应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌链霉素耐药性的研究

1046 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 Chinese Journal of Zoonoses 2O09， 25 (11) 文章编号 ：1002—2694(2009)11—1046—03 应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌 链霉素耐药性的研究* 张俊仙 ，吴雪琼 ，邢婉 丽 ，梁 艳 ，阳幼荣 摘 要：目的 研制一种新型 DNA芯片，用于快速检测结核分枝杆菌耐链霉素 rpsl和rrs基因突变。方法 根据结核 分枝杆菌 rpsl和r 基因序列探针并制作 DNA芯片，用 TAMRA(四甲基罗丹明)标记的引物扩增结核分枝杆菌 rpsl和 rrs基因突变热点的片段，与 DNA芯片杂交，同时以聚合酶链反应 单链构象多态性(polymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism，PCR—SSCP)和 DNA测序法为对照。结果 144株结核分枝杆菌临床分离株中，42株链霉素敏感 株的PCR—SSCP和 DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同；102株链霉素耐药株中有 79株检测到 rpsl基因突 变77．5 (79／102)，其中74株为43位密码子AAG--~AGG突变，5株为 88位密码子 AAG-+AGG突变；rrs基因突变5 (5／ 102)，4株 为 513位 密码子 A—c突变，1株 为 516位密码子 c—T突变 ，均 与 PCR—SSCP和 DNA 芯片杂交结果 一致 ，余 l8株 未检测到突变。结论 用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐链霉素分离株 的rpsl和 rrs基因突变，可 用于临床耐药性 的检测 ，指 导临床用 药。 关键词 ：结核分枝杆菌 ；链 霉素；rpsl；rrs；药物耐受性 ；DNA芯片 中图分类号 ：1：1379 9 文献标识码 ：A Rapid detection of rpsl and rrs mutations in M ycobacterium tuberculosis by DNA chip ZHANG Jun—xian，W U Xue—qiong，XING W an—li，LIANG Yan，YANG You—rong (TuberculosisResearch Laboratory，The 309th hospital，ChinesePeople’SLiberation Army，Beijing 100091，China) ABSTRACT：To develop a new method，DNA chip，which can be used for rapid detection of rpsl and rrs mutations in My— cobacterium tuberculosis． Aaceording to the rpsl and rrs gene sequence of Mycobacterium tuberculosis．The oligonucleotide probes were designed and synthesized，and DNA chips were prepared．The DNA fragment containing the hot mutation sites of rpsl and rrs genes were amplified with TAMRA—labeled primers by PCR，and then it was hybridized with gene chip．PCR—SS— CP technique and DNA sequencing were used as the contro1．Of 144 M_tuberculosis clinical isolates。the results of DNA chips showed that the rpsl and rrs genes from 42 of Streptomycin—sensitive strains were all wild types，similar to that of PCR—SSCP． Of 102 M ．tuberculosis Streptomycin—resistant isolates，79 strains had rpsl gene mutations，74 strains were AAG—}AGG at CO— don 43；5 strains were AAG— AGG at codon 88．the other 18 isolates had no mutations in DNA chip．It is evident that DNA chip might be a rapid and specific method for the detection of rpsl and rrs gene mutation in the majority of Streptomycin——resist—- ant M ycobacterium tuberculosis． It could be used for clinical detection of Streptomycin resistant isolates． KEY WORDS：Mycobacterium tuberculosis；Streptomycin；rpsl；rrs；Drug resistance；DNA chip 据世界卫生组织(wHO)统计 ，近 10年来结核 病疫情有所回升。全世界已有 1／s(约 2O亿人)感 染结核杆菌，结核病人达 2 000万，每年新发病人约 900万 ，平均每一秒就会新增一名肺结核病人 ，每天 约 5 000人死于结核病 ，而且几乎全部在发展 中国 家和地区，已成为传染病的头号杀手。 耐药结核分枝杆菌给结核病 的治疗带来 了困 扰。链霉素是一种从灰链霉菌的培养液 中提取的抗 菌素，属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体 核糖核酸蛋白体蛋 白质结合 ，起到 了干扰结核杆菌 蛋白质合成的作用 ，从而杀灭或者抑制结核杆菌生 *“十五”国家重大科技专项“功能基因组和生物芯片”科研基金和 军 队医学杰出中青年人才科研基金项 目(OlJO2O) 通讯作者：吴雪琼 ，Email：wu—xueqion@263．net 作者单位：1．中国人民解放军第309医院结研室，北京 100091； 2．生物芯片北京国家工程研究中心 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 chinese Journal of Zoonoses 1047 长的作用。数十年来它仍是主要 的一线抗结核 药物 。 我国第四次结核病流行病学抽样调查表明：链 霉素耐药率为 17．3 。由于耐药性结果可以为临 床 医生提供治疗依据 ，因此快速 、准确 的耐药性测 定对结核病的治疗具有重要的意义。 本文利 用 DNA 芯 片技术 对部 分 临床分 离株 rpsl和 rrs基 因进行检测 ，以建立一种新 的快速、简 单、有效的分子药敏试验方法，指导临床医生对结核 病进行合理化疗 。 1 材料和方法 1．1 材料 结核分枝 杆菌标 准株来 自中国生物制 品检定所 ，144株分枝杆菌临床分离株 白中 国人 民 解放军第 309医院结核病研究所。 1．2 方法 1．2．1 SM 传统药物敏感性试验口 按“结核病诊 断细菌学检验规程”对结核分枝杆菌临床分离株进 行传统 的分枝 杆 菌培养 及 链 霉素 (Streptomycin， SM)药 敏试 验 ，耐 SM 标 准：10／,g／mL、100／,g／mL 分别为低度 、高度耐药。 1．2．2 分枝杆菌 DNA 的提取 采用本室 自制的 标本前处理试剂盒取 DNA，置一20 C保存备用 。 1．2．3 PCR—SSCP分枝杆菌菌种初步鉴定∞ 根 据分枝杆菌 16S rRNA基因序列设计 、合成一对共 同的引物 1、2，可扩 增不 同分枝 杆 菌该 基 因产 生 268-282bp片段。 1．2．4 PCR—SSCP结 核分枝杆 菌 rpsl和 rrs基因 突变的初步鉴定 根据结核分枝杆菌 rpsl和rrs 基因序列设计合成引物 rpsl1和 rpsl2可扩增结核 分枝杆菌 rpsl基因，产生 267bp片段；合成引物 rrsl和 rrs2可扩增 结核 分枝 杆 菌 rrs基 因，产 生 200bp片段 。 1．2．5 基因芯片的制备 设计的寡核苷酸探针(见 表 1)由上海 生工生物 工程公 司合 成，以二 甲亚 砜 (DMSO)作为点样液 ，采用微量点样技术通 过 自动 点样仪将事先合成好 的寡核苷酸探针直接点制于醛 基修饰的玻片上，制备基因芯片点阵(见表 2)。对 寡核苷酸探针进行 固定。HEX为芯片表面化学质 控探针 ；DMSO为空白对照。 1．2．6 PCR一基因芯片检测 1．2．6．1 荧光 标记 反应 在 25FL反应 体系 中， 4XdNTP混合物的终浓度为 0．2 mmol／L，TAMRA 标记的分枝杆菌 rpsl和YrS引物 1、2的终浓度分别 为 0．5和 0．1Fmol／L，纯化的 DNA模板 10～100ng， Taq DNA聚合酶 1U。置 DNA热循环仪扩增后， 在 2 琼脂糖凝胶 中电泳检测扩增产物 。 1．2．6．2 杂交 对样 品进行 变性处理时，将 9 L 杂交液和 6 L杂交样品混合、离心 ，然后在 PCR扩 增仪上 95℃变性 3 min，取出并立即冰浴。进行杂 交反应时，用微量移液器取变性处理好的所有样品， 通过盖玻片上的小孔点滴在 芯片上点 阵所 在 区域 上。将芯片放在杂交盒中并在杂交盒中加入适量的 双蒸水以防止芯片上的样品挥发。将盖好的杂交盒 放人 42℃水浴锅中2h。杂交结束后进行洗涤时，将 芯片取出，放入室温的洗涤液 工[2×SSC(常用缓冲 液)，0．2 十二烷基硫酸钠(SDS)]中，在摇床上振 荡洗涤 3 rain，再在洗涤液 1I(0．2×SSC)中洗涤 3 min。然后将芯片放入离心管 中，平衡后 1 000 r／ min离心 5rain。 1．2．6．3 荧光扫描和结果分析 用 GenePix基 因 芯片 扫描仪 扫描芯 片 ，通过 GenePix Pro 4．0软件 分析荧光信号的强度。 1．2．6．4 PCR一直接测序 经 PCR—SSCP分析和芯 片鉴定的临床分离株进一步送上海生工生物工程公 司进行 DNA测序证实。 表 1 各探针 所检测的突变类型 Table 1 The type of mutations checked by probes 2 结 果 2．1 菌种鉴定 应用分枝杆菌 16S rRNA 引物 1、 2 PCR扩增 1株结核分枝杆菌标准株和 144株结核 分枝杆菌临床分离株后均产生一条 DNA片段；扩 增产物经 SSCP分析鉴定，144株 SSCP图谱与结核 分枝杆菌标准株 SSCP图谱相同，判定为结核分枝 104 8 中 国 人 兽 共 患 病 学 报C hin e s e J O U rn a lo f Z o o n o s e s 表 2 T able 2 点 制 于 醛 基 修 饰 的玻 片 上 ， 制 备 的 基 因 芯 片 点 阵 T he genechip lattics droped on glasses m odificatory by aldehyde 杆 菌 复合群 。 2． 2 P C R 扩 增 以 rpsll 和 rpsl2 引 物 分 别 扩 增 1 4 4 株 结 核 分 枝 杆 菌 临 床 分 离 株 ， 均 产 生 清 晰 的 267bp D N A 片段 ；以 rrsl和 rrs2 引 物分 别扩 增 1 4 4 株 结 核 分 枝 杆 菌 临 床 分 离 株 ， 均 产 生 清 晰 的 200bp D N A 片段 。 2． 3 结 核 分 枝 杆 菌 rpsl和 r r s 基 因 P C R — S S C P 分 析 以结 核 分枝 杆 菌标 准 株 H 3 7R v 为 对 照 ， 对 1 4 4 株结 核 分 枝 杆 菌 临 床 分 离 株 rpsl基 因 273 bp 片 段 进 行 P C R — S S C P 分 析 ， 4 2 株 链 霉 素 敏 感 株 的 P C R — S S C P 图谱 与 结 核 分 枝 杆 菌 标 准 株 完 全 相 同 。 1 02 株 耐 S M 菌株 中 ， 23 株 rpsI 基 因 与结 核 分 枝 杆 菌 标 准 株 H 3 7R v rpsl基 因 P C R — S S C P 图 谱 相 同 ， 说 明 无 rpsl基 因突 变 ；79 株 rpsl基 因 S S C P 图谱 与结 核 分 枝 杆 菌 标 准 株 H 3 7R v rpsl 基 因 有 明 显 差 异 ， 说 明存 在 rpsl基 因 突 变 ；97 株 rrs 基 因 与 结 核 分 枝 杆 菌标 准株 H 3 7R v rrs 基 因 P C R — S S C P 图 谱 相 同 ， 说 明 无 rrs 基 因 突 变 ；5 株 T E S 基 因 S S C P 图 谱 与 结 核 分枝 杆 菌标 准 株 H 37R v rY s 基 因 有 明 显 差 异 ， 说 明 存 在 K F S 基 因 突 变 。 2． 4 应 用 D N A 芯 片检 测 结 核分 枝 杆 菌 rpsl和 rrs 基 因 突 变结 果 以 结 核 分 枝 杆 菌 标 准 株 H 3 7R v 为 对 照 ， 14 4 株结核 分 枝杆 菌 临床分 离株 中 ， 4 2 株链 霉 素敏感株 的 D N A 芯 片杂 交 结 果 与 结 核 分 枝 杆 菌 标 准 株 完全 相 同 ；102 株链 霉 素 耐 药 株 中有 79 株 检 测 到 rpsl基 因 突变 77 ． 5 ％ (79／1 02)， 其 中 74 株 为 4 3 位 密码 子 A A G — A G G 突 变 ， 5 株 为 88 位 密 码 子 A A G - + A G G 突 变 ；102 株 链 霉 素耐 药 株 中有 5 株 检 测 到 Ⅳ s 基 因突变 5 ％ (5／102)， 4 株 为 5 1 3 位 密 码 子 A — C 突 变 ， 1 株 为 5 1 6 位 密 码 子 C — T 突 变 ， 均 与 P C R S S C P 结 果 一 致 ；余 18 株 未 检 测 到 突 变 。 部分结 果 见 图 1 。 2 图 1 部 分 菌株 T A M R A — rpsl、 rrs 杂 交 图 1 ． 结 核 分 枝 杆 菌 标 准 株 (阳 性 对 照 )；2． 结 核 分 枝 杆 菌 阴性 对 照 ； 3 ． S M 突 变 株 (rpsllb)； 4 ． S M 突 变 株 (rpsl2b)；5 ． S M 突 变 株 (” s2a ) F ig． 1 T he result S of som e T A M R A — rpsl， rrs hybridjzation s in M ycoba cterium tuberculosis 1 ． T he stan da rd strain ofM ∥ oba cteriu m tubercu losis (po sitiv e co n tr0 1 ) ； 2． N egativ e co n trol；3 ． S trepto — m ycin resistan t strain s(rpsllb)； 4 ． S trepto m ycin — re— sistan t strain s ( rpsl2b)； 5 ． S trepto m ycin resistan t strain s(rrs2a )． 2． 5 结 核 分枝 杆 菌 rpsl和 rrs 基 因 的 P C R 一 直 接测 序 分 析 根 据 D N A 芯 片 的 杂 交 结 果 ， 选 择 5 株 S M 敏 感 株 和 20 株 不 同位点 耐 S M 菌株进 行 P C R 直接 测 序 分 析 ， 发 现 5 株 敏 感 株 D N A 序 列 与 结 核 分 枝 杆 菌标 准株完 全 相 同 ；20 株 耐 S M 菌 株 序 列 均 存 在 与对 应 位 点 的 突 变 ， 其 结 果 与 D N A 芯 片 的 杂 交 结 果 完 全 一 致 。 3 讨 论 自从 链 霉素 (S M )1 9 4 6 年在 抗 生 素 中首 次应 用 于 治疗 结 核 病 以 来 ， 它 一 直 是 抗 结 核 联 合 用 药 化 疗 方 案 中 的关 键 药 物 之 一 ， 是 多 种 药 物 联 合 化 疗 治 疗 结 核病 最 基 本 的组 成 部 分 。 目前 研 究认 为结 核 菌 S M 耐 药 性 的产 生 主 要 来 自两 个 基 因 区 域 的 变异 。。“ 。 一 是 编码 核 糖 体 S 1 2 蛋 白的 rpsL 基 因 发 生 突 变 ， 突 变 位 点 主 要 集 中在 第 4 3 位 和 第 88 位 氨 基 酸 ， 即 由 赖 氨 酸 (I。 ys) 密 码 子 (A A G ) 突 变 为 精 氨 酸 (A rg) 密 码 子 (A G G ) 。 第 二 类 突 变 发 生 在 编 码 16rR N A 的 t' fS 基 因上 ， 主 要 集 中在 5 30 环 区 和 904 位 碱基 。 由于 上 述 基 因 位点 发 生 突 变 ， 影 响 了 S M 结 合 到 核 糖 体 上 的 能 力 及 其 药 理 功 能 ， 因而 造 成耐 药性 产生 。 从 分 子 水平 阐 明结核分枝 杆 菌耐药性 变 异 的机 (下 转 第 1 05 3 页 ) 2009， 25 (11) 中 国 人 兽 共 患 病 学 报 Chinese Journal of Zoonoses 1O53 参考文献 ： [11 Parsons I M ，Salfinger M ．Phenotypic and Molecular Character— ization of Mycobacterium tuberculosis Isolates Resistant to both Isoniazid and Ethambutol[J]．Antimicrobia1 Agents and Cherno— therapy，2005，49：2218 2225． [2]Sreevatsan S，Stockbauer KE，Pan X，et a1．Ethambutol resist ance in Mycobacterium tuberculosis：critical role of embB muta— tions