人成骨样细胞机械牵拉力敏感基因cDNA扣除文库的构建

本课题为国家自然科学基金资助,编号: 30270373, 30370374 作者单位:西安第四军医大学口腔医学院 710032(冯雪 李永明 丁 寅 段银钟 林珠) 第四军医大学免疫学教研室(欧阳为 民) 第四军医大学生物化学教研室( 蒲勤) 通讯作者:冯雪 029- 83376137 人成骨样细胞机械牵拉力敏感基因 cDNA扣除文库的构建 冯雪 李永明 欧阳为民 蒲勤 丁寅 段银钟 林珠 =摘要> 目的: 构建人成骨样细胞机械牵拉力敏感基因 cDNA扣除文库。:对培养的人成骨样细胞 Saos- 2 进行二维方向上的加载,细胞平均变形幅度为 12% ,牵拉频率为 12 次/ min, 加载 12 h 后提取应 力作用后细胞及正常对照组细胞的 mRNA , 制备各自的 cDNA, 用基于 PCR 的消减杂交技术构建人成 骨样细胞机械牵拉力作用下差异达基因文库,即机械牵拉力敏感基因 cDNA 扣除文库, 并进行初步的 序列测定。结果: 成功地构建出人成骨样细胞机械牵拉力敏感基因 cDNA 文库, 库容量约为 200;初步 的测序结果表明文库内的基因多与应力作用下细胞发生的生物学变化有关, 并成功地得到一个新的基 因片段。结论:用基于 PCR 的消减杂交技术可以有效构建人成骨细胞样机械牵拉力敏感基因 cDNA 扣 除文库。 =关键词> 消减杂交;聚合酶链反应;基因文库;成骨细胞;机械牵拉 Subst ract ive cDNA library const ruction of genes sensitive to mechanical str etch in human osteoblast like cel ls Feng Xue, Li Yongming , Ouyang Weiming , et al . Depar tment of Or thodont ics, College of Stomatology , The Fourth Mili tary Medical Universi ty, Xi. an 710032, China =Abstract> Objective: To reconstruct a substractive complementary deoxyribornucleic acid ( cDNA) libr ary of genes sensitive to mechanical stretch in human osteoblast like cells. Methods: Mechanical str etch at 12 cycles per minute was applied to human osteoblast like cells Saos- 2 and t he deformation of t he str etched cells was 12% . Twelve hours after loading, mRNAs were isolated from both str etched and unstretched cells. Substrac2 tive cDNA libr ary of the genes sensitive to str etch was constructed wit h the technique based on polymerase chain r eaction ( PCR) and substract ive hybr idizat ion. Pr imary sequencing of clones in t he library was car ried out. Results: A substract ive cDNA library of genes sensitive to stretch was constructed with a capacity of about 200 clones. According to the r esults of sequencing, most genes in the library were related to the mechanical stimulation. One novel gene fragment was obtained. Conclusion: The met hod used in the exper iment is effec2 tive in cloning genes sensitive to mechanical stretch. =Key words> Subst ract ive hybridiza tion; Polymer ase chain r eaction; Gene libr ary; Os2 teoblast ; Mechanical stretch 中图分类号: R783. 5 文献标识码: A 文章编号: 100123733( 2004)20320270203 细胞所表达的功能基因, 虽然占的比例很小, 但与 细胞的特定功能密切相关,也正是这部分基因,决定了 细胞间的差异。机体中的细胞在受到应力刺激后, 也 会启动不同基因的表达, 产生不同的蛋白质, 来完成其 相应的生理功能。Karjalainen 等[ 1]的实验表明, 软骨 样细胞受到频率为 30次/ min、幅度为 8%的牵拉力 6 h后,细胞周期相关基因、基质金属蛋白酶- 3、整合素 A6、血小板衍生生长因子 - 3 等基因的表达上调; Gretz等[2]对肾脏足细胞施加 3 d的脉动牵拉力,用基 因芯片检测基因在加载前后差异表达情况,发现 16个 基因的表达发生了改变, 其中骨桥蛋白的表达上调了 3倍。骨是一种对应力敏感的组织, 但应力信号究竟 是通过何种机制转导至成骨细胞核内的、是否还有其 它途径或未知的基因参与这一过程等, 均是未知的问 题,而且目前对于成骨应力相关基因进行克隆的 研究也较少。本研究拟通过基于 PCR的改良消减杂 #270# 实用口腔医学杂志( J Pract Stomatol) 2004 May, 20(3) 交的消减杂交技术, 构建人成骨样细胞机械牵拉力作 用下差异表达文库, 为对深入研究成骨细胞机械牵拉 力敏感基因打下基础。 1 材料和方法 1. 1 材料 细胞牵拉加载装置为自行研制, 6 孔弹力膜细胞 培养板 ( Flexercell ) , 人骨肉 瘤细胞系 Saos - 2 (ATCC) , DMEM 培养液( Gibco) , 胎牛血清(Gibco) , 细胞培养瓶 ( Nunk) , mRNA 分离试剂盒 ( Promega, PolyA T tract o R system 1000) , Superscript II 反转录酶 (Gibco) , SMART TM PCR cDNA Synthesis kit ( Clon2 tech) , 胶回收纯化试剂盒 (Clontech) , Biot in- 21- dUTP (Clontech) ,磁珠( St reptavidin Magne sphereoR Paramagnet ic Part icles, Promega ) , Klen Taq 聚合酶 (Clontech)。 引物:由中科院上海生物工程中心合成 pending 引物序列为: 5. ACGGCTGCGAGAAGAC- GACAGAAGGG 3. ; PCR 引物序列为: 5. TACGGCTGCGAGAA2 GACGA CAGAA 3. ; 3. 锚定引物序列为: 5. TACGGCTGCGAGAA2 GACG ACAGAAT 30MN 3. 反转录引物为: oligo dT18 1. 2 方法 1. 2. 1 细胞加载 将 Saos- 2细胞接种于 6孔弹力 膜细胞培养板上,待细胞进入对数生长期之后,进行二 维方向上的牵拉加载, 细胞受牵拉后的平均变形幅度 为约为 12%, 牵拉频率为 12 次/ min。倒置显微镜下 进行观察。 1. 2. 2 mRNA的提取 用 mRNA 分离试剂盒提取 机械牵拉力作用 12 h后细胞 mRNA,及同样接种于弹 力膜细胞培养板上未加载细胞的 mRNA( driver)。重 复 3次,共提取 3个 6孔板的加载细胞 mRNA 作为实 验组, 3个同样 6孔板的未加载细胞 mRNA 作为对照 组,将 mRNA 在- 70 e 保存备用。 1. 2. 3 cDNA的制备 将实验组用 SMARTTM PCR cDNA Synthesis kit 进行反转录,以 3. 锚定引物代替 试剂盒中的 3. 引物, 采用 Superscript II 反转录酶。 实验组用 Riboclone cDNA 合成系统常规反转录。 1. 2. 4 扣除探针的制备 PCR 条件为: 20 Lmol/ L biot in- 21- dUTP ( Clontech) , 200Lmol/ L dNTPs, 1 Lg oligo- dT18和 10 bp 随机引物, 1 Ll 反转录, 50 Ll反应体积。PCR 参数为: 95 e , 20 s; 40 e , 5 min; 72 e , 3 min; 40 循环。 1. 2. 5 杂交 将 5 Ll目的 cDNA 加到 100 Ll扣除探 针 PCR 产物中, 在 6 @ SSC及 U= 0. 5% SDS 的条件 下 65 e 杂交 18 h。 1. 2. 6 除盐及小片段 将 40 Ll 杂交液加到 Sephacryl S- 400 柱, 离心, 收集液体。 1. 2. 7 除去杂交体及扣除探针 将上述液体约 40 Ll加到 0. 1 ml磁珠中,室温结合 2 min, 65 e 温育 5 min减少非特异性杂交, 在磁场作用下分离出上清作 为 PCR模板。 1. 2. 8 目的 cDNA的特异扩增 PCR条件为: 400 nmol/ L 引 物 ( TACGGCTGCGAGAA2 GACGACAGAA) ; 200 Lmol/ L dNTPs, 40 Ll 杂交分离 后的上清; Klen T aq LA 聚合酶 1 U, 反应体积 50 Ll, PCR参数为: 95 e , 15 s; 68 e , 5 min; 4个循环。 1. 2. 9 PCR 产物的回收与纯化 采用 Clontech 公 司的胶回收试剂盒回收 PCR产物。 1. 2. 10 PCR 产物的克隆 参照分子克隆方法进 行。 1. 2. 11 文库的酶切鉴定 从转化的 LB平板上挑 取白色克隆, 在含氨苄青霉素的 LB培养基中进行扩 增,双酶切, 酶切产物在琼脂糖胶上电泳, 提取插段并 作定量。 1. 2. 12 克隆测序 2 结 果 2. 1 人成骨样细胞的加载 细胞加载装置每 5 s对细胞牵拉 1 次, 肉眼可见 较明显的膜变形。加载结束后,倒置显微镜下观察,细 胞为多角形,贴壁和伸展良好。 2. 2 消减杂交前后 PCR产物的电泳分析 本实验中, 我们分别对实验组和对照组的 cDNA 模板进行了不同循环数的扩增,对杂交后的 cDNA 进 行了低循环数的扩增,并区域性地回收了 500~ 2000 bp的扩增产物。结果表明,实验组和对照组的 cDNA 均表现为涂膜( smear)样。 2. 3 含差异 cDNA插段克隆的酶切鉴定 杂交产物克隆入载体, 加入 IPTG 和 X- gal转化 新鲜制备的 TOP10感受态细胞,构建差异表达基因的 扣除文库,长出白色克隆约 200个,兰色克隆近 60个。 随机挑取白色克隆 50个, 经双酶切鉴定有插段的 38 个,占 76%。其中大小在 500 bp以上的克隆 26个。 2. 4 序列测定 对文库内克隆进行初步序列测定, 测序成功片段 中大部分与应力作用后细胞在各个水平发生的变化密 切相关,其中包括有肌动蛋白- 4、间隙因子- 3A、核糖 #271#实用口腔医学杂志( J Pract Stomatol) 2004 May, 20(3) 体蛋白 L31、S20、S23、S14、S23、L9、ATP 酶、转录因 子- 4、转化生长因子 B、单链 DNA 结合蛋白 1、CLL 相关抗原 KW- 12、趋化因子 1等。与正常序列相比, 测序结果在可信的测序长度内,未发现错误及突变。 此外, 成功获得一个新的基因片段, 共 714个碱 基,经 Internet GenBank数据检索,该基因位于 9号染 色体上,功能未知。 3 讨 论 应力与生长的关系是目前研究的一个热点。骨组 织在受到牵拉力作用后, 会出现明显的增生性改建,这 就是正畸牙齿移动、牵张成骨技术( distration osteogen2 esis, DO)等的生物学基础。但机械信号究竟是如何转 导的,是否还有其它途径或未知的基因参与这一过程 等,均不清楚。常规的检测技术, 如免疫组织化学, 原 位杂交等,只能对已知基因进行检测,而无法检测到未 知基因[3~ 5]。因此,本研究构建人成骨样细胞机械牵 拉力敏感基因 cDNA扣除文库,希望以此文库为工具, 进一步研究已知基因,发现新基因。 克隆差异表达基因的技术很多,如消减杂交技术、 差示 PCR技术、定位克隆技术、外显子捕获技术、功能 克隆技术以及基因芯片技术等。每种技术都各有所 长,有其自己的最佳适用条件, 其中, 以消减杂交技术 最为常用[6]。消减杂交技术的基本方法是将双方细 胞的 cDNA进行杂交,然后去除杂交体,从而获得差异 表达基因的 cDNA。根据其原理, 大致可分为两类,即 基于 cDNA的消减杂交和基于 PCR 的消减杂交。由 于前者对于 mRNA 的需要量大,本实验无法采用。后 者的技术优点在于将目的 cDNA 和扣除 cDNA 进行 PCR扩增,从而解决材料来源不足问题, 实验方法简 捷有效,而且可以获得低丰度基因, 缺点是小片段过 多,难以获得全长的 cDNA克隆[ 7]。 构建细胞机械牵拉力敏感基因 cDNA 扣除文库 时,除了加载这一差异外,在其他方面均应尽可能保持 一致性。由于本实验中使用的装置每次只能对 1个 6 孔板内的细胞进行加载, 所能获得的 mRNA 量较少, 因此需进行了多次加载。人骨肉瘤细胞系 Saos- 2具 有成骨细胞的大部分表型特征, 在许多研究中被用于 替代成骨细胞[ 8, 9]。本研究中采用 Saos- 2细胞系,而 不是正常的人成骨细胞, 是由于细胞系较为稳定, 可以 避免多次加载时细胞由于传代次数等不同带来的差 异。 实验中采用 Superscript II 反转录酶来制备加载 细胞的 cDNA,以增加 cDNA的长度, 采用了具有高效 扩增和校正活性的 Taq酶, 增加了获得较长片段的机 会, 提高了 PCR 产物序列的正确率。同时, 杂交后 PCR产物只进行了 4个循环的扩增, 以尽量减少小片 段的倾向性。但尽管如此,实验中获得的 38个有插段 的克隆中大小在 500 bp以上的26个,只占68%, 实验 结果也体现出基于 PCR的消减杂交技术的缺点。本 研究用基于 PCR的消减杂交技术,成功地建立了人成 骨样细胞机械牵拉力敏感基因的 cDNA文库,从初步 的测序结果看, 大部分基因与应力作用下细胞发生的 生物学变化有关,且在可信的测序长度内,没有发现错 误或突变,充分表明所构建的文库是特异、有效的。更 有意义的是,在初步的测序结果中发现了一个新的基 因片段,这将是我们下一步的研究重点。 参考文献 [ 1] Karjalainen HM, Sironen RK, EloMA, et al . Gene expres2 sion profiles in chondrosarcoma cells subjected to cyclic stretching and hydrostatic pressure. A cDNA arr ay study. Biorheology, 2003, 40(1) : 93 [ 2] Endlich N, Sunohara M, Nietfeld W, et al . Analysis of dif2 ferential gene expression in stretched podocytes: Osteopontin enhances adaptation of podocytes to mechanical stress. FASEB J, 2002, 16(13) : 1850 [ 3] Carvalho RS, Scott JE, Yen EH. The effects of mechanical stimulation on the distr ibution of beta 1 integr in and expres2 sion of beta 1- integrin mRNA in TE- 85 human osteosar2 coma cell. Arch Oral Biology, 1995, 40(3) : 257 [ 4] Ziros PG, Gil AP, Georgakopoulos T, et al . The bone - specific transcript ional regulator Cbfa1 is a target of mechani2 cal signals in osteoblastic cells. J Biol Chem, 2002, 277 ( 26) : 23934 [ 5] Cillo JE Jr, Gassner R, Koepsel RR , et al. Growth factor and cytokine gene expression in mechanically strained human osteoblast- like cells: implications for distraction osteogene2 sis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 2000, 90(2) : 147 [ 6] 王涛, 陆应麟.抑制性消减杂交技术的原理和应用. 国外 医学分子生物学分册, 1998, 20( 6) : 271 [ 7] Wieland I, Bolger G, Asouline G, et al . A method for dif2 ference cloning: gene amplification following subtractive hy2 br idization. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87( 7) : 2720 [ 8] Sofia S, McCart hy MB, Gronowicz G, et a l. Functionalized silk- based biomaterials for bone formation. J Biomed Mater Res, 2001, 54( 1) : 139 [ 9] Tryoen- Toth P, Vaut ier D, Haikel Y, et al. Viability, ad2 hesion, and bone phenotype of osteoblast- like cells on poly2 electrolyte multilayer films. J Biomed Mater Res, 2002, 60 ( 4) : 657 (收稿: 2003211221) #272# 实用口腔医学杂志( J Pract Stomatol) 2004 May, 20(3)