SNT 2744-2010 鸭病毒性肠炎检疫技术规范

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业 !" ! #!"## " !$%$ 鸭病毒性肠炎检疫技术 $ %&'&()*(+ , '-)-.-/0-'1%.23*'%4+()+'*)*4 !$%$5%%5$% 发布 !$%%5$&5$% 实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）发布的《陆生动物诊断试验和疫苗》（２００９版）中２．３．７ 章关于鸭病毒性肠炎的有关内容而制定： ———修改采用了ＯＩＥ发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中病毒分离鉴定、ＰＣＲ方法、微量血 清中和试验的技术要求； ———增加了ＯＩＥ发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中没有提及的荧光ＰＣＲ检测方法、直接 荧光抗体试验、间接酶联免疫吸附试验。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准的起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：孟日增、石建平、王建华、肖成蕊、王伟利、王振国、刘晶。 Ⅰ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 鸭病毒性肠炎检疫技术规范 １　范围 本标准规定了鸭病毒性肠炎的病毒分离与鉴定、ＰＣＲ方法、荧光定量ＰＣＲ方法、免疫荧光试验、微 量中和试验、ＥＬＩＳＡ等操作规程及技术要求。 本标准适用于鸭、鹅等水禽及天鹅（雁形目）鸭病毒性肠炎的诊断与检疫。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ／Ｔ６６８２　实验室用水规格和试验方法 ３　概述 鸭病毒性肠炎（ｄｕｃｋｖｉｒｕｓｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）又称鸭瘟（ｄｕｃｋｐｌａｇｕｅ），该病是由疱疹病毒科鸭瘟病毒引起的 一种急性（有时呈慢性）鸭、鹅和天鹅（雁形目）接触性传染病，其特征为体温升高，两腿麻痹，下痢，流泪 和部分病鸭头颈肿大。食道粘膜有小出血点，并有灰黄色假膜覆盖或溃疡，泄殖腔粘膜充血出血水肿和 假膜覆盖。肝有不规则大小不等的出血点和坏死灶。本病传播迅速，发病率和病死率都很高，严重地威 胁养鸭业的发展。 鸭病毒性肠炎的诊断方法包括临床综合诊断、病原学诊断、血清学试验和分子生物学检测。 ４　诊断技术 ４．１　临床综合诊断 ４．１．１　临床症状 自然感染的潜伏期一般为３ｄ～４ｄ，鸭群突然出现持续性高死亡率，病初体温升高（４３℃以上），呈 稽留热。这时病鸭表现精神萎顿，头颈缩起，食欲减少或停食，渴欲增加，羽毛松乱无光泽，两翅下垂，两 脚麻痹无力、走动困难，流泪和眼睑水肿是鸭瘟的一个特征性症状。同时病鸭下痢，排出绿色或灰白色 稀粪，泄殖腔粘膜充血，出血水肿严重者粘膜外翻。用手翻开肛门时，可见到泄殖腔粘膜有黄绿色的假 膜，不易剥离。成年鸭死亡时膘情良好，死亡的鸭阴茎脱垂明显；产蛋鸭群在死亡高峰期产蛋明显下降； ２周龄～７周龄商品雏鸭表现脱水、消瘦，喙发蓝，结膜炎、流泪、鼻腔有渗出物和泄殖腔有血染等特点。 自然条件下鹅感染鸭瘟，其临床特点与鸭相似。 ４．１．２　病理学检查 鸭瘟眼观变化见败血症的病变，体表皮肤有许多散在出血斑，眼睑常粘连分泌干酪样物覆盖。部分 头颈肿胀的病例，皮下组织有黄色胶样浸润。食道粘膜有纵行排列的灰黄色假膜覆盖或小出血斑点，假 膜易剥离，剥离后食道粘膜留有溃疡斑痕，这种病变具有特征性。肠粘膜充血出血，以十二指肠和直肠 １ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 最为严重。泄殖腔粘膜表面覆盖有一层灰褐色或绿色的坏死结痂，不易剥离，粘膜上有出血点和水肿。 产蛋母鸭的卵巢滤泡增大，有出血点和出血斑，有时卵泡破裂，引起腹膜炎。雏鸭感染鸭瘟病毒时，法氏 囊呈深红色，表面有针尖状的坏死灶，囊腔充满白色的凝固性渗出物，这些病变具有诊断意义。 组织学变化，以血管壁损伤为主，小静脉和微血管明显受损，管壁内皮破裂。具有特征性组织学变 化，见坏死的肝细胞发生明显肿胀和脂肪变性，肝索结构破坏，中央静脉红细胞崩解，血管周围有凝固性 坏死。肝细胞见有核内包涵体。脾窦充满红细胞，血管周围有凝固性坏死。食道和泄殖腔粘膜上皮细 胞坏死脱落，粘膜下层疏松，水肿，有淋巴样细胞浸润。胃肠粘膜上皮见有核内包涵体。 结合临床症状与病理学检查，可对本病作出初步诊断。 ４．２　病毒分离与鉴定 ４．２．１　材料和试剂 ４．２．１．１　器材 细胞培养瓶（或培养板）、吸管、移液器、二氧化碳培养箱、冷冻高速离心机、研磨器、倒置显微镜、Ｇ６ 玻璃滤器、孔径０．２２μｍ微孔滤膜。 ４．２．１．２　水 符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水要求。 ４．２．１．３　试剂 胰酶消化液、细胞生长液、细胞维持液、双抗液分别见附录Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．４。 ４．２．１．４　实验动物 １日龄易感雏鸭、１０日龄～１４日龄ＳＰＦ鸭胚。 ４．２．１．５　细胞 原代鸭胚成纤维细胞（ＤＥＦ细胞）、原代鸭胚肾细胞（ＤＥＫ）。 ４．２．２　病毒分离培养 ４．２．２．１　样品采集和运送 ４．２．２．１．１　样品采集 在发病早期，无菌采集病鸭血液或刮取口腔伪膜及溃疡处粘液；在动物死亡后，无菌采取肝、脾、肾 组织样品。 ４．２．２．１．２　运送及保存条件 立即进行实验室检测的样品，保存于４℃或置于冷藏盒中快速送达，不能立即检测的样品置于 －７０℃ 以下条件冷冻保存待检。 ４．２．２．２　样品制备 血液样品应分离出血清或血浆，作为接种材料。 组织样品（肝、脾、肾），加入无血清细胞培养液，制成１０％悬液，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，吸取上清 液，加入１％双抗溶液，４℃作用３ｈ～４ｈ（样品确定未污染可不加双抗溶液处理）后备用。污染较为严 ２ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 重的样品或可疑受污染的样品，应用０．２２μｍ的微孔滤膜进行过滤处理后作为接种材料。 ４．２．２．３　病毒分离方法 ４．２．２．３．１　接种实验动物法 选取１日龄易感雏鸭１６只，分成两组。一组用４．２．２．２中制备的接种材料进行肌肉接种，每只 ０．５ｍＬ，另一组用同一剂量的无血清细胞培养液，隔离饲养作对照组。接种后逐日观察，连续观察 ３ｄ～１２ｄ。若对照组与接种组均无异常表现，可判定为病毒分离阴性；若对照组正常，接种组出现４．１．１中 临床表现或死亡病例，立即进行剖检检查，剖检可见４．１．１与４．１．２中的病变，可收集病料进行病毒鉴定。 ４．２．２．３．２　细胞培养法 按照常规方法制备ＤＥＦ单层细胞（可参照附录Ｂ．１），将制备好的样品接种于２４孔细胞培养板培 养的原代细胞单层，每份样本至少接种４孔，每孔０．１ｍＬ～０．２ｍＬ，３７℃吸附１ｈ，倾去多余液体，加入 １ｍＬ营养液，放入３７℃的５％二氧化碳恒温培养箱中培养３ｄ～５ｄ。设正常细胞对照至少４孔。 样品接种２４ｈ后，于倒置显微镜下逐日观察细胞病变并作好相应，若细胞对照孔正常，而接种 样品孔出现细胞变圆、聚堆成簇或由于细胞脱落形成空斑等细胞病变现象时，冻融３次后转入新长满单 层的细胞培养板，如果观察仍出现类似细胞病变，且日渐明显，则可收获细胞培养物，放入－７０℃冰箱 中待鉴定。 如果对照细胞与接种样品细胞均无变化，再盲传两代。盲传过程中若出现细胞病变，按上述原则， 收获细胞培养物，放入－７０℃冰箱中待鉴定；若未出现细胞病变，则按未分离到鸭瘟病毒出具结果。 ４．２．２．３．３　鸭胚分离法 将４．２．２．２中处理好的待接种样品无菌接种于至少１０枚９日龄～１４日龄种鸭胚的绒毛尿囊膜 上，以后在暗室内逐日照胚观察鸭胚死亡情况并记录，弃去２４ｈ内死亡鸭胚，检查１０ｄ内死亡的鸭胚， 若呈现特征性的弥漫性出血，收集绒毛尿囊膜（ＣＡＭ）待鉴定。若胚体未死亡或死亡胚体无明显病变， 则将ＣＡＭ悬液盲传两代，继续观察胚体死亡及病变情况，并收集ＣＡＭ及尿囊液进行病毒鉴定。 ４．２．３　病毒鉴定 用ＰＣＲ方法（见４．３）、荧光定量ＰＣＲ方法（见４．４）和直接荧光抗体试验（见４．５）进行病毒鉴定。 进行病毒分离与鉴定时，要求所有样品处理应于可保证生物安全的相应级别实验室内进行操作；处 理样品使用过的容器、物品、实验材料均应经有效消毒处理后方可运离实验室。 ４．３　犘犆犚方法 ４．３．１　试剂与材料 ４．３．１．１　参考毒株：ＤＰＶＦ３４株，由指定单位提供。 ４．３．１．２　ｒ犜犪狇酶：５Ｕ／μＬ，保存于－２０℃，避免反复冻融或温度剧烈变化，随用随取。 ４．３．１．３　１０倍ＰＣＲ缓冲液：Ｍｇ２＋浓度２５ｍｍｏｌ／Ｌ。 ４．３．１．４　２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ混合液：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ四种脱氧核苷酸。 ４．３．１．５　蛋白酶Ｋ：浓度为１０ｍｇ／ｍＬ。 ４．３．１．６　引物：本试验选用保守性和特异性均好的指导ＤＮＡ聚合酶合成的基因（ＵＬ３１区）序列作为 ＰＣＲ扩增区，设计两条引物Ｐ１、Ｐ２。引物位置和序列如下： Ｐ１（３７５８０～３７５９９）５’ＧＡＡＧＧＣＧＧＧＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＡ３’ Ｐ２（３７１５４～３７１７３）５’ＣＡＡＧＧＣＴＣＴＡＴＴＣＧＧＴＡＡＴＧ３’ ３ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 Ｐ１、Ｐ２引物扩增片段为４４６ｂｐ。 ４．３．２　其他试剂 Ｔｒｉｓ碱、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、苯酚、氯化钠、盐酸、乙醚和乙醇等均为市售分析纯。 ４．３．３　器材和设备 ＰＣＲ扩增仪、电泳仪、微量移液器用吸头、凝胶成像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、组织 匀浆器或研磨器、灭菌离心管、离心机等。 ４．３．４　操作方法 ４．３．４．１　样品采集与处理 ４．３．４．１．１　样品采集 发病可疑动物采集血液或口腔、泄殖腔拭子样品，保存于４℃或置于冷藏盒中；死亡动物无菌采集 肝、脾、肾等组织样品；胚体采集绒毛尿囊膜或收集尿囊液；细胞培养物冻融后收获。 ４．３．４．１．２　样品处理 组织样品需用０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２的ＰＢＳ按质量浓度配制成１０％悬液，匀浆或研磨，冻融３次， １２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，收集上清液备用。 拭子样品充分洗脱后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集上清液备用。 全血、尿囊液、细胞培养物等液状样品直接用于检测。 ４．３．４．２　对照样品制备 ４．３．４．２．１　阳性样品：将病毒ＤＰＶＦ３４株接种于长满单层的原代ＤＥＦ细胞（或原代ＤＥＫ细胞）， ３７℃吸附１ｈ后加入维持液，置５％二氧化碳培养箱３７℃培养，逐日观察，待细胞病变（ＣＰＥ）达到约 ７５％时收获病毒悬液，小瓶分装，每瓶１ｍＬ，置－７０℃保存备用。 ４．３．４．２．２　阴性样品：原代细胞培养物。 ４．３．４．３　病毒犇犖犃抽提 ４．３．４．３．１　将４．２．２．３中分离样品或４．３．４．１．２中处理好的４００μＬ待测样品液加到１．５ｍＬ离心管 中，以２００００犵离心２ｈ，沉淀病毒。 ４．３．４．３．２　弃去上清液，用２００μＬＴｒｉｓＥＤＴＡ缓冲液重悬沉淀物。 ４．３．４．３．３　加５μＬ１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ，终浓度为０．２μｇ／μＬ，充分混合，置５０℃温箱１ｈ。 ４．３．４．３．４　加入２５μＬ１０％ＳＤＳ，终浓度为１％，充分混合，３７℃１ｈ。 ４．３．４．３．５　加入１５μＬ５ｍｏｌ／Ｌ氯化钠，终浓度０．３ｍｏｌ／Ｌ，充分混合。 ４．３．４．３．６　加３００μＬ（用ｐＨ８．０ＴｉｒｉｓＨＣｌ）平衡的新鲜苯酚，颠倒混合５０次。 ４．３．４．３．７　１６０００犵离心５ｍｉｎ，将上层水相（样品）转移到一个新管中。 ４．３．４．３．８　重复步骤４．３．４．３．６和４．３．４．３．７中苯酚抽提步骤一次。 ４．３．４．３．９　管中加入５００μＬ乙醚，充分混合，１６０００犵离心１ｍｉｎ。 ４．３．４．３．１０　弃去上层水相（乙醚），重复乙醚抽提（步骤４．３．４．３．９）一次。 ４．３．４．３．１１　打开管盖，５６℃放置１５ｍｉｎ，或到闻不到乙醚气味。 ４．３．４．３．１２　将管中内容物分成两部分，每管加入２．２５倍样品体积的１００％乙醇，颠倒管子数次以混 合管中内容物，室温放置３０ｍｉｎ。 ４ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ４．３．４．３．１３　１６０００犵离心４５ｍｉｎ，弃去上清液。 ４．３．４．３．１４　加入２００μＬ７０％乙醇轻轻洗涤沉淀，然后１６０００犵离心１５ｍｉｎ。 ４．３．４．３．１５　弃去上清液，打开管盖５６℃放置３０ｍｉｎ～４５ｍｉｎ干燥沉淀。 ４．３．４．３．１６　加入３０μＬ无ＲＮＡ酶和ＤＮＡ酶的超纯水重悬ＤＮＡ。 ４．３．４．３．１７　样品管４℃短期保存待用或－２０℃长时间保存。 也可用等效的商品化ＤＮＡ提取试剂盒制备病毒ＤＮＡ样品，操作按说明书进行。 ４．３．４．４　犘犆犚扩增犇犖犃 ４．３．４．４．１　犘犆犚反应液组成 见表１。 表１　犘犆犚反应液组成 １０倍浓缩缓冲液 ５μＬ ｄＮＴＰ ４μＬ 引物Ｐ１ １μＬ 引物Ｐ２ １μＬ ｒ犜犪狇酶 ０．２５μＬ ＤＮＡ ３μＬ ｄｄＨ２Ｏ ３５．７５μＬ 　　总体积为５０μＬ，瞬时离心。 ４．３．４．４．２　犘犆犚反应程序 ９４℃／２ｍｉｎ；９４℃／３０ｓ；４７℃／３０ｓ，７２℃／３５ｓ３５个循环；７２℃／７ｍｉｎ；４℃保存。 ４．３．４．５　犘犆犚产物琼脂糖凝胶电泳 用新鲜的１×ＴＢＥ电泳缓冲液配制１％琼脂糖凝胶（ＥＢ浓度０．５μｇ／ｍＬ）并制板。将琼脂糖凝胶 板水平放入电泳槽，使１×ＴＢＥ电泳缓冲液刚好没过胶面。将５μＬＰＣＲ产物和１μＬ上样缓冲液（６× ＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ）混匀后加入样品孔。同时加入 ＤＮＡ 标准分子量对照品（ＤＬ２０００），５Ｖ／ｃｍ 电泳 ３０ｍｉｎ，当溴酚蓝接近底部时终止电泳。 紫外灯下观察核酸带并判断结果，或用凝胶成像分析仪分析结果。 ４．３．４．６　结果判定标准 ４．３．４．６．１　阳性对照应出现一条约４４６ｂｐ的ＤＮＡ条带，阴性对照和空白对照没有核酸条带，试验成立。 ４．３．４．６．２　待检样品经电泳出现约４４６ｂｐ的ＤＮＡ条带可判为阳性。 ４．３．４．６．３　待检样品扩增经电泳未出现ＤＮＡ条带，或者出现的条带不是４４６ｂｐ判为阴性。 ４．４　荧光定量犘犆犚方法 ４．４．１　材料与试剂 ４．４．１．１　仪器与器材 荧光ＰＣＲ检测仪，台式高速冷冻离心机，振荡器，微量可调移液器（１０００μＬ、２０μＬ～２００μＬ、 ５ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ２μＬ～２０μＬ、０．１μＬ～２．５μＬ）及配套的吸头，离心管等。 ４．４．１．２　试剂 ４．４．１．２．１　阳性对照：连有Ｕ３１部分ＤＮＡ片段的ＰＭＴ１８载体，由指定单位提供。 ４．４．１．２．２　阴性对照：空白ＰＭＴ１８载体，由指定单位提供。 ４．４．１．２．３　ｒ犜犪狇酶：５Ｕ／μＬ，保存于－２０℃，避免反复冻融或温度剧烈变化，随用随取。 ４．４．１．２．４　１０倍浓缩缓冲液：Ｍｇ２＋浓度为２５ｍｍｏｌ／Ｌ。 ４．４．１．２．５　２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ混合液：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ四种脱氧核苷酸。 ４．４．１．２．６　引物 本试验选用保守性和特异性均好的指导ＤＮＡ聚合酶基因（ＵＬ３１区）序列中某段设计二条引物 ＦＰ、ＲＰ和探针，序列如下： ＦＰ：ＡＣＧＣＴＧＴＣＣＡＣＧＴＣＡＧＴＴＴＧ ＲＰ：ＴＧＧＣＴＣＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＡＣ 犜犪狇Ｍａｎｐｒｏｂｅ：ＦＣＧＧＴＣＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＡＣＡＡＧＴＡＰ（Ｆ：ＦＡＭ，Ｐ：ＴＡＱＭＡＮＭＧＢ） ＦＰ、ＲＰ引物扩增片段为８６ｂｐ。 ４．４．１．３　其他试剂 Ｔｒｉｓ碱、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、苯酚、氯化钠、盐酸、乙醚和乙醇等均为市售分析纯。 ４．４．２　操作方法 ４．４．２．１　样品的采集与处理 具体参见４．３．４．１。 ４．４．２．２　病毒犇犖犃抽提 具体参见４．３．４．３。 ４．４．２．３　荧光犘犆犚检测 ４．４．２．３．１　扩增前试剂准备 检测鸭瘟病毒的荧光定量ＰＣＲ反应液配制见表２。 表２　荧光定量犘犆犚反应液配制表 名称 储备液浓度 终浓度 加样量／μＬ 缓冲液 １０× １× ２ ｄＮＴＰ ２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ ２ 上游引物 ２μｍｏｌ／Ｌ ２００ｎｍｏｌ／Ｌ ２ 下游引物 ２μｍｍｏｌ／Ｌ ２００ｎｍｍｏｌ／Ｌ ２ 探针 ２μｍｍｏｌ／Ｌ ２００ｎｍｍｏｌ／Ｌ ４ ｒ犜犪狇酶 ５Ｕ／μＬ ０．０６２５Ｕ／μＬ ０．２５ 水 — — ５．７５ 总体积 — — １８ ６ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 　　各种试剂充分混匀，瞬时离心，取犖 个（犖＝１个阳性对照＋１个阴性对照＋狀个检测样品）荧光 ＰＣＲ反应管，将上述配制好的反应液按每管１８μＬ进行分装。 ４．４．２．３．２　加样 将４．４．２．２中抽提出的ＤＮＡ样品以及阳性对照与阴性对照样品各２μＬ分别加入分装好反应液 的荧光ＰＣＲ反应管中，盖紧管盖，瞬时离心。 ４．４．２．３．３　荧光犘犆犚检测 将加好样品的荧光ＰＣＲ反应管按顺序放入荧光ＰＣＲ检测仪中，并记录摆放顺序，然后设定反应条 件。各循环参数见表３，在第２阶段的延伸时（７２℃／３０ｓ）收集荧光信号。 表３　荧光犘犆犚扩增程序 循环阶段 循环数 温度／℃ 时间 １ １ ９４ ５ｍｉｎ ２ ４０ ９４ ３０ｓ ５８ ３０ｓ ７２ ３０ｓ ４．４．３　结果判定 ４．４．３．１　质控标准 ４．４．３．１．１　阴性对照无Ｃｔ值，并且无扩增曲线。 ４．４．３．１．２　阳性对照的Ｃｔ值应＜３０，并且出现典型的扩增曲线。 ４．４．３．２　判定标准 ４．４．３．２．１　当被检测样品无扩增曲线，表明样品中无鸭瘟病毒。 ４．４．３．２．２　当被检测样品有扩增曲线，且Ｃｔ值≤３０，表示样品中有鸭瘟病毒。 ４．５　直接荧光抗体试验 ４．５．１　材料 荧光标记的兔抗鸭瘟ＩｇＧ：由指定单位提供。 原代ＤＥＦ细胞（或ＤＥＫ细胞）、含１０％和２％小牛血清细胞营养液、冷丙酮、６孔细胞培养板、飞 片、磷酸甘油溶液和荧光显微镜等，由实验室自备。 ４．５．２　操作方法 ４．５．２．１　原代细胞的制备 可采用原代ＤＥＦ或原代ＤＥＫ细胞，制备方法可参照附录Ｂ进行。 ４．５．２．２　飞片的制作 将制备好的浓度约为８．０×１０５ 个／ｍＬＤＥＦ（或ＤＥＫ）细胞悬液加入装有玻璃飞片的６孔培养板每 孔３ｍＬ，放入含５％二氧化碳的３７℃培养箱中培养。 ７ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ４．５．２．３　接种病料 培养２４ｈ～４８ｈ后，飞片上细胞长满单层而且均匀分布时，弃去孔中营养液，每孔接种４．２．２．３中 收集到的分离材料０．２ｍＬ于孔中细胞单层上，并设正常细胞对照。于３７℃吸附１．５ｈ，吸弃未吸附上 的液体，每孔再加入含２％小牛血清维持液３ｍＬ，继续培养２ｄ～３ｄ。 ４．５．２．４　观察细胞病变 待细胞出现细胞变圆、聚堆成簇，取出飞片，用０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４的ＰＢＳ漂洗，放入－２０℃预冷 的丙酮中固定３０ｍｉｎ，取出飞片自然干燥。 ４．５．２．５　荧光抗体染色 在飞片细胞面上滴加工作浓度的相应荧光抗体１００μＬ，置３７℃湿盒中感作３０ｍｉｎ。 ４．５．２．６　洗涤 用０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４的ＰＢＳ漂洗３次，每次３ｍｉｎ，吹干或自然干燥。 ４．５．２．７　封片 磷酸甘油封片，在荧光显微镜下观察。 ４．５．３　结果判定 ４．５．３．１　阴性对照正常细胞的细胞核中无特异性荧光颗粒，试验成立。否则，重新染片观察。 ４．５．３．２　细胞核内出现特异性的亮绿色或黄绿色颗粒状或胞浆内呈团块状荧光者判为阳性。 ４．５．３．３　细胞核呈暗黑色，胞浆呈橘红色且无特异性绿色荧光判为阴性。 ４．６　中和试验（固定病毒稀释血清法） ４．６．１　材料 ４．６．１．１　鸭胚或鸡胚：选用来自健康种鸭群１８日龄～２０日龄的鸭胚或９日龄～１１日龄的ＳＰＦ鸡胚。 ４．６．１．２　细胞：原代鸭胚肾细胞（ＤＥＫ）、原代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ细胞）。 ４．６．１．３　参考血清：阳性血清和阴性血清均由指定单位提供，使用时经５６℃３０ｍｉｎ灭活。 ４．６．１．４　待检血清：无菌采取的被检动物血清，使用前５６℃灭活３０ｍｉｎ。 ４．６．１．５　参考病毒；采用ＤＥＦ细胞时，用鸭病毒性肠炎病毒ＤＰＶＦ３４株，由指定单位提供；采用ＣＥＦ 细胞进行实验时，用鸭病毒性肠炎鸡胚适应病毒，由指定单位提供。 ４．６．１．６　溶液：见附录Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．４。 ４．６．１．７　其他器械：一次性９６孔培养板，剪刀、镊子、平皿、烧杯、三角瓶、刻度离心管、注射器、吸管等 按照细胞培养玻璃器械处理原则清洗，然后以１２１℃高压灭菌３０ｍｉｎ烘干后备用，或者经１６０℃干热 灭菌２ｈ。 ４．６．２　预备试验操作程序 ４．６．２．１　细胞的制备 可采用ＤＥＫ细胞或ＣＥＦ细胞，按常规方法制备，也可参照附录Ｂ．２方法进行。 ４．６．２．２　鸭病毒性肠炎病毒的毒价（犜犆犐犇５０）测定 ４．６．２．２．１　用维持液将病毒进行１０－１～１０－８１０倍系列稀释，稀释时，每个稀释度需更换一支吸头。 ８ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ４．６．２．２．２　将已长满细胞单层的细胞培养板内的细胞培养液吸去。 ４．６．２．２．３　将稀释好的病毒液分别移入细胞培养板内的１～８纵列，每个病毒稀释度加入一个纵列 （８孔），每孔１００μＬ。第８～１２列不加病毒液作为正常细胞对照。在移入病毒时每个稀释度要更换吸 头（如果是从病毒的低浓度向高浓度方向加，可不更换吸头）。然后所有加入病毒液孔补加１００μＬ细胞 维持液，第８～１２列直接加入２００μＬ细胞维持液。 ４．６．２．２．４　置含５％二氧化碳培养箱３７℃培养。２４ｈ后开始记录细胞病变（ＣＰＥ）情况，以后每天观 察一次，记录病变（ＣＰＥ）孔数。 ４．６．２．２．５　根据ＲｅｅｄＭｕｅｎｃｈ的方法计算出病毒的ＴＣＩＤ５０，并用细胞维持液配成每１００μＬ含１００个 ＴＣＩＤ５０的病毒液。 ４．６．３　正式试验 ４．６．３．１　将灭活的阳性对照血清、阴性对照血清、被检血清于９６孔板细胞培养板中进行２倍系列稀 释，共进行８个滴度稀释（即１∶２５６），血清样品每个滴度重复４个孔。见表４。 表４　中和试验加样示意图 样品 列 孔号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ 样１ Ａ １∶２ １∶４ １∶８ １∶１６ １∶３２ １∶６４ １∶１２８１∶２５６ １００ ＴＣＩＤ５０ １０ ＴＣＩＤ５０ １ ＴＣＩＤ５０ ０．１ ＴＣＩＤ５０ Ｂ １００ ＴＣＩＤ５０ １０ ＴＣＩＤ５０ １ ＴＣＩＤ５０ ０．１ ＴＣＩＤ５０ Ｃ １００ ＴＣＩＤ５０ １０ ＴＣＩＤ５０ １ ＴＣＩＤ５０ ０．１ ＴＣＩＤ５０ Ｄ １００ ＴＣＩＤ５０ １０ ＴＣＩＤ５０ １ ＴＣＩＤ５０ ０．１ ＴＣＩＤ５０ 样２ Ｅ １∶２ １∶４ １∶８ １∶１６ １∶３２ １∶６４ １∶１２８１∶２５６ Ｆ Ｇ Ｈ ４．６．３．２　将已配好的１００个ＴＣＩＤ５０的病毒液按等量（１００μＬ＋１００μＬ）加入稀释好的样品孔。 ４．６．３．３　于９６孔培养板上第９～１２列的Ａ９～Ｄ１２孔中对１００ＴＣＩＤ５０的病毒液作１０倍梯度稀释，直 至０．１ＴＣＩＤ５０。 ４．６．３．４　Ｅ９～Ｈ１２孔中加入维持液２００μＬ，作细胞对照。 ４．６．３．５　将如表４所示将加好样品的９６孔板，加盖后，置于含５％二氧化碳的３７℃培养箱中感作 １ｈ～１．５ｈ。 ４．６．３．６　将长满细胞单层的细胞板中的液体吸弃干净。 ４．６．３．７　感作后吸取板中的各孔液体（１００μＬ）对应加入已长满细胞单层的细胞板中，每孔再补加 １００μＬ细胞维持液，使包括对照孔在内的所有孔中液体总量均为２００μＬ。 ４．６．３．８　加盖后，置于含５％二氧化碳的３７℃培养箱中培养。 ４．６．３．９　２４ｈ后在倒置显微镜下观察细胞病变（ＣＰＥ），以后逐日观察，并做好相应记录。 ９ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ４．６．４　结果判定 ４．６．４．１　判定条件 当细胞对照细胞正常：阴性血清对照孔在１∶２以上的各孔细胞都出现ＣＰＥ；阳性血清对照孔应呈 现原有的抗体效价，或误差在原有效价±１个对数值以内；病毒回归于１００ＴＣＩＤ５０孔均出现ＣＰＥ，１０ ＴＣＩＤ５０至少有一半孔出现ＣＰＥ，１ＴＣＩＤ５０有个别孔出现ＣＰＥ或不出现ＣＰＥ，０．１ＴＣＩＤ５０各孔均不出现 ＣＰＥ时，整个试验才有效，方可进行结果判定。 ４．６．４．２　判定标准 ４．６．４．２．１　被检血清在１∶８（含１∶８）以上稀释度的细胞孔都没有细胞病变，则判为血清抗体阳性。 ４．６．４．２．２　被检血清在１∶４稀释度的细胞孔中有一半出现细胞病变或１∶８以上稀释度有个别孔同 出现ＣＰＥ，则该样品暂判为可疑，需重新试验，再次出现可疑结果，将判为血清抗体阴性。 ４．６．４．２．３　被检血清在１∶２以上稀释度的各个细胞孔都出现细胞病变，则为血清抗体阴性。 ４．７　间接酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃） ４．７．１　设备和器械 ４．７．１．１　酶标仪：具有４５０ｎｍ波长滤光片。 ４．７．１．２　其他器械：９６孔酶标板，单道与多道可调微量移液器加样吸头，３７℃恒温箱，振荡器，贮液广 口瓶，刻度量筒，吸管等。 ４．７．２　试剂 所有化学试剂均为分析纯。 ４．７．２．１　ＤＥＶ病毒纯化抗原（由指定单位提供）或者包被好的ＥＬＩＳＡ板。 ４．７．２．２　鸭瘟标准阳性血清与鸭瘟标准阴性血清：由指定单位提供。 ４．７．２．３　被检血清：无溶血、无污染。 ４．７．２．４　过氧化物酶标记的兔抗鸭ＩｇＧ，按指定工作浓度使用。 ４．７．３　溶液 各种溶液见附录Ａ．７～Ａ．１３。 ４．７．４　操作步骤 ４．７．４．１　包被酶标板：按照提供的包被抗原所要求的稀释倍数，用包被液稀释后包被９６孔酶标板，每 孔１００μＬ，置４℃冰箱中过夜。或使用已经包被好的９６孔酶标板。 ４．７．４．２　洗涤：取出酶标板，甩掉孔中液体，用八道移液器于每孔加３００μＬ洗涤液，静置２ｍｉｎ～ ３ｍｉｎ，甩去孔中液体，重复２次，最后于滤纸上拍干。 ４．７．４．３　封闭：每孔加满封闭剂（０．３％明胶与１％ＢＳＡ的ＰＢＳＴ），置３７℃恒温箱６０ｍｉｎ。 ４．７．４．４　洗涤：具体方法同４．７．４．２。 ４．７．４．５　加样： ａ）　将标准阳性血清、标准阴性血清、及待检血清分别用稀释液作１∶１０稀释； ｂ）　阳性血清、标准阴性血清及待检血清样品均应做重复样品，分别加入对应孔，每孔１００μＬ； ｃ）　加样完毕后，轻轻振荡使其均匀分布，将板放入３７℃恒温箱６０ｍｉｎ。 ４．７．４．６　洗涤，具体方法同４．７．４．２。 ０１ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ４．７．４．７　加酶标二抗：将预先稀释至工作浓度的酶标兔抗鸭ＩｇＧ分别加入各孔，每孔１００μＬ。放入 ３７℃恒温箱中作用６０ｍｉｎ。 ４．７．４．８　洗涤：具体方法同４．７．４．２。 ４．７．４．９　加底物：底物溶液需现用现配，每孔加入１００μＬ，置室温避光作用１５ｍｉｎ。 ４．７．４．１０　加终止液：每孔加入１００μＬ终止液，在３０ｍｉｎ内测定ＯＤ４５０ｎｍ值。 ４．７．５　结果判定 ４．７．５．１　判定条件 只有当阳性血清平均ＯＤ值大于１．５，阴性血清平均ＯＤ值小于０．２时，试验成立可进行结果判定； 否则，重新试验。 ４．７．５．２　计算犘／犖值 犘／犖 值计算见式（１）： 犘／犖＝（待检血清平均 ＯＤ值－空白对照平均 ＯＤ值）／ （ＯＤ阴性血清平均 ＯＤ值－空白对照平均 ＯＤ值） …………（１） ４．７．５．３　判定标准 犘／犖≥２．１时，判为待检血清鸭瘟抗体阳性。 １．５≤犘／犖＜２．１时，判为可疑。对可疑样品应重检一次，重检后犘／犖 仍大于１．５，判为待检血清 鸭瘟抗体阳性，若小于１．５，判为待检血清鸭瘟抗体阴性。 犘／犖＜１．５时，判为待检血清鸭瘟抗体阴性。 １１ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犃 （规范性附录） 试 剂 配 制 犃．１　犈犇犜犃胰酶分散液（１０倍贮存液） 胰酶 ２．５ｇ 氯化钠 ４０．０ｇ 氯化钾 ２．０ｇ 葡萄糖 ５．０ｇ 碳酸氢钠 ２．９ｇ ＥＤＴＡ １．０ｇ 上述成分依次先溶于４５０ｍＬ三馏水中，务使液体完全清亮，再定容至５００ｍＬ，用０．２２μｍ滤膜或 Ｇ６玻璃滤器滤过除菌，分装后保存于－２０℃。使用时用三馏水１０倍稀释，适量分装。 犃．２　细胞生长液 含１％双抗溶液（终浓度１００ＩＵ／ｍＬ青霉素和１００μｇ／ｍＬ链霉素）、１０％小牛血清、０．０３％谷氨酰 胺 ＭＥＭ，用７．５％碳酸氢钠溶液调节ｐＨ值至７．０～７．２。 犃．３　细胞维持液 含１％双抗溶液（终浓度１００ＩＵ／ｍＬ青霉素和１００μｇ／ｍＬ链霉素）、２％小牛血清、０．０３％谷氨酰胺 ＭＥＭ，用７．５％碳酸氢钠调节ｐＨ值至７．０～７．２。 犃．４　双抗液 １００万单位青霉素Ｇ和１００万微克链霉素溶解于１００ｍＬ三蒸水中，使每毫升含有１万单位青霉 素Ｇ和１万微克链霉素。 犃．５　０．０１犿狅犾／犔狆犎７．４犘犅犛 磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ） ２．９０ｇ 磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４） ０．２０ｇ 氯化钠（ＮａＣｌ） ８．０ｇ 氯化钾（ＫＣｌ） ０．２０ｇ 加蒸馏水至１０００ｍＬ，分装，１２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ，４℃保存。 犃．６　磷酸甘油封片溶液 甘油（分析纯） ９ｍＬ ２１ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ １ｍＬ 犃．７　包被液（０．０５犿狅犾／犔，狆犎９．６的碳酸盐缓冲液） 碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３） １．４６ｇ 无水碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３） ０．９７ｇ（或Ｎａ２ＣＯ３·１０Ｈ２Ｏ１．２ｇ） 去离子水或蒸馏水 ５００ｍＬ 犃．８　洗涤液（０．０１犿狅犾／犔，狆犎７．４的犘犅犛犜） 氯化钠（ＮａＣｌ） ８．０ｇ 磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４） ０．２ｇ 磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ） ２．９ｇ 氯化钾（ＫＣｌ） ０．２ｇ 吐温２０ ０．５ｍＬ 去离子水或蒸馏水 １０００ｍＬ １２１℃高压灭菌３０ｍｉｎ后，可保存１月。 犃．９　稀释液 ０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４的ＰＢＳ中加入牛血清白蛋白，使其浓度终含量为０．１％。 氯化钠（ＮａＣｌ） ８．０ｇ 磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４） ０．２ｇ 磷酸氢二纳（Ｎａ２ＨＰＯ４） ２．９ｇ 氯化钾（ＫＣｌ） ０．２ｇ 牛血清白蛋白 １．０ｇ 去离子水或蒸馏水 １０００ｍＬ 保存于２℃～８℃不超过１周，最好随配随用。 犃．１０　封闭液 牛血清白蛋白（ＢＳＡ） ２．０ｇ 明胶 ０．６ｇ ＰＢＳＴ ２００ｍＬ 先用适量ＰＢＳＴ将明胶加热融化，待冷却至５０℃以下时，加入称好的牛血清白蛋白（ＢＳＡ），并定容 至２００ｍＬ，保存于２℃～８℃。 犃．１１　狆犎５．０磷酸盐柠檬酸盐缓冲液 犃．１１．１　０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸：柠檬酸２１．０ｇ溶于１０００ｍＬ蒸馏水中。 犃．１１．２　０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）：磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）２７１．６ｇ溶于１０００ｍＬ 水中。 犃．１１．３　取Ａ．１１．１液２４．３０ｍＬ＋Ａ．１１．２液２５．７０ｍＬ即为ｐＨ５．０的磷酸盐柠檬酸盐缓冲液。 ３１ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 犃．１２　底物溶液：３，３，４，４四甲基联苯胺（犜犕犅）犎２犗２ Ａ．１１缓冲液 ９．９ｍＬ １％ＴＭＢ ０．１ｍＬ ３０％Ｈ２Ｏ２ １．０μＬ 临用时新鲜配制，配后立即使用。 犃．１３　终止液（２犿狅犾／犔硫酸） 浓硫酸（分析纯） ２２．２ｍＬ 蒸馏水 １７７．８ｍＬ ４１ 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犅 （资料性附录） 原代细胞制备方法 犅．１　鸭胚成纤维细胞（犇犈犉）的制备方法 取１０日龄～１４日龄鸭胚，用２％碘酊和７５％酒精消毒蛋壳表面，打开气室，无菌取出鸭胚，置灭菌 平皿内，去头、颈、腿、爪，剔除内脏，放入无血清培养液中洗涤，尽可能除去血液和其他不必要的组织，然 后将其转入小青瓶（或小烧瓶）内剪碎，加入２倍～３倍于组织碎块量的胰酶消化液洗一次，再加入 ３倍～５倍于组织量的胰酶消化液，于室温消化约１０ｍｉｎ～２０ｍｉｎ，间或观察，轻轻转动，待组织块消化 粘连成一团不散开，吸弃胰酶消化液，沿容器壁慢慢加入与胰酶等量的营养液，洗两次去掉剩余胰酶，然 后吸弃，再次加入适量的无血清细胞生长液轻轻吹打，使其完全分散（使肉眼看不到组织碎块为止），经 双层纱布过滤，若细胞浓度较低，可移入刻度离心管，以１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取细胞泥加入适量营 养液后，经Ｎｅｕｂａｕｅｒ计数板计数后稀释成细胞浓度约为８０万／ｍＬ的悬液，移入２４孔细胞培养板，每 孔１．０ｍＬ，加盖后置含５％二氧化碳培养箱３７℃培养。约２４ｈ长成细胞单层。 犅．２　原代鸭胚肾细胞（犇犈犓）的制备方法 取１９日龄～２１日龄的种鸭胚，用２％碘酊和７５％酒精消毒蛋壳表面，打开气室，无菌取出鸭胚，置 灭菌平皿内，剖开胚体腹部，充分暴露肾脏，用眼科剪刀轻轻从嵌骨部位进行剥离，摘取全部肾脏，放入 无血清培养液中洗涤，尽可能除去血液和其他不必要的组织，然后将其转入小青瓶（或小烧杯）内，充分 剪碎，加入２倍～３倍于组织碎块量的胰酶消化液洗一次，再加入３倍～５倍于组织碎块量的胰酶消化 液，于室温消化约１０ｍｉｎ，间或观察，轻轻转动，待组织块消化粘连成一团不散开，吸弃胰酶消化液，沿 容器壁慢慢加入与胰酶等量的营养液，清洗２次，洗掉剩余胰酶，然后吸弃，再次加入适量的营养液轻轻 吹打，使其完全分散（使肉眼看不到组织碎块为止），经双层纱布过滤后，若细胞浓度较低，可移入刻度离 心管，以１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取细胞泥加入适量营养液后，经Ｎｅｕｂａｕｅｒ计数板计数后稀释成细胞 浓度约为８．０×１０５ 个／ｍＬ的悬液，加入９６孔细胞培养板，每孔０．１ｍＬ，每孔补加１００μＬ营养液，加盖 后置含５％二氧化碳培养箱３７℃培养。约２４ｈ长成细胞单层。 犛犖／犜２７４４—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 ０１０２— ４４７２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 鸭病毒性肠炎检疫技术规范 ＳＮ／Ｔ２７４４—２０１０  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 １．２５　字数 ３０ 千字 ２０１１年４月第一版　２０１１年４月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２１６６２　定价 ２１．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售