流行性感冒病毒鸡胚高产株的遗传特性分析

�简报� 流行性感冒病毒鸡胚高产株的遗传特性分析 董婕, 张立国,陈爱君,吴昆昱, 孙梅生,张智清 (中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所, 北京 100052) 关键词:流行性感冒病毒; 高产毒株;基因突变 中图分类号: R373� 1+ 3; Q78� � 文献标识码: A � � 文章编号: 1000- 8721( 2002) 04- 0367- 04 收稿日期: 2001- 11- 21;修回日期: 2002- 01- 16 基金项目:科研院所技术开发研究专项基金( NCST E- 2000- JKZX- 231 ) ; 973! 计 划 传染 病 防 治基 础 研究 ( 973 - G19999054108)。 作者简介:董婕( 1972- ) ,女,吉林人,主要从事流感病毒的研究。 � � 流行性感冒(流感)病毒的基因组由分节段的单 股负链 RNA组成,其中 A、B型流感病毒含 8 个基 因节段[ 1]。它的第 4和第6节段分别编码病毒的血 凝素(HA)和神经氨酸酶( NA) ,决定病毒的抗原性, 其它 6个节段与病毒的生长特性有关[ 2]。在流感疫 苗生产中,为了提高产量,利用高产毒株与流行毒株 基因重配获得重组病毒, 它含有流行毒株的第 4、第 6节段和高产毒株的其它 6个节段,这样既具有流 行毒株的抗原性又具有高产特性,可以用来降低疫 苗的生产成本。A/ PR/ 8/ 34( H 1N1 )是目前常用于 重配的高产株之一,它经实验室长期适应已获得在 鸡胚传代稳定高产的生物学特征。本文中测定了 A/ PR/ 8/ 34(H 1N1)高产株内部基因的序列, 并与其 原始序列进行比较, 探讨了病毒高产的分子机制。 首先将我室保存的 A/ PR/ 8/ 34( H1N1)高产株 10- 3 接种 10日龄鸡胚后, 33 ∀ 孵育 48h 收获病毒尿囊 液。经血凝实验测定病毒血凝滴度为 1: 640。用 Q IAGEN 公司 Rneasy Mini Kit 提取病毒基因组 RNA。针对流感病毒的末端保守区设计通用引物, 序列为 5#- agc gaa agc agg - 3#,用于反转录。采用 GIBCO BRL 公司的 THERMOSCRIPT TM RT - PCR System 反转录获得病毒 cDNA。为了保证基 因扩增过程中的保真性, PCR扩增采用 STRATA� GENE 公司的 Pfx DNA Polymerase。不同节段基因 扩增采用各自的特异引物。纯化 PCR产物,克隆流 感病毒基因到 pGEM- 3zf 载体送测序。为了确凿 证实病毒基因组的点突变是高产毒株特有的, 而不 是 PCR过程中发生的变异,每个基因节段至少测定 3个克隆, 并且各克隆序列符合率∃99%。从而确 定高产毒株的基因序列。利用 DNASTAR 软件完 成蛋白质的翻译, 与病毒原始序列比较采用 DNA� SIS( Version 2�5)软件进行。 通过 RT - PCR 扩增得到 A/ PR/ 8/ 34 毒株基 因组的 8个片段, 经电泳证明与预计的分子量一致 (图 1) ,将其克隆到 pGEM- 3zf载体中进行测序。 图 1 � RT- PCR扩增流感病毒 A/ PR/ 8/ 34 基因组 8 个 节段 F igur e 1 � RT - PCR amplification of 8 segments of in� fluenza v irus A / PR/ 8/ 34 genome M�Marker; 1�PB2; 2�PB1; 3�PA; 4�HA; 5�NP; 6�NA; 7�M; 8�NS� � � 鸡胚高产株与 GenBank 中原始的 A/ PR/ 8/ 34 ( H1N1)序列比较 ( PB2: J02153, PB1: J02151, PA: J02152, NP: J02147, M : J02145, NS: J02150) , 结果 如表 1。(阴影部分是核苷酸突变可以引起氨基酸 变异的错义突变。)在三种复制酶基因中, PB2节段 共有 21个点突变, 6个氨基酸变异; PB1节段中 18 个碱基变异, 9个氨基酸突变; PA 中有 12个碱基变 异,但未导致任何氨基酸突变; NP 为病毒的核蛋 白,有 20个位点变异, 导致 6个氨基酸突变;第 7个 节段编码两种蛋白, 共有 12 个碱基变异, 其中 M1 蛋白有 1个氨基酸突变, M2中有 3个;最小的节段 NS也编码两种蛋白, 共 10 个碱基改变, 导致 NS1 第 18卷 � 第 4期 2 0 0 2 年 1 2 月 � � � � � � � � � � � � 病 � � 毒 � � 学 � � 报 CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY � � � � � � � � � � � � Vol. 18 � � No. 4� Dec. � � 2 0 0 2 中 2个氨基酸突变, NS2中氨基酸未发生变异。 表 1� 高产毒株 6 个内部基因节段核苷酸点突变及其相应的氨基酸的变化 Table 1� Po int mutations in 6 internal gene segments of t he high- yielding strain and their encoding amino acid substitut ions �368� 病 � � 毒 � � 学 � � 报 � � � � � � � � � � � � � � � � � 18 卷 � � � 各基因节段变异率比较见表 2。编码病毒复制 酶的 3个节段的突变率低于其它 3个节段,其中 PA 基因突变率最低,仅为 5�4% ; M、NS基因的突变率 接近,而 NP 突变率最高,达到 12�8%。 表 2 � 高产毒株 6 个内部基因节段突变率 T able 2 � Difference of mutational frequency among 6 internal g ene segments of high- yielding strain Gene Length( nt ) Mutation( nt) Mutat ional f requency & 10- 3 PB2 2, 341 21 9�0 PB1 2, 341 18 7�7 PA 2, 233 12 5�4 NP 1, 565 20 12�8 M 1, 027 12 11�7 NS 890 10 11�2 Total 10, 397 93 8�9 � � 病毒蛋白的相对突变率比较见表 3。在 3个多 聚酶蛋白中, PB2与总的平均突变率相同, PB1远高 于平均突变率, PA 没有氨基酸的变异; M 2 蛋白的 突变率最高, 97个氨基酸有 3 个改变, 其突变率达 到 3%。另外, NS2蛋白也未发生氨基酸改变。 表 3� A/ PR/ 8/ 34( H1N1) 鸡胚高产毒株 6 个内部基因节段 编码的 8 个蛋白突变率 T able 3 � Difference of mutational frequency among 8 proteins of high- y ielding str ain Protein Length ( aa) aa change ( aa) Mutat ional f requency & 10- 3 PB2 759 6 7�9 PB1 757 9 11�9 PA 716 0 0�0 NP 498 6 12�0 M1 252 1 4�0 M2 97 3 30�9 NS1 230 2 8�7 NS2 121 0 0�0 Total 3, 430 27 7�9 � � 在流感病毒复制酶 3个亚基中, PB2蛋白能够 识别和切割宿主细胞 mRNA 5#端帽结构, 作为病毒 mRNA 复制的引物。PB1 蛋白在转录过程中有起 始和延伸的作用[ 3, 4]。PA具有蛋白酶的功能[ 5] , 在 病毒的基因组 RNA 合成中发挥作用,但其作用机 理还不太清楚。本研究表明, 高产毒株的 PA 在聚 合酶的 3个亚基中突变率最低, 这可能与其在转录 中所发挥的作用有关。NP 蛋白主要负责维持核蛋 白复合物的稳定,并在病毒 mRNA合成和延伸过程 中起抗终止作用[ 6]。在高产毒株中, NP 蛋白突变 率较高的原因可能与该毒株适应鸡胚生长获得高产 性状有关。M2 是膜蛋白, 具有离子通道活性[ 7] ,在 高产毒株中突变率最高,其机制还不太清楚。 X- 31( H3N2)是另外一株被用于灭活疫苗生产 的高产毒株, 其 6 个内部基因节段也是来源于 A/ PR/8/ 34 ( H1N1 ) [ 8]。K H Lee 等在研究 X - 31 ( H3N2)的高产性能时也发现, M 2蛋白的突变率最 高, PA在 3个聚合酶基因中相对的突变率最低。这 与我们的研究结果相同。但是他们的结果中 NP 蛋 白没有任何的氨基酸变异, 这与我们的结果不同。 这可能是由于两个实验室保存的毒种经宿主传代的 不同,更说明病毒株的高产性状是多基因联合作用 的结果, 不能简单地定义为某个基因或某个位点的 变异所形成。总之, 病毒株高产性状是经鸡胚连续 传代的结果,是 6个内部基因节段点突变积累所成。 近两年来,流感病毒基因操作技术取得了突破 性的进展。Hoffmann E 等人成功构建了含有流感 病毒基因组 8个节段的重组质粒系统, 利用这套质 粒系统转染真核细胞可以获得具有复制能力的病 毒[ 9]。上述技术的开发成功, 使得在 DNA 的水平 上对流感病毒的基因组进行任意改造成为可能, 从 而获得需要的突变毒株。这必将对流感病毒的研究 起到巨大的推动作用, 例如阐明各基因节段的功能, 细胞与病毒的相互作用机理,包括揭示高产毒株高 产特性的分子机制。 参考文献: [ 1] M cGeoch D, Fellner P, Newton C� Influenza virus genome consist s of eight dist inct RNA species[ J ]�Proc Nat l Acad Sci U SA, 1976, 73: 3045- 3049� [ 2] S hapiro G I, Gurney T J r, Krug R M� In fluenza virus gene expres� sion: control mechanisms at early and late times of infect ion and nu� clear- cytoplasmic t ransport of virus- specific RNAs[ J]�Virology, 1987, 61: 764- 773� [ 3] Blaas D, Patz elt E, Kuechler E� Ident ificat ion of the cap binding pro� t ein of influenza virus [ J ] �Nucleic Acids Res, 1982, 10: 4803 - 4812� [ 4] Braam J, U lmanen I, Krug R M�Molecular model of a eukaryotic t ranscript ion complex: function and movements of inf luenza P pro� t ein during capped RNA- primed transcript ion [ J ]�Cell, 1983, 34: 609- 618� [ 5] Digard P, Blok V C, Inglis S C�Com plex format ion betw een influen� za virus polymerase proteins expressed in Xenopus oocytes [ J]� Vi� rology, 1989, 171: 162- 169� [ 6] Beaton A R, Krug R M�T ranscript ion ant itermination during in� f luenza viral template RNA synthesis requires the nucleocapsid pro� t ein and the absen ce of a 50 capped end [ J] �Proc Nat l Acad Sci U SA, 1986, 83: 6282- 6286� �369�� 4 期 � � � � � � � � � � � � 董婕等: 流行性感冒病毒鸡胚高产株的遗传特性分析 [ 7 ] Holsinger L J, Lamb R A� Influenza virus M2 integral membrane protein is a homotetramer stabiliz ed by format ion of disulfide bond [ J]�Virology, 1991, 183: 32- 43� [ 8] Baez M , Palese P, Kilbourn e E D�Gene composit ion of high- yield� ing influenza vaccine st rains obtained by recombinat ion [ J]� J Infect Dis, 1980, 141: 362- 365� [ 9] Hoffmann E, Neumann G A�DNA transfect ion system for genera� t ion of inf luenza A virus f rom eight plasmids[ J]�Proc Nat l Acad Sci U SA, 2000, 97: 6108- 6113� Identification of Mutations in a High- yielding Strain of Influenza Virus DONG Jie, ZHANG Li- guo, CHEN Ai- jun, WU Kun- yu, SUN M ei- sheng , ZHANG Zhi- qing ( National Insti tute f or Vi ral Di sease Cont rol and Prev ent ion, China CDC , Beij ing 100052, China ) Abstract: Inf luenza virus st rain A/ PR/ 8/ 34( H1N1) acquired a high - yielding property after serial passages in fert ilized eggs�Six internal RNA segments of the high- yielding strain were sequenced from their cloned cDNAs and compared w ith the corresponding original sequences in the prime A/ PR/ 8/ 34( H1N1) st rain�Ninety- three point mutat ions w ere found accumulated in six genes( PB2, PB1, PA, NP, M, and NS) , w hich lead to 27 amino acid changes�A significant low mutat ion frequency w ithout amino acid change was observed in PA gene�The mu� tat ion frequency at the am ino acid level w as the highest ( about 3%) in M2 protein�Our data suggest that the un� equal distribution of mutations among different viral proteins may correlate w ith individual role of each protein in v iral grow th� Key words: influenza virus; high- yielding st rain; gene mutation �370� 病 � � 毒 � � 学 � � 报 � � � � � � � � � � � � � � � � � 18 卷 �