 10%胎牛血清、100 kU·L - 1 青霉素和链霉素的 DMEM培养基 , 37℃, 5% CO2 培 养箱中培养 , 48 h后换液去除悬浮细胞。生长密度 达到 70% ～80% ,消化传代。使用第 4代细胞用于 实验。待细胞经过传代培养 ,扩增到 106 ～107个后 , 用 0. 25%胰酶 + 0. 02% EDTA液的将贴壁细胞消化 分离。离心后收集细胞 ,计数 , PBS洗涤 2 遍 ,用 PBS悬浮细胞 ,密度为 1 ×106 L - 1。将收获的骨髓 MSCs 2 ×105 个分别和 CD29, CD34, CD45 和 CD166单抗室温反应 30 m in,用流式细胞仪进行纯 度。结果显示 ,细胞表达 CD166和 CD29阳性 , 而 CD34和 CD45阴性 ,符合 MSCs表面抗体特性。 根据培养基 rhEpo浓度 ,细胞分为 3组 :正常对照 组 , rhEpo 5及 10 kU·L - 1组。 1. 3　M TT法 [ 6]检测细胞增殖 1∶5接种细胞后 ,当细胞长满 30%面积时 ,按分 组处理干预 24, 48及 72 h, 检测细胞增殖情况。去 培养液 ,每孔加 0. 1 mL PBS和 10μL MTT染液 ,继 续培养 4 h。每孔加 10% SDS 0. 1 mL,振荡混匀。 置酶标仪上测定吸光度 (A )值 ,检测波长 570 nm,参 考波长 630 nm。 1. 4　免疫荧光染色法检测 EpoR阳性率 细胞处理 6 d后 ,使用多聚赖氨酸包被盖玻片 , 作为细胞爬片载体 ,接种细胞 24 h取出。4℃丙酮 固定 , Triton X2100透化处理 , PBS液反复清洗。含 3%胎牛血清 PBS液封闭 ,重复清洗。覆盖 EpoR抗 体 , 4℃过夜。清洗后 ,加 1∶800罗丹明标记羊抗兔 IgG二抗。细胞核 Hoechst染色 ,清洗干净后封片。 荧光显微镜 200倍下观察 ,每组处理 20张片子 ,每 张观察 10个视野 ,计数视野内红色细胞及细胞核总 数。EpoR阳性率 ( % ) =核红色细胞数 /细胞核总 数 ×100%。 1. 5　Hoechst染色测定细胞凋亡率 细胞培养处理 24 h后 ,缺氧 (1%O2 )培养 48 h。 每组做 20张细胞爬片 , Hoechst染色细胞核 ,每张于 荧光显微镜 200倍下观察 10个视野 ,计数视野内细 胞核固缩个数及细胞核总数 [ 7 ]。细胞核固缩率 ( % ) =细胞核固缩数 /细胞核总数 ×100%。 1. 6　W estern蛋白印迹法检测蛋白表达 rhEpo预处理及预处理 6 d后缺氧培养 48 h的 MSCs作为检测对象。刮拭收集细胞 ,裂解后提取总 蛋白。各蛋白提取后定量 ,取 100μg蛋白样品 ,加 SDS缓冲液 , 100℃水浴 5 m in修复抗原。10%梯度 胶上样电泳 ;而后转膜、封闭 ,加入相应的一抗连接 , 反复冲洗 ;而后二抗碱性磷酸酶标记。BC IP /NBT 试剂盒显色。检测蛋白包括 EpoR, p2Jak2, p2Stat5 和 H if21a,β肌动蛋白为内参照。经计算机扫描 ,进 行灰度测定 ,以各蛋白与β肌动蛋白条带积分吸光 度值 ( integrated absorbance)之比作为该蛋白表达的 相对数值。实验重复 5次。 1. 7　统计学分析 计数数据用 珋x ±s表示 ,数据采用 SPSS 12. 0统 计学软件 ,行单因素方差分析 (ANOVA ) ,组间均数 比较采用 t检验。 2　结果 2. 1　rhEpo对细胞增殖的影响 对照组 , rhEpo 5及 10 kU·L - 1组的 A值在 24 h 分别为 ( 0. 13 ±0. 02 ) , ( 0. 13 ±0. 02 )和 ( 0. 12 ± 0. 02) ; 48 h分别为 ( 0. 20 ±0. 02) , ( 0. 26 ±0. 03) 和 (0. 24 ±0. 01) ; 72 h分别为 (0. 31 ±0. 03) , (0. 40 ± 0. 02)和 (0. 39 ±0. 04) ;其中 5及 10 kU·L - 1两组在 48 h和 72 h高于对照组 ( n = 18, P < 0. 05) ,说明 rhEpo处理可以促进 MSCs的增殖能力 ;而 5与 10 kU·L - 1组无显著差异 ,说明超过一定浓度后 ,细胞 EpoR和 rhEpo结合出现饱和现象 ,从而促进增殖的 能力不再增加。 2. 2　rhEpo对细胞 EpoR阳性率的影响 由图 1 中可见蓝色为细胞核 , rhEpo 处理后 EpoR阳性细胞数增加 , rhEpo处理可以促进 MSCs 细胞中的 EpoR 的上调表达。处理 MSCs 6 d后 , 3组 EpoR 阳性细胞比率分别为 ( 8. 3 ±4. 2 ) % , (24. 7 ±8. 1) %和 (30. 8 ±10. 5) %。其中 5 kU·L - 1 组高于对照组 ( n = 20, P < 0. 05) ; 10 kU·L - 1组高于 5 kU·L - 1组 ( n = 20, P < 0. 05)。 2. 3　rhEpo对缺氧导致的细胞凋亡的影响 由图 2可见蓝色为细胞核 ,其中花环状细胞核为 固缩细胞核。对照组、rhEpo 5和 10 kU·L - 1 ,MSCs预 处理 24 h 后 ,低氧处理 48 h,核固缩率分别为 (42. 2 ±8. 7) % , (21. 9 ±8. 0) %和 ( 20. 1 ±7. 9) % ( n = 20, P < 0. 05) ; 5和 10 kU·L - 1组无显著差异。 说明 rhEpo处理可以促进 MSCs抗缺氧凋亡能力。 ·321·中国药理学与毒理学杂志 　　2009年 4月 ; 23 (2) F ig 1. 　Effect of recom b inan t human erythropo ietin ( rhEpo ) on Epo receptor in m esenchyma l stem cells (M SC s) by imm unofluorescence ( ×200). After 6 d treatment with rhEpo, MSCs were subjected to immunofluorescence of EpoR antibody. The red cells are EpoR positive cellswhich are marked with white arrows. A: control; B: rhEpo 5 kU·L - 1 ; C: rhEpo 10 kU·L - 1. F ig 2. 　Effect of rhEpo on m itotic arrest of M SC s under hypox ia ( Hoechst imm unofluorescence sta in, ×200). After 24 h rhEpo treatment and 48h hypoxia (1% oxygen) treatment, MSCs nucleis are stained with Hoechst into blue. M itotic arrest nucleis are looked like floral hoop which are marked with white arrows. A: normal control; B: hypoxia ( + ) ; C: rhEpo 5 kU·L - 1 ; D: rhEpo 10 kU·L - 1. 2. 4　rhEpo对抗细胞凋亡蛋白的影响 由图 3 及表 1 可见 ,预处理 6 d后 , MSCs的 EpoR, p2Jak2, p2Stat5和 H if21a蛋白表达 , rhEpo 10 kU·L - 1组高于 5 kU·L - 1组 ,而 5 kU·L - 1组高于对照组 ,表明处理后的细胞 EpoR下游抗凋亡蛋白表达增加 ; 预处理 6 d再低氧培养 48 h , 各蛋白表达 , ·421· Chin J Pharm acol Tox icol　2009　Ap r; 23 (2) Tab 1. 　Effects of rhEpo pre2trea tm en t on p2Jak2, H if21a, p2Sta t5 and EpoR prote in expression s in M SC s followed by hypox ia Group Protein exp ression ( IATarget p rotein ∶IAβ2Actin ) P2Jak2 H if21a p2Stat5 EpoR Normal control 0. 11 ±0. 02 0. 14 ±0. 01 0. 28 ±0. 05 0. 08 ±0. 02 rhEpo　5 0. 67 ±0. 083 0. 52 ±0. 113 0. 44 ±0. 083 0. 29 ±0. 053 　　　10 0. 98 ±0. 043 # 0. 75 ±0. 053 # 0. 68 ±0. 093 # 1. 08 ±0. 033 # Hypoxia 1. 20 ±0. 04△ 0. 03 ±0. 01 0. 10 ±0. 03 0. 18 ±0. 02 Hypoxia + rhEpo　 5 1. 42 ±0. 04△ 0. 78 ±0. 09△ 0. 45 ±0. 08△ 0. 68 ±0. 05△ Hypoxia + rhEpo 10 4. 11 ±0. 12△# 1. 08 ±0. 04△# 0. 78 ±0. 09△# 1. 38 ±0. 02△# The MSCs were treated with rhEpo for 6 d, then hypoxia treatment for 48 h. EpoR: erythropoietin recep tor; p2Jak2: phosphorylation Janus kinase 2; p2Stat5: phosphorylation signal transducers and activators of transcrip tion 5; H if21a: hypoxia2inducible factor 1a. IA: integrated absorbance. 珋x ±s, n = 5. 3 P < 0. 05, compared with normal control group; # P < 0. 05, compared with rhEpo 5 kU·L - 1 group; △ P < 0. 05, compared with hypoxia group. F ig 3. 　W estern blot ana lysis of EpoR, p2Jak2, p2sta t5 and H if21a prote in expression s of M SC s pre2trea2 ted w ith rhEpo followed by hypox ia. See Tab 1 for the rhEpo p re2treatment and hypoxia treatment. A: hypoxia ( - ) ; B: hy2 poxia ( + ). Lane 1: control; lane 2: rhEpo 5 kU·L - 1 ; lane 3: rhEpo 10 kU·L - 1. rhEpo 10 kU·L - 1组高于 5 kU·L - 1组 ,而 5 kU·L - 1组 高于对照组。缺氧环境下 , 经 rhEpo 预处理的 MSCs,无论 EpoR还是其下游抗凋亡蛋白表达均有 增加 ,且随浓度增高而增强。 3　讨论 本研究用 rhEpo可以在体外促进 MSCs增殖。 体外缺氧实验也提示 , rhEpo预处理的 MSCs能抵抗 缺氧引起的细胞凋亡。另外 , rhEpo处理的 MSCs还 出现了 EpoR上调和下游抗凋亡基因的表达增加。 以上结果表明 , rhEpo处理可以增强 MSCs的抗 凋亡作用。其机制可能为 : ① rhEpo处理可以激活 EpoR, Epo通过 EpoR磷酸化 Jak2[ 8 ] , p2Jak2进一步 磷酸化 Stat5[ 9 ] ,而后 p2Stat5可以促进 H if21a的表 达 [ 10 ]。H if21a可以在特异性缺氧状态下发挥转录 和调控抗细胞凋亡基因 ,从而起到抗细胞凋亡作 用 [ 11 ]。②rhEpo处理出现了 MSCs的 EpoR 上调 , EpoR上调后直接增强了其下游各抗凋亡蛋白的表 达 [ 12 ]。而且 EpoR上调随着 rhEpo处理浓度增加而 增强。另外一些研究提示 ,组织损伤时 EpoR表达 增强 ,如 Sirén等 [ 13 ]通过组织活检发现 ,在缺血的脑 组织中 Epo及 EpoR有大量的表达。究其原因 ,可 能存在 Epo2EpoR2H if2Epo的正反馈信号通路。这 种受体上调的通路具体过程还需要进一步研究证 明。 ·521·中国药理学与毒理学杂志 　　2009年 4月 ; 23 (2) rhEpo处理 MSCs增殖作用来源于 EpoR下游 p2Stat5的活化。p2Stat5通路接受细胞外信号刺激 , 调节细胞增殖、分化及凋亡 [ 14 ]。其作为上游酪氨酸 激酶通过调控靶基因而诱导某些关键产物的表达来 影响细胞增殖 , 重要的靶基因产物包括影响细胞凋 亡的 B细胞淋巴瘤 /白血病 22 (Bcl22)家族 ; bcl22基 因启动子上存在多个 Stat5结合位点 , p2Stat5可直 接与 bcl22启动子结合而启动转录和细胞增殖 [ 15 ]。 综上 ,在体外通过 Epo处理 MSCs细胞可以促 进 EpoR的表达 ,并且增加 EpoR下游抗细胞凋亡基 因的表达 ,从而增强 MSCs的抗细胞凋亡和增殖作 用。 4　参考文献 : [ 1 ]　W ang JA, L i CL, Fan YQ, He H, Sun Y. 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M ETHOD S　M SCs were treated with culture medium which contained rhEpo 0, 5 and 10 kU· L - 1 , the p roliferation of cells was obtained by MTT method at 24, 48 and 72 h. The EpoR positive ratio was figured by fluorescence immu2 nity after rhEpo treatment for 6 d. The m itotic arrest to reflect apop tosis observed by Hoechst staining after 24 h p retreatment with rhEpo and 48 h hypoxia. Exp ressions of EpoR, phospho2 rylation Janus kinase 2 (p2Jak2) , phosphoryla2 tion signal transducers and activators of tran2 scrip tion 5 (p2Stat5) and hypoxia2inducible fac2 tor 1a (H if21a) were analyzed by W estern blot after rhEpo p reteament for 6 d or rhEpo p re2 treatment for 6 d followed by hypoxia 48 h. RESUL TS　The p roliferation of M SCs treated with rhEpo was stronger than that of control group. Pretreatment with rhEpo could p revent MSCs from hypoxia apop tosis. The m itotic ar2 rest ratios of 3 group s were (42. 23 ±8. 70) % ,(21. 94 ±8. 03 ) % and ( 20. 15 ±7. 91 ) % ,respectively. Following the increasing of rhEpoconcentration, there were more EpoR positivecells. The EpoR positive ratios of 3 group swere(8. 29 ±4. 21 ) % , ( 24. 74 ±8. 14 ) % and( 30. 78 ±10. 53 ) % , respectively. In thep retreated cells or the p retreated cells with hy2poxia, following the increasing concentration ofrhEpo, the exp ression of EpoR and its down2stream anti2apop totic p roteins p2Jak2, p2Stat5and H if21a was much more stronger than that ofrhEpo free cells. CO NCL US IO N　Treatmentwith rhEpo can induce up2regulation of theEpoR and down2stream anti2apop tosis gene ex2p ression in M SC.Key words: recep tor, erythropoietin; bonemarrow mesenchymal stem cells; p roteinexp ression; apop tosis　　　3 Corresponding author. (本文编辑 　乔 　虹 ) ·721·中国药理学与毒理学杂志 　　2009年 4月 ; 23 (2)