水产品中诺如病毒检测技术研究进展

《渔业现代化))2008年第35卷第5期 水产品中诺如病毒检测技术研究进展 苏来金1’2，周德庆2，柳淑芳2 (1中国海洋大学食品科学与学院，青岛266003； (2农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛266071) 摘要：近年来，诺如病毒(Noroviruses，NVs)引发的大规模肠胃炎事件在世界范围内频繁暴发，食用水产品是 人感染NVs的一个主要途径，因此水产品中NVs的准确检测与监控是预防疫情暴发、控制疫情扩散的有效 途径。文中介绍了NVs的分子生物学与流行病学特征，对目前国内外水产品中NVs检测技术及研究状况进 行了综述，为水产品中NVs的检测提供参考。 关键词：水产品；诺如病毒；检测技术 诺如病毒(Noroviruses，NVs)曾被称为小圆结 构病毒(SmallRoundStructuralVirus，SRSVs)、诺 瓦克样病毒(Norwalk—likevirus，NLVs)，2002年8 月，国际病毒分类委员会将诺瓦克样病毒统一命 名为诺如病毒⋯。NVs是导致人类非细菌性肠胃 炎的主要病原嵋。3J。由于水环境的污染，许多水 产品遭受了NVs的污染，特别是作为滤食性水生 动物的贝类，很容易从污染的水中富集大量食源 性微生物和病毒L4J。近年来，由于生食含有NVs 的贝类等水产品引发的大规模肠胃炎疫情时有发 生∞‘6j，给消费者健康带来了巨大威胁，也给水产 行业带来了重大损失。因此，建立水产品中NVs 快速灵敏的检测方法对于预防疫情暴发、减少经 济损失具有重要意义。然而，由于NVs尚不能进 行体外培养，且基因型复杂多变，目前还没有一种 通用的特异性引物同时检出多种基因型NVs，对 于食品及水产品而言，也没有建立起一种特异的 NVs富集分离技术，这些都给食源性NVs的检测 带来了困难。文章就目前国内外水产品中NVs 的检测技术进行了总结，为水产品NVs监控提供 参考。 1 NVs的分子生物学与流行病学特征 1．1分子生物学特征 NVs属于脊椎动物病毒(VertebrateVirus)杯 状病毒科(Calicivifidae)，该类病毒直径26～35 nm，无包膜，面粗糙，球形，呈20面体对称川。 从胃肠炎患者粪便中提取的NVs的eDNA全序列 分析表明，NVs基因组为7．5—8kb大小的单股 正链RNA病毒‘81。其基因组包括3个开放阅读 框(ORFs)分别编码非结构蛋白、衣壳蛋白和一种 功能还不清楚的蛋白一o。 根据RNA多聚酶区和衣壳蛋白区的核苷酸 和氨基酸序列比较，可以将NVs分为5个基因组 型(GGI、GGlI、GGllI、GGIV和GGV)LiO3，其中 GGI、GGII和GGIV型NVs可以感染人。在基因 组中NVs可以进一步划分不同的基因群或型，目 前NVs成员已有100多个分离株。 1．2 流行病学特征 NVs传染发生的几率高(大于50％)，且少量 (10～100个)的病毒粒子即可引发感染。在NVs 感染12～48h，感染者会出现呕吐、胃部痉挛、腹 泻、腹部疼痛、低烧、头疼等症状。该疾病属于温 和性疾病，可以自愈，一般不需要住院。但由于脱 水，也可能导致患者出现严重的病症甚至死 亡‘11|。 NVs在离体条件下存活力很强，主要通过被 收稿曰期：2008-09一ll；修回日期：2008—10-08 基金项目：围家“863”高技术研发项目(2007AA092400)；山东省科技攻关项目(2007GGl0005015) 作者简介：苏来金(1982一)，男，硕士研究生，研究方向：水产品质量安全。 通讯作者：周德庆(1962一)，男，研究员，博士研究生导师，主要研究方向：水产品安全与质量控制(食品营养与卫生)、水产品加工与综合 利用。E-mail：zhoudq@ysfri．ac．cn 万方数据 《渔业现代化}2008年第35卷第5期 35 污染的食物进行传播，该类病毒通过粪一口途径 进行传播，此外接触表面、手、食物、水都是传播的 重要途径。双壳贝类是NVs传播的最主要载体， NVs外壳为蛋白质，表面往往带负电荷，易吸附于 颗粒物表面，在颗粒物和浊度较高的水内，病毒往 往随颗粒物沉淀于水底，贝类通过食物链摄取、富 集病毒，贝类的这种富集作用导致其内脏团内的 病毒含量可以高出周围环境的几十甚至上千 倍Ll2|。NVs感染对象主要是成人和学龄儿童，冬 季流行最多0133。GGII／4型NVs是世界范围最 常见的基因型，在全球都有其流行扩散的报 道¨4—5|，我国病人感染的NVs也是以基因组GG Ⅱ／4型为主㈣。 2水产品中NVs检测技术研究进展 2．1水产品中Nvs的富集 与腹泻病人粪便中NVs相比，水产品中NVs 含量低，并且水产品样品量大，样品中含有大量的 脂肪、蛋白等RT-PCR反应抑制因子，因此样品的 前处理、病毒的浓缩是检测成功的前提。 贝类属于滤食性动物，通过滤食水中的微藻 获取食物的同时，消化道可大量富集随污水进入 养殖区域的NVs。Schwab等Ⅲo发现，不管接种病 毒量的高低，消化道和胃均可以检测到病毒，当牡 蛎暴露在高浓度的NVs中时，肌肉和体液细胞才 能检出NVs。在牡蛎净化试验中，48h细菌的净 化效果非常显著，可大约减少95％的细菌；而 NVs的病毒滴度减少不大，用消化道进行检测时 只有7％的病毒降低，这表明NVs主要存在于牡 蛎的胃、消化道内。因此，大多数研究者不再取整 个水产样品进行检测，而是只取其内脏组织作为 检测对象，这样就控制了实验体积，节省了试剂， 操作起来更加方便。 氨基酸吸附一聚乙二醇(PEG)沉淀是从水产 品等动物肌体中浓缩病毒的常用方法，其原理主 要为在一定pH值下的氨基酸能够吸附带负电的 病毒离子；PEG通过空间位置排斥作用，使液体 中的病毒等微粒被迫挤聚在一起而引起沉淀的发 生。Herrmann等[18]建立了用甘氨酸缓冲液从海 产品组织中直接洗提病毒的方法；PEG沉降水产 品中NVs的同时，大量的蛋白、脂肪等抑制因子 也会随之沉降下来，影响了RT—PCR反应，在提取 RNA时也会浪费大量试剂。为了降低RNA提取 成本，减少抑制因子影响，Kingsley等¨引使用等体 积的氟利昂(Freon)对PEG沉淀物进行抽提，可 以去除大部分抑制因子。最新研究表明，氯仿可 代替氟利昂作为抑制因子的去除剂，可达到同样 的效果，并且更加符合环保要求闭o。Gilpatrick 等心13建立了免疫磁性捕获反转录一聚合酶链式反 应(IMC／RT—PCR)方法，将免疫技术和分子生物 学结合，通过免疫磁珠分离NVs，再用RT—PCR的 方法进行检测，获得较高的检测特异性和灵敏度。 2．2病毒RNA的提取 传统的病毒RNA提取和抑制因子去除方法 主要为CTAB法和硫氰酸胍(GTC)-酚一氯仿法。 这2种方法都可以很好的去除PCR抑制因子，却 无法保持病毒核酸的完整性。TRIzol、RNAiso等 是基于硫氰酸胍一酚一氯仿的原理设计的RNA提 取试剂盒，它比传统方法更为简便，减少了对核酸 的损伤，能较好的得到完整的目的基因，而且可以 有效去除样品中的抑制因子。研究表明，这2种 试剂盒的提取效果良好，并无明显区别旧J。随着 核酸提取技术的不断发展，出现了基于oligo [dT]一磁珠微粒子吸附和oligo[dT]-纤维素吸附 原理的RNA提取试剂盒，这些方法操作更加方 便、省时，提取的RNA纯度高、质量好，但是高纯 试剂盒价格昂贵且有一定的损失。 2．3 NVs的检测方法 2．3．1 电镜法电镜法(EM)观察的灵敏度较 低，要求每毫升粪便样品中至少有大约105—106 个病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排 出时采集的样本检测。电镜法的检出率较低，患 病2—3d后采集的粪便样本阳性检出率只有 10％～20％。免疫电镜法(IEM)可提高电镜的敏 感性10—100倍，在显微镜检查前应用患者恢复 期血清捕捉同型抗原，从而增加检出率。免疫电 镜法的缺陷在于它的成功与否完全取决于操作者 的技能和经验，并且如果存在过量的抗体，就会将 病毒掩盖而导致假阴性团1。在早期，通过电镜法 检测病人腹泻物中NVs是用于判定NVs暴发的 主要检测手段，然而水产品中含有的NVs低，普 通电镜和免疫电镜很难检测到，并且水产品富集 后的沉淀物也会给观测造成影响，很难准确检测。 2．3．2免疫法免疫法有放射免疫法(RIA)、生 万方数据 36 《渔业现代化)2008年第35卷第5期 物素一亲和素免疫法(BAIA)和酶联免疫法 (ELISA)。放射免疫法的灵敏度与免疫电镜法无 显著差别，但它可检测出抗体升高的水平，为流行 病学提供更有参考价值的资料。放射免疫法的不 足之处在于它需要6d时间，且需要放射性同位 素标记。重组杆状病毒表达NVs衣壳蛋白成功 后，建立起的NVs酶联免疫检测方法快速、灵敏、 经济。但是由于NVs存在多种基因组型，并且每 个基因组内存在许多亚型，免疫反应的株型特异 性太强，Richards等Ⅲ1的研究发现酶联免疫方法 特异性为98．3％，而敏感性只有55．1％，寻找广 谱的针对NVs检测的抗体还有待进一步研究，目 前免疫法应用范围还比较窄。 2．3．3 分子检测方法 2．3．3．1RT．PCR检测方法 自从克隆出NVs的cDNA片断并完成测序 后，基于基因组检测的RT．PCR方法迅速发展了 起来。RT—PCR方法非常特异、灵敏，能检测到低 至10～40拷贝的病毒核酸。20世纪90年代以 来，研究者们成功地运用RT．PCR方法对感染者 粪便中的NVs进行了检测，设计引物对RNA多 聚酶基因相对保守的区域进行扩增，获得了较高 的阳性率。Atmar等∽1建立了检测贝类中NVs 的RT-PCR方法，使得样品处理时间加快，提高了 检测灵敏度。汪俊等Ⅲo初步建立了养殖太平洋 牡蛎中NVs的RT—PCR检测方法，并对检出的2 株阳性样品进行了序列分析，表明贝类中NVs与 肠胃炎病人粪便中NVs的高同源性。 许多研究者在RT—PCR方法基础上进行了一 系列的改进，进一步提高了NVs的检测特异性和 灵敏度。H￡ifliger等【2¨建立了水产品中NVs的半 巢式RT—PCR(semi．nestedRT．PCR)检测方法； Green[圳、李晖等‘291将巢式RT—PCR(nested—RT— PCR)方法应用到贝类样品NVs检测中，其灵敏 度比单轮RT．PCR方法提高了10—1000倍；Le Guyader等【如]利用MPN—RT．PCR(most-probable— number—RT—PCR)法对牡蛎中NVs进行了半定量 评价，发现收获季节的牡蛎NVs污染可达到 1000RT—PCR单位以上；DeMedici等¨川建立了检 测贝类中NVs的增强RT．PCR方法(Reverse Transcription-BoosterPCR)，此方法的灵敏度比普 通RT—PCR方法高2个对数单位以上。 实时荧光定量RT-PCR(Real-timeRT-PCR) 方法是在普通RT—PCR基础上，通过荧光探针实 时监测分析PCR产物情况的新技术，不需要电泳 检测，从而进一步增强了样品检测的灵敏度和可 靠性。Myrmel等口引利用荧光定量RT．PCR和荧 光定量nestedRT—PCR对挪威海岸水产品中肠道 病毒进行了检测分析，发现贝类样品NVs检出率 为6．8％，冬季更高。潘良文等【3列建立了从贝类 中提取NVs的RNA并进行实时荧光RT—PCR 检测方法。利用荧光定量RT-PCR技术，通过对 一系列梯度浓度NVs克隆质粒或RNA的检测， 可以做出曲线，从而对初始NVs核酸量进行 定量。但由于受标准品制备的限制，NVs的绝对 定量方法尚不统一。 2．3．3．2序列特异性核酸体外扩增技术(nucle— icacidspecific—basedamplification，NASBA) NASBA于1990年首次被提出，它是一种扩 增RNA新技术，是由一对引物引导的、连续均一 的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过 程，反应在42℃进行，可以在2h左右将模板 RNA扩增约109倍，不需要特殊的仪器Ⅲo。NAS- BA特别适用于扩增单链RNA，已经成功应用于 大量不同的DNA或RNA病毒，例如HIV、甲型、 乙型、丙型肝炎病毒、狂犬病病毒等，我国已有2 项禽流感病毒的国家标准都采用了NASBA方 法。NASBA直接扩增RNA来检测NVs，样品中 病原RNA得到指数级扩增，整个反应过程只有一 步RNA扩增，避免了RT．PCR存在的RNA交叉 污染，节省了时间，提高了检测的特异性和准确 性，产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴 定结果。但是目前NASBA方法的灵敏度略低于 RT．PCR法，还没有广泛的应用于l临床中，仍在摸 索改进阶段，国外检测NVs的NASBA方法主要 以腹泻病人的粪便为研究对象，Jean等汹。以现代 即食食品为研究对象，建立了即食食品中检测 HAV和NVs的复合NASBA方法，用凝胶电泳和 点杂交方法分别进行定性定量分析，为食品中 NVs的NASBA检测方法的进一步研究提供了重 要依据。NASBA方法检测NVs在国内尚未有报 道。NVs的NASBA检测技术有待于新的特异性 引物设计与反应体系的开发，该方法为NVs检测 提供了另一种快速、灵敏的检测手段，是RT—PCR 万方数据 《渔业现代化))2008年第35卷第5期 37 方法的一个有效补充，也是一种急需开发的病毒 检测新技术。 3展望 随着环境污染的加剧，食品中致病微生物、病 毒的污染也随之增加，其中水污染是造成NVs在 水产品中高度富集主要原因。2002年，美国用 RT．PCR方法从进口为中国的文蛤中检测出NVs， 由此对从中国进口的文蛤进行封存禁售。要从根 本上解决此类问题，促进水产品国际贸易的和谐 发展，就必须紧跟国际发展潮流，掌握国际最新的 检测技术，提高应对国际贸易技术壁垒的能力。 当前水产品中NVs检测技术有待于进一步深入 研究，可以在NVs体外培养技术、食源性载体中 NVs特异富集分离纯化技术、通用引物设计、分子 生物学新方法开发等方面做更深入的研究，要着 重突出快速和准确，从而为疫病防治的实时监控 提供技术保障；其次，要对我国水产品中NVs污 染状况做全面的调查，并进行科学的风险评估，从 而制定出防止NVs从水产品中传染到人的有效 管理措施和预警；另外，在生产加工中要将 NVs纳入生产的危害分析关键控制点(HACCP) 中，才能有效预防NVs的暴发。 口 参考文献 [1]MOOREC，CLARKEM，GALLIMORECI，ela1．Evaluationofa broadlyre,∞tivenucleicacid8dquembasedamplificationassay forthedetectionofnorovirusesinfaecalmaterial[J]．JClinVir- ol，2004，29：290-396． [2]FANKHAUSERRL，MONROESS，NOELJs，ela1．Epidemio- logicandmoleculartrendsofNorwalk—likevirusesassociatedwith outbreaksofgastroenteritisintheUnitedStates[J]．JInfectDis， 2002，186(1)：I-7． [3]NISHIDAT，KIMURAH．SAITOHM，eta1．Detection，Quantita- tion，andPhylogeneticAnalysisofNorovirusesinJapaneseOy争 ters[J]．ApplEnvironMicmbiol，2003，69(10)：5782-5786． [4]LEESD．Virusesinbivalveshellfish[J]．IntJFoodMicmbiol， 2000，59：81-116． [5]王晓欢，于思庶．诺如病毒胃肠炎的研究进展[J]．中国人兽 共患病学报。2007，23(6)：621-623． [6]FLE汀℃HERH，AGENCIES．Twomillionstruckdownbynorovir- us[EB／OL]．UK：TimesNewspapersLid．，2008(2008-01-03) [2008-10-06]http：／／www．timesonline．t5,o．uk／tol／life～and— style／health／article3126491．ece 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万方数据 水产品中诺如病毒检测技术研究进展 作者： 苏来金， 周德庆， 柳淑芳， SU Lai-jin， ZHOU De-qing， LIU Shu-fang 作者单位： 苏来金,SU Lai-jin(中国海洋大学食品科学与工程学院,青岛,266003;农业部海洋渔业资源 可持续利用重点开放实验室,中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛,266071)， 周德庆 ,柳淑芳,ZHOU De-qing,LIU Shu-fang(农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室,中 国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛,266071) 刊名： 渔业现代化 英文刊名： FISHERY MODERNIZATION 年，卷(期)： 2008,35(5) 被引用次数： 1次 参考文献(35条) 1.MOORE C;CLARK E M;GALLIMORE C I Evaluation of a broadly reactive nucleic acid sequence based amplification assay for the detection of noroviruses in faecal material[外文期刊] 2004(4) 2.LEES D Viruses in bivalve shellfish[外文期刊] 2000(1/2) 3.NISHIDA T;K1MURA H;SAITOH M Detection,Quantitation,and Phylngenetic Analysis of Noroviruses in Japanese Oysters[外文期刊] 2003(10) 4.KINGSLEY D H;RICHARDS G P Rapid and Efficient Extraction Method for Reverse Transcription-PCR Detection of Hepatitis A and Norwalk-Like Viruses in Shellfish[外文期刊] 2001(09) 5.HERRMANN J E;CLIVER D O Methods for detecting foodborne enteroviruses 1968 6.JEAN J;DSOUZA D H;JAYKUS L A Multiplex 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