畜牧兽医学报 2008 ,39 (5) :6522657
A ct a V eteri nari a et Zootechnica S i nica
枸杞多糖对 DES 诱导的仓鼠睾丸
氧化损伤的保护作用
马爱团1 ,2 ,陈耀星1 3 ,王子旭1 ,董玉兰1
(1. 中国农业大学动物医学院 ,北京 100193 ; 2.河北农业大学中兽医学院 ,定州 073000)
摘 要 : 为研究枸杞多糖 (LBP)对己烯雌酚 (DES)诱导的仓鼠睾丸氧化损伤的保护作用 ,将 24 只成年雄性仓鼠随
机分为 4 组 ,即正常对照组、DES 组、DES + LBP 组、DES + VC + V E组。连续处理 7 d 后统计睾丸质量和相对质量 ,
观察睾丸组织结构的变化 ,检测睾丸组织和血浆中超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( GSH2Px) 、总抗
氧化能力 ( T2AOC)和丙二醛 (MDA) 的含量。结果 LBP 显著逆转了 DES 引起的生精损害 ,睾丸质量显著上升 ( P
< 0105) ,曲细精管排列有序 ,生精细胞轮廓清晰。同时 LBP 显著提高体内 SOD 和 T2AOC 含量 ( P < 0101) ,降低
MDA 水平 ( P < 0101) 。给予 LBP 后各项指标均接近对照组 ,与补充维生素组没有显著性差异。说明枸杞多糖可
有效对抗自由基 ,抑制脂质过氧化 ,减弱 DES 导致的生精损害 ,提示 LBP 是缓解环境雌激素生殖毒性的有效成分
之一。
关键词 : 枸杞多糖 ;己烯雌酚 ;生精损害 ;抗氧化
中图分类号 :S853174 文献标识码 : A 文章编号 :036626964 (2008) 0520652206
收稿日期 :2007206227
基金项目 :国家自然科学基金 (30471247 ; 30671514 ;30700575) ;国家重点基础研究发展
项目 (2007CB109105)
作者简介 :马爱团 (19682) ,女 ,河北安新人 ,副教授 ,博士生 ,主要从事中药药理学及生殖免疫学研究3 通讯作者 :陈耀星 ,教授 ,博士生导师 , Tel : 010262733778 ,E2mail : yxchen @cau. edu. cn
Protection of L ycium Ba rba rum Polysaccharides on Diethylstilbestrol
Induced Oxidative Damage in Testis of Hamster
MA Ai2t uan1 ,2 , CH EN Yao2xing1 3 , WAN G Zi2xu1 ,DON G Yu2lan1
(1 . Col lege of V eteri nary Medici ne , Chi na A g ricul t ural Uni versi t y ,
B ei j i ng 100193 , Chi na; 2 . Col lege of T radi t ional Chi nese V eteri nary
Medici ne , A g ricul t ural Uni versi t y of Hebei , Di ngz hou 073000 , Chi na)
Abstract : Protective effect s of L yci um B arbarum polysaccharides ( LBP) on diet hylstilbest rol
(DES) induced oxidative damage in hamster testis was studied in t his experiment . Adult ham2
sters ( Mesocricet us aurat us) were randomly divided into 4 group s : Cont rol group , DES group ,
DES + LBP group , DES + VC + V E group . Absolute and relative testicular weight were calculated ,
morp hological changes of testis were observed and the content s of SOD , GSH2Px , T2AOC , MDA
in testis tissue and plasma were detected af ter 7 successive days t reat ment . The result s showed
t hat LBP had an evident effect in reversing t he rep roductive damage induced by D ES. In D ES +
LBP group , the absolute and relative testicular weight were significantly upgraded ( P < 0. 05)
and t he seminiferous t ubules were lined up in order . Levels of SOD and T2AOC elevated marked2
ly in LBP group ( P < 0. 01) ,which was similar with cont rol , but MDA showed t he reverse tend2
ency. There was no significant difference between LBP and vitamin group . It is concluded t hat
LBP could efficiently rest rain the p roduction of reactive oxygen species , inhibit t he generation of
lipid peroxidation , accordingly at tenuate t he rep roductive toxicity of DES. These result s indicated
t hat LBP is one of t he active component s in at tenuating t he oxidative damage induced by environ2
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
5 期 马爱团等 :枸杞多糖对 DES 诱导的仓鼠睾丸氧化损伤的保护作用
mental est rogens.
Key words : LBP ; D ES ; rep roductive toxicity ; antioxidation
环境中具有类雌激素活性的内分泌干扰物能够
引起各种类型的雄性生殖障碍 ,如性腺发育不良、睾
丸萎缩、精子活力降低、睾丸肿瘤等[ 1 ] 。己烯雌酚
(Diethylstilbest rol , DES)是一种合成雌激素 ,为研
究环境激素效应的药物模型。研究表明 ,环境雌激
素引发的生精损害多与氧化应激有关[223 ] ,因此 ,寻
找高效低毒的抗氧化药物以缓解内分泌干扰物的危
害是非常重要的。中药在自然界分布广泛 ,由于其
天然、低毒受到人们的信赖 ,目前又因其抗氧化活性
而倍受关注。枸杞是我国传统的名贵中药材 ,枸杞
多糖 (L yci um B arbarum Polysaccharides , LBP) 是
其主要成分之一 ,具有多种药理作用和生物活性 ,尤
其在抗氧化和增强免疫力方面有很多报道[ 425 ] 。近
年发现 ,LBP 对动物生殖系统具有保护作用 ,能够
缓解氧化应激引起的生精损伤[627 ] 。仓鼠是研究环
境雌激素效应的良好动物[8 ] ,本试验通过 DES 诱导
仓鼠生精损害 ,研究枸杞多糖对生精损害的缓解作
用及其对抗氧化系统的影响 ,将枸杞传统的滋阴补
肾功能与现代药理学有机结合 ,为临床筛选抗氧化
药物提供依据 ,为人类及动物的生殖健康提供保障 ,
有助于中药产品的国际化。
1 材料与方法
111 动物处理
成年雄性仓鼠 ( Mesocricet us aurat us ) (购自北
京维通利华实验动物技术有限公司) ,平均体重约
125 g。仓鼠正常饲养 7 d 后 ,随机分为正常对照
组、D ES 组、D ES + LBP 组和 D ES + VC + VE组 (每
组 6 只) 。除正常对照组外 ,其余 3 组分别皮下注射
1 mg/ kg 体重 DES(Sigma 公司 ,橄榄油溶解) ,正常
对照组注射同等剂量橄榄油[ 9 ] ,连续用药 7 d。同时
DES + LBP 组仓鼠灌服 10 mg/ kg [6 ]的枸杞多糖
(曲阜天然绿色工程有限公司 ,纯度 7315 %) 。DES
+ VC + V E组通过灌服 VC和 VE ,与 LBP 的作用进
行比较 ,VC及 VE剂量分别为 100 mg/ kg[10 ] 和 200
IU/ kg [11 ] 。正常对照组和 DES 组灌服蒸馏水。仓
鼠每天称重 ,处理结束后称取睾丸质量 ,计算睾丸相
对质量 ,相对质量 = 睾丸质量 (g) / 体重 ( kg) 。心脏
采血 ,分离血浆 ,左侧睾丸制作组织匀浆 ,血浆及组
织匀浆用于检测抗氧化酶的活性 ;右侧睾丸用 4 %
多聚甲醛固定 ,用于形态学观察。
112 组织形态学观察
取固定好的睾丸制备 6μm 石蜡切片 , H E 染
色 ,光镜下观察睾丸组织结构。
113 氧化指标的检测
睾丸组织和血浆中超氧化物歧化酶 ( Superox2
ide dismutase , SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 ( Gluta2
t hione peroxidase , GSH2Px) 、总抗氧化能力 ( Total
antioxide capacity , T2AOC) 、丙二醛 (Malondialde2
hyde , MDA)的检测使用相应试剂盒 (购自南京建
成生物制品厂) 。相应方法 :黄嘌呤氧化酶法检测
SOD 含量 ,二硫代二硝基苯甲酸法检测 GSH2Px 含
量 ,化学比色法测定 T2AOC 活性 ,硫代巴比妥酸法
( TBARs) 检测 MDA 含量 ,考马斯亮蓝法检测蛋白
质含量 ,分光光度计 ( Helios Gamma 型 ,英国产) 测
量其 OD 值。方法及步骤严格按照试剂盒说明书进
行。
114 统计学处理
使用 SPSS12 软件包进行 One Way ANOVA
分析 ,数据以均值 ±
差 ( x ±s)表示 , P < 0101 为
差异极显著 , P < 0105 为差异显著。
2 结 果
211 LBP对仓鼠睾丸形态、质量的影响
药物处理后各组仓鼠的体重都有上升的趋势 ,
其中对照组上升最快 ,D ES 组最慢 ,但各组之间没
有显著性差异。睾丸形态和质量发生显著变化 ,
DES 处理组的仓鼠睾丸显著萎缩 ,体积变小 (见图
1) ,质量下降 ,睾丸相对质量降低 (见表 1) ,与对照
组比较差异极显著 ( P < 0101) 。加入 LBP 后 ,睾丸
质量及其相对质量显著回升 ,形态大小基本恢复至
对照组水平。VC及 VE处理组仓鼠的睾丸质量和相
对质量也显著增加 ,但与对照组差异显著 ( P <
0105) (见图 1 和表 1) 。
212 睾丸组织结构的变化
光学显微镜下 ,对照组的仓鼠睾丸结构完整 ,曲
细精管排列整齐 ,管壁中生精细胞轮廓清楚 ,管腔内
充满精子和长形精子细胞 (图 2A) 。1 mg/ kg D ES
356
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
畜 牧 兽 医 学 报 39 卷
图 1 对照组和不同处理组睾丸形态大小的比较
Fig11 Comparison of testicular shape and size of different
groups
处理后 ,曲细精管的管壁变薄 ,管壁中细胞排列紊
乱 ,细胞分层减少且不明显 ,细胞间出现较大的间
隙 ,管腔内有异常脱落的精母细胞和圆形精子细胞 ,
几乎所有管腔内均少见或未见有长形精子细胞 (图
2B) 。DES 处理的同时加入 LBP 或维生素后 ,显著
改善了睾丸的组织结构 ,曲细精管生精上皮基本完
整 ,各级生精细胞排列有序 ,管腔中有大量精子 ,与
对照组比较没有明显差别 (图 2C ,2D) 。
表 1 LBP对仓鼠体重及睾丸质量的影响
Table 1 Effects of LBP on body weight and testicular weight in hamster
组别
Group
初体重/ g
Initial BW
末体重/ g
Final BW
睾丸质量/ g
Testicular weight
睾丸相对质量/ (g/ kg)
Relative testicular weight
Control 132. 4 ±11. 7 140. 8 ±6. 1 3. 32 ±0. 21Aa 23. 65 ±2. 02Aa
DES 132. 6 ±6. 7 135. 0 ±5. 3 2. 23 ±0. 62Bc 16. 48 ±4. 16Bc
DES + LBP 131. 6 ±7. 8 136. 2 ±7. 2 2. 91 ±0. 20ab 21. 35 ±1. 26ab
DES + VC + V E 133. 8 ±3. 7 137. 6 ±3. 5 2. 78 ±0. 30b 20. 25 ±2. 48b
同一列数字不同大写上标字母表示差异极显著 ( P < 0. 01) ,不同小写上标字母表示差异显著 ( P < 0. 05)
The different lowercase and capital letters followed the data in the same column showed significantly difference at 0105 and 0101
level , respectively
A.对照组 ,睾丸生精细胞排列有序 ,轮廓清晰 ,管腔内充满大量精子 ;B. DES 组 ,睾丸生精细胞排列紊乱 ,管腔
内均少见或未见有精子 ; C. DES + LBP 组 ;D. DES + VC + V E组 ,C 和 D 生精上皮基本完整 ,各级生精细胞排列
有序 ,与 A 组接近
A. Control group , all spermatogenetic cells were line up in order and filled with mature sperms ;B. DES group ,
derangement of spermatogenetic cells and few mature sperms were observed in lumens ; C. DES + LBP group ,
D. DES + VC + V E group1 Spermatogenic cells were orderly arranged in integrated spermatogenic epithelium in
group C and D which was similar with group A
图 2 LBP对仓鼠睾丸曲细精管及生精细胞形态结构的影响 标尺示 100μm
Fig12 Effects of LBP on morphology of seminiferous tubules and spermatogenetic cells in hamster Bar = 100μm
456
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
5 期 马爱团等 :枸杞多糖对 DES 诱导的仓鼠睾丸氧化损伤的保护作用
213 相关氧化指标的检测
21311 SOD 的检测结果 连续应用 7 d DES ,导致
仓鼠睾丸组织和血浆中 SOD 含量显著降低 ,而
LBP 和维生素组均逆转了 SOD 的下降 ,使体内
SOD 含量显著回升 ,均恢复至对照组水平 ,与 DES
组比较差异极显著 ( P < 0101) ,见图 3。
不同大写字母表示差异极显著 ( P < 0101) ,不同小写字母表示差异显著 ( P < 0105) 。下同
The different lowercase and capital letters above the column showed significantly difference at 0105 and
0101 level , respectively1 The same as below
图 3 LBP对仓鼠睾丸组织和血浆中 SOD 含量的影响
Fig13 Effects of LBP on SOD contents in testicular tissue and plasma in hamster
21312 GSH2Px 的检测结果 经检测 ,连续 7 d 注
射 DES ,使睾丸组织中 GSH2Px 显著下降 ,与对照
组比较差异极显著 ( P < 0101) 。LBP 的加入对睾丸
组织中 GSH2Px 含量没有明显改变 ,但显著提高了 血浆中 GSH2Px 水平 ( P < 0105) ,维生素组睾丸和血浆中 GSH2Px 含量均比 DES 组显著升高 ( P <0105) ,见图 4。
图 4 LBP对仓鼠睾丸组织和血浆中 GSH2Px 含量的影响
Fig14 Effects of LBP on GSH2Px contents in testicular tissue and plasma in hamster
21313 T2AOC 的检测结果 T2AOC 的变化趋势
与 SOD 相似 ,应用 DES 后 ,睾丸组织和血浆中 T2
AOC 显著下降 ,与对照组比较差异极显著 ( P <
0101) 。LBP 和维生素的使用均显著提高了体内 T2
AOC 含量 ,达到对照组水平 ,与 DES 组比较差异极
显著 ( P < 0101) ,见图 5。
21314 MDA 的检测结果 DES 处理后 ,仓鼠睾丸
组织和血浆中 MDA 含量显著上升 ,其变化趋势与
SOD、GSH2Px 和 T2AOC 相反 ,D ES 组与对照组比 较差异极显著 ( P < 0101) 。LBP 和维生素均显著降低睾丸组织中 MDA 含量 ,达到极显著水平 ( P <0101) 。同时 LBP 和维生素显著降低血浆中 MDA含量 ( P < 0105) ,见图 6。3 讨 论 很多雄性生殖系统疾病与接触环境雌激素有关 ,试验证实 ,胚胎期、出生前后或成年动物接触DES 均可导致雄性生殖损害[1 ,9 ] 。枸杞是我国传统
556
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
畜 牧 兽 医 学 报 39 卷
的中药材 ,枸杞多糖 (LBP) 为其主要成分。研究证
实 LBP 能够减轻高温引起的小鼠睾丸损伤 ,增加附
睾质量[6 ] 。摘除小鼠半侧睾丸后 ,LBP 可以提高性
激素水平 ,增加副性腺质量 ,提高精子活力[7 ] 。
本试验表明 ,连续应用 7 d D ES ,导致睾丸萎
缩 ,绝对和相对质量均显著降低 ,而加入 LBP 后 ,明
显缓解了 D ES 的生殖毒性 ,睾丸质量上升至对照组
水平 (图 1、表 1) 。同时睾丸组织结构有明显的改
善 ,LBP 组仓鼠曲细精管排列整齐 ,管壁中生精细
胞轮廓清楚 ,层次分明 ;管腔内有大量精子 (图 2) ,
其结果与对照组接近。维生素 C 和 E 是外源性抗
氧化剂 ,对 ROS 具有很好的清除效果[10211 ] 。VC 和
VE的联合使用 ,也显著改善了 DES 引起的生精损
害 ,使睾丸质量及相对质量显著回升 ,但与对照组存
在显著差异 (图 1 ,表 1) ,因此从睾丸形态及质量来
看 ,LBP 对 D ES 损害的缓解作用优于维生素组 ,提
示枸杞多糖对生殖细胞具有很好的保护作用 ,这与
祖国医学关于枸杞补肾壮阳 ,滋阴生精的理论是一
致的。
目前 ,环境雌激素引起的雄性生殖损伤已经得
到公认 ,但其作用机理不明。据报道 ,雄性生精损害
与活性氧 ( ROS) 密切相关[3 ] ,精子对 ROS 很敏感 ,
少量的 ROS 就能够干扰生精细胞的功能 ,使 DNA
断裂[2 ] 。生精细胞比体细胞更易受到 ROS 损害的
原因 ,一是生精细胞膜含有丰富的多不饱和脂肪酸 ,
容易被氧化 ;另外生精细胞镶嵌在支持细胞膜上 ,支
持细胞产生的 ROS 可直接损伤生精细胞[12 ] 。本试
验中 ,DES 处理组仓鼠睾丸和血浆中 SOD、GSH2Px
和 T2AOC 含量均显著下降 ,而 MDA 上升 ,与对照
组比较有极显著差异 (图 3~6) ,说明 DES 降低抗
氧化酶水平 ,导致生精细胞脂质过氧化 ,干扰细胞正
常功能 ,引起生精损伤。加入 LBP 后睾丸和血浆中
抗氧化酶水平显著上升 ,其中 SOD、T2AOC 含量均
与 DES 组有极显著差异 ( P < 0101) ,达到对照组水
平。血浆中 GSH2Px 也显著上升 , 而睾丸组织
GSH2Px 与 DES 组比较没有显著变化。说明 LBP
通过增加仓鼠体内 SOD 水平 ,提高清除超氧阴离子
自由基的能力 ,使 DES 诱导的氧自由基含量下降。
虽然组织中 GSH2Px 变化不明显 ,但 LBP 组总抗氧
化能力显著提高 ,推测 LBP 通过影响其他抗氧化酶
含量 ,使机体总的清除 ROS 能力上升 ,减轻 ROS 对
生精细胞的损害。
656
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
5 期 马爱团等 :枸杞多糖对 DES 诱导的仓鼠睾丸氧化损伤的保护作用
研究证实 ,LBP 对机体抗氧化酶活性有显著影
响 ,它能够提高老年小鼠的 SOD、GSH2Px、T2AOC
含量 ,使之恢复至青年鼠水平[13 ] 。另外 LBP 能够
减轻高温引起的小鼠睾丸损伤 ,增加 SOD 含量[6 ] ,
还可以减轻 H2 O2引起的生精细胞 DNA 损伤[ 7 ] ,本
试验结果与上述研究类似。
维生素 C 和 E 是外源抗氧化剂 ,能够提高机体
抗氧化酶水平 ,增强对 ROS 的清除作用 ,缓解氧化
损伤[ 10211 ] 。本试验证实 ,VC及 VE通过增加体内抗
氧化能力 ,降低脂质过氧化物的含量 ,逆转 DES 引
起的睾丸生殖损伤。维生素组与 LBP 组的各检测
指标均无显著性差异 ,说明枸杞多糖能有效对抗自
由基 ,抑制脂质过氧化 ,从而减弱 D ES 引起的生精
细胞损伤。结果提示 LBP 是缓解环境雌激素生殖
毒性的有效中药成分之一。
参考文献 :
[ 1 ] PFL IEGER2BRUSS S , SCHU PPE H C , SCHILL W
B. The male reproductive system and it s susceptibili2
ty to endocrine disrupting chemicals[J ] . Andrologia ,
2004 ,36 :3372345.
[ 2 ] A IT KEN R J , BA KER M A. Reactive oxygen spe2
cies generation by human spermatozoa : A continuing
enigma[J ] . Int J Androl , 2002 ,25 :1912194.
[ 3 ] MISHRA D P , SHA HA C. Est rogen2induced sper2
matogenic cell apoptosis occurs via the mitochondrial
pathway : Role of superoxide and nit ric oxide [J ] . J
Biol Chem , 2005 ,280 (7) :6 18126 196.
[ 4 ] L I X M. Protective effect of Lycium barbarum poly2
saccharides on st reptozotocin2induced oxidative st ress
in rat s[J ] . Int J Biol Macromol , 2007 ,40 :4612465.
[ 5 ] GON G H Y , SH EN P , J IN L , et al . Therapeutic
effect s of L yci um barbarum polysaccharide (LBP) on
mitomycin C (MMC) 2induced myelosuppressive mice
[J ] . J Exp Therap Oncol , 2004 ,4 :1812187.
[ 6 ] L UO Q , L I Z , HUAN G X L , et al. L yci um barba2
rum polysaccharides : Protective effect s against heat2
induced damage of rat testes and H2 O22induced DNA
damage in mouse testicular cells and beneficial effect
on sexual behavior and reproductive function of hemi2
cast rated rat s[J ] . Life Sci , 2006 ,79 :6132621.
[ 7 ] WAN G Y R , ZHAO H , SH EN G X S ,et al. Protec2
tive effect of Fructus L ycii polysaccharides against
time and hyperthermia2induced damage in cultured
seminiferous epithelium [ J ] . J Ethnopharmacol ,
2002 ,82 :1692175.
[ 8 ] H ENDR Y W J , SH EEHAN D M , KHAN S A , et
al. Developing a laboratory animal model for perinatal
endocrine disruption : The hamster chronicles [ J ] .
Exp Biol Med , 2002 ,227 :7092723.
[ 9 ] 杨筱珍 ,陈耀星 ,王子旭. 己烯雌酚对成年仓鼠睾丸生
精的影响 [ J ] . 中国农业科学 , 2005 , 38 (11) : 2 3392
2 343.
[ 10 ] KUMAR J S , BANUDEV I S , SHARMILA M , et
al. Effect s of vitamin C and E on PCB ( Aroclor
1245) induced oxidative st ress , androgen binding
protein and lactate in rat sertoli cells [ J ] . Reprod
Toxicol , 2004 ,19 :2012208.
[11 ] CAM K , SIMSEK F , YU KSEL M , et al. The role
of reactive oxygen species and apoptosis in the patho2
genesis of varicocele in a rat model and efficiency of
vitamin E treatment [J ] . Int J Androl , 2004 ,27 :2282
233.
[12 ] HIPL ER U C , GORN IG M , HIPL ER B ,et al. Stim2
ulation and scavest rogen2induced inhibition of reactive
oxygenspecies generated by rat sertoli cells[J ] . Arch
Androl , 2000 ,44 :1472154.
[ 13 ] L I X M , L I X L , ZHOU A G. Evaluation of antioxi2
dant activity of the polysaccharides extracted f rom
L yci um barbarum f ruit s i n vi t ro [ J ] . Eur Polym J ,
2007 ,43 :4882497.
756
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net