SNT 2709-2010 国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 !" ! #!"#$ " !#%# 国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法 $%&%'&()*)+!"#$%&'(')* + ,& - &'. / ,.$&),(*-.&+/)*&(%/ 0 )/& !#%#1%%1#% 发布 !#%%1#&1#% 实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：相大鹏、师永霞、林继灿、李小波、陈永红、洪烨、黄吉城、郑夔、幸芦琴、郭波旋、 钟玉清。 Ⅰ 犛犖／犜２７０９—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法 １　范围 本标准规定了产气荚膜梭菌食物中毒样品的采集和运送、产气荚膜梭菌的分离培养、产气荚膜 梭菌肠毒素的检测、产气荚膜梭菌α、β和肠毒素基因的ＰＣＲ检测及多重ＰＣＲ检测以及生物安全 要求。 本标准适用于国境口岸入出境人员以及国境口岸食品生产经营和服务单位从业人员的产气荚膜梭 菌食物中毒，同时也适用于国境口岸范围的水、食物、食物中毒样品的产气荚膜梭菌毒素检测。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ／Ｔ４７８９．１３　食品卫生微生物学检验　产气荚膜梭菌检验 ＧＢ／Ｔ４７８９．２８　食品卫生微生物学检验　染色法、培养基和试剂 ＳＮ０１７７　出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法 ＷＳ／Ｔ７　产气荚膜梭菌食物中毒诊断标准及处理原则 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ３．１ 产气荚膜梭菌　犆犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿狆犲狉犳狉犻狀犵犲狀狊 是一种革兰氏阳性、产生芽孢、严格厌氧及形成特殊荚膜的梭状杆菌。广泛分布于自然界的水源、 土壤中及存在于人和动物肠道中，可以引起人和动物坏死性肠炎、肠毒血症以及人畜创伤性气性坏疽， 特别是引起严重的食物中毒。 ３．２ 产气荚膜梭菌毒素　犆犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿狆犲狉犳狉犻狀犵犲狀狊狋狅狓犻狀狊 产气荚膜梭菌主要产生α、β、ε、τ外毒素和肠毒素ＣＰＥ。根据该菌产生致死性α、β、ε、τ外毒素的能 力不同，可以分为Ａ～Ｅ共５种菌型，其中对人致病的主要是Ａ型（产生α毒素，部分菌株还产生肠毒素 ＣＰＥ），也有少数为Ｃ型（产生α毒素和β毒素），主要引起人的食物中毒和坏死性肠炎，甚至可以引起肠 毒血症，造成人的死亡。 ４　试剂和材料 ４．１　主要仪器 ４．１．１　ＰＣＲ扩增仪。 ４．１．２　天平。 ４．１．３　超净工作台。 １ 犛犖／犜２７０９—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ４．１．４　高压灭菌锅。 ４．１．５　低温高速离心机：最大离心力２００００犵。 ４．１．６　电泳仪。 ４．１．７　凝胶成像分析系统。 ４．１．８　旋涡振荡器。 ４．１．９　冰箱：４℃和－２０℃。 ４．１．１０　移液器：１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ和１ｍＬ。 ４．１．１１　恒温水浴锅。 ４．１．１２　恒温培养箱：３７℃±２℃。 ４．１．１３　厌氧培养装置。 ４．２　主要试剂 ４．２．１　除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。 ４．２．２　犜犪狇ＤＮＡ聚合酶１）。 ４．２．３　产气荚膜梭菌肠毒素ＥＬＩＳＡ检测试剂盒（美国ＴＥＣＨＬＡＢ公司）２）。 ４．２．４　其他试剂参见附录Ａ。 ５　生物安全要求 ５．１　样品的病原菌分离纯化、生化鉴定、涂片、显微观察、免疫学实验、ＰＣＲ扩增制备等含有致病 性活菌的初步检测活动需在生物安全二级实验室（ＢＳＬ２）进行。 ５．２　家兔肠袢试验需在动物生物安全二级实验室（ＡＢＳＬ２）进行。 ５．３　不含致病性活菌材料的ＰＣＲ操作和免疫学等实验需在生物安全一级实验室（ＢＳＬ１）进行。 ６　样品的采集和运送 ６．１　样品的采集 ６．１．１　患者粪便标本的采集 用灭菌竹签或吸管等工具采取腹泻患者粪便２ｍＬ，置于灭菌试管或盛有生理盐水的试管中。采不 到粪便的人员可用肛拭采取。 ６．１．２　可疑食物标本的采集 一般采用灭菌食品夹子或铲子等工具采取剩余食物，采取的标本可置于灭菌容器中。固体食物 ２００ｇ～５００ｇ；液体食物２００ｍＬ～５００ｍＬ。饮料、饮用水等液体样品，定性包装的可整体采取，散装的可 置于罐（瓶）中。 ６．１．３　食品加工用具、容器面涂抹物等标本的采集 饮食用锅、刀、抹布、砧板、盛放器具等加工用具可用粘取少量灭菌生理盐水的灭菌棉拭涂抹容器内 壁，其他用具可涂抹与食品接触的表面，涂抹完毕将棉拭置于装有生理盐水的试管中。 １）、２）　由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产 品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 ２ 犛犖／犜２７０９—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ６．２　样品的运送 采集的样品应在冷藏条件下，４ｈ内送达实验室检测；无冷藏条件的，于采样后２ｈ内送达实验室。 ７　产气荚膜梭菌的分离培养 具体方法见ＧＢ／Ｔ４７８９．１３和ＳＮ０１７７。 ８　产气荚膜梭菌肠毒素的检测 ８．１　肠毒素的提取 由粪便提取肠毒素时，用生理盐水将粪便制成１０倍稀释乳悬液，充分搅拌，室温放置３０ｍｉｎ，４℃ １２０００犵离心２０ｍｉｎ，吸取上清液进行检测试验。 分离的菌株经庖肉培养基（ＣＭ）３７℃培养２４ｈ作为原始菌种。按１％（体积分数）接种原始菌种于 液体硫乙醇酸钠培养基（ＦＴ），７５℃热处理２０ｍｉｎ以促进芽孢的形成，冷却后３７℃培养１８ｈ（若此培养 芽孢形成不多，上述处理及培养可反复１次～２次），然后仍按１％（体积分数）转种于ＦＴ培养基，３７℃ 培养８ｈ，作为产毒种子，按０．５％～１．０％（体积分数）接种于产芽孢培养基（ＤＳ），４６℃保温２０ｍｉｎ，立 即转换３７℃培养２４ｈ～３０ｈ，培养液经４℃１２０００犵离心２０ｍｉｎ，吸取上清液进行检测试验。 ８．２　肠毒素的检测 ８．２．１　家兔肠袢试验（标准方法） 准备体重约２ｋｇ的健康家兔，术前断食２天（只给饮水），在麻醉下剖腹取出回肠段，在盲肠以上 ６ｃｍ～８ｃｍ处开始结扎，每个肠袢长８ｃｍ～１０ｃｍ，每两个试验袢之间有一个间隔袢，间隔袢长２ｃｍ～ ４ｃｍ，至多６段，分别注入检样液、阴性对照液（生理盐水）、阳性对照液（产气荚膜梭菌肠毒素或产肠毒 素的产气荚膜梭菌标准菌株的ＤＳ培养上清液）及中和对照（检样液与产气荚膜梭菌肠毒素免疫血清混 合，室温放置４５ｍｉｎ）各２ｍＬ（中和对照液可增加血清所占容量），以生理盐水润湿肠子表面，将肠袢送 回腹腔，缝合。１８ｈ后开腹测量各段肠袢的长度犔（ｃｍ）与肠袢中积液的体积犞（ｍＬ）。检样及阳性对照 肠段的内液量与长度之比值（犞／犔）大于或等于１．０，而阴性对照及中和对照小于１．０或肉眼观察不到明 显反应时，判为阳性结果。 ８．２．２　反向间接血球凝集试验（辅助方法） 上清液于微孔板Ｕ型孔内以树胶缓冲液或蛋白缓冲液进行系列稀释，各孔稀释液２５μＬ，加以相同 缓冲液稀释的１％致敏血球２５μＬ。以检样加非致敏血球为阴性对照，以精制产气荚膜梭菌肠毒素加致 敏血球为阳性对照。充分摇和后室温静放２ｈ，出现明显凝集者判为阳性结果。 若阴性对照孔出现凝集，检样可加等量的１０％非致敏血球，充分摇和，室温放置３０ｍｉｎ，１２０００犵离 心１０ｍｉｎ，取上清液按前述方法进行试验。 ８．２．３　琼脂双扩散试验 生理盐水配制的１％琼脂糖，溶化后取３ｍＬ浇注于２５ｍｍ×７５ｍｍ载玻片上。凝固后打孔，孔径 ３ｍｍ，中心孔与周围各孔间隔２ｍｍ～３ｍｍ。中心孔加入适当稀释的抗血清，周围孔加用ＰＢＳ稀释的 不同稀释度的检样，加样后，将琼脂板放入湿盒，置３７℃１２ｈ～２４ｈ，观察结果。在检样孔与适当稀释 度的抗血清孔间有白色的沉淀线出现者判为阳性结果。 ３ 犛犖／犜２７０９—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 ８．２．４　粪便标本肠毒素的酶联免疫试验（犈犔犐犛犃） 可选用商品化试剂盒进行操作，以下为按照美国ＴＥＣＨＬＡＢ公司试剂盒的操作步骤： ａ）　检测前将试剂盒中的所有成分平衡至室温； ｂ） 样品稀释：将５０μＬ的液体粪便标本加至２００μＬ的样品稀释液中，涡旋１０ｓ，置于２℃～８℃ 冰箱待用。加样到微孔板之前再涡旋混匀； ｃ） 至少准备３个微孔：１孔为样品孔、１孔为阴性质控、１孔为阳性质控。在每孔内加入５０μＬ结 合物； ｄ） 在样品孔中加入１００μＬ稀释的粪便样品，分别在阳性孔和阴性孔中加入５０μＬ质控。用试剂 盒内的盖板盖好。３７℃±２℃孵育２ｈ； ｅ） 孵育后，移去盖板，甩干孵育液，使用３００μＬ洗液洗涤所有的微孔４次。每次浸泡至少５ｓ。 最后将微孔板置于纸巾上，小心轻敲使孔中不再含液体； ｆ） 分别在所有微孔中加入１００μＬＴＭＢ底物液。室温下暗处孵育１５ｍｉｎ； ｇ） 分别在所有孔中加入５０μＬ终止液，孵育产生的蓝色变成黄色； ｈ） 加入终止液２ｍｉｎ后，在１０ｍｉｎ内读取４５０ｎｍ处吸光度值（ＯＤ）； ｉ） 为了确认实验有效，结果应符合如下标准： ———阴性质控：ＯＤ４５０＜０．１２０或ＯＤ４５０／６２０、ＯＤ４５０／５５０＜０．０８０； ———阳性质控：ＯＤ４５０或ＯＤ４５０／６２０或ＯＤ４５０／５５０≥０．５００； ｊ） 结果判断如下： ———ＯＤ４５０≥０．１２０或ＯＤ４５０／６２０或ＯＤ４５０／５５０≥０．０８０的样本为阳性； ———ＯＤ４５０＜０．１２０或ＯＤ４５０／６２０或ＯＤ４５０／５５０＜０．０８０的样本为阴性。 ９　产气荚膜梭菌α、β和肠毒素基因的犘犆犚检测及多重犘犆犚检测 ９．１　犘犆犚扩增模板的制备 挑取产气荚膜梭菌单菌落至２００μＬ的无菌水中，涡旋混匀，沸水浴作用１０ｍｉｎ，经１２０００犵离心后 取１０μＬ上清液作为ＰＣＲ扩增的模板。 ９．２　犘犆犚扩增 ９．２．１　毒素基因的犘犆犚引物 α毒素基因的 ＰＣＲ 扩增引物：５’ＧＣＴＡＡＴＧＴＴＡＣＴＧＣＣＧＴＴＧＡ３’和 ５’ＣＣＴＣＴＧＡＴＡ ＣＡＴＣＧＴＧＴＡＡＧ３’，预计扩增片断大小为３２４ｂｐ；β毒素基因的ＰＣＲ扩增引物：５’ＧＣＧＡＡＴＡＴ ＧＣＴＧＡＡＴＣＡＴＣＴＡ３’和５’ＧＣＡＧＧＡＡＣＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＣＴＴＣ３’，预计扩增片断大小为１９６ｂｐ； 肠毒素基因的ＰＣＲ扩增引物：５’ＧＧＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＡＴＡＴＴＡＧＧ３’和５’ＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＧ ＴＡＧＡＴＡ３’，预计扩增片断大小为２３３ｂｐ。 ９．２．２　犘犆犚扩增体系 取ＰＣＲ管编号，ＰＣＲ反应体积为５０μＬ，具体反应体系见表１。检测过程设立阴性对照、阳性对照 和空白对照，用Ａ型（含肠毒素）和Ｃ型产气荚膜梭菌标准菌株的裂解液上清液作阳性对照模板，用非 产气荚膜梭菌的细菌作阴性对照，用水作空白对照模板。反应程序为：９４℃／２ｍｉｎ；然后９４℃／１ｍｉｎ、 ５５℃／１ｍｉｎ、７２℃／１ｍｉｎ，３５个循环；最后７２℃延伸７ｍｉｎ。 ４ 犛犖／犜２７０９—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 表１　犘犆犚反应体系 试剂名称 储备液浓度 加入反应体系的体积／μＬ １０×ＰＣＲ缓冲液（Ｍｇ２＋） １００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，１５ｍｍｏｌ／Ｌ 氯化镁，５００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾，ｐＨ８．３（２０℃） ５ ｄＮＴＰｓ １０ｍｍｏｌ／Ｌ １ α毒素基因引物 １０μｍｏｌ／Ｌ 上、下游引物各１ β毒素基因引物 １０μｍｏｌ／Ｌ 上、下游引物各１ 肠毒素基因引物 １０μｍｏｌ／Ｌ 上、下游引物各１ 多重ＰＣＲ引物 １０μｍｏｌ／Ｌ α毒素基因上、下游引物各１ β毒素基因上、下游引物各１ 肠毒素基因上、下游引物各１ 犜犪狇酶 ５Ｕ／μＬ ０．２５ 模板 — １０ ｄｄＨ２Ｏ — ３１．７５（单基因ＰＣＲ）或 ２７．７５（多重ＰＣＲ） 　　注：反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整。 ９．２．３　犘犆犚扩增产物电泳检测 取１．５ｇ琼脂糖，加入１００ｍＬ电泳缓冲液加热溶解，加入溴化乙锭至终浓度０．５μｇ／ｍＬ，制胶，取 １０μＬ的ＰＣＲ扩增产物与适量的ＤＮＡ上样缓冲液混合，点样，同时加入ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ，１００Ｖ 恒压，电泳３０ｍｉｎ左右，用凝胶成像系统照相结果。 ９．３　结果判断 ９．３．１　质量控制 反应结果应同时符合以下３个条件，否则实验结果无效： ａ）　阴性对照和空白对照未出现特异性条带； ｂ） Ａ型产气荚膜梭菌阳性对照出现３２４ｂｐ的α毒素和２３３ｂｐ的肠毒素扩增带； ｃ） Ｃ型产气荚膜梭菌阳性对照出现３２４ｂｐ的α毒素和１９６ｂｐ的β毒素扩增带。 ９．３．２　结果分析 在实验结果有效情况下，如待测样品出现预期大小的扩增条带，则可初步判断产气荚膜梭菌中含有 对应的毒素基因，初步判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认。如待测样品中未 出现预期大小的扩增产物，则可判断产气荚膜梭菌中不含有对应的毒素基因。 ９．４　测序（可选择） 将ＰＣＲ扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成并与已经发表的毒素基因的序列进行比对，判断 产气荚膜梭菌中是否含有α、β或肠毒素基因。 ５ 犛犖／犜２７０９—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 附　录　犃 （资料性附录） 试剂的配制 犃．１　电泳缓冲液（ＴＡＥ）：称取２４２ｇＴｒｉｓ碱，溶于７００ｍＬ的ｄｄＨ２Ｏ中，加入１００ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤ ＴＡ（ｐＨ８．０），５７．１ｍＬ冰乙酸，至充分溶解后用水定容至１Ｌ，室温储存。 犃．２　树胶缓冲液：０．５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲盐水（ｐＨ７．２）含吐温８００．１％、阿拉伯胶０．０１％。 犃．３　蛋白缓冲液：０．１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲盐水（ｐＨ７．２）含牛血清蛋白０．２５％。 犃．４　庖肉培养基（ＣＭ）和液体硫乙醇酸钠培养基（ＦＴ）：制法见ＧＢ／Ｔ４７８９．２８。 犃．５　芽孢培养基（ＤＳ）：制法见 ＷＳ／Ｔ７。 ６ 犛犖／犜２７０９—２０１０ 版权所有 · 禁止翻制、电子发售 书书书 ０１０２— ９０７２ 犜／ 犖犛 中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法 ＳＮ／Ｔ２７０９—２０１０  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京复兴门外三里河北街１６号 邮政编码：１０００４５ 网址 ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ 电话：６８５２３９４６　６８５１７５４８ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本 ８８０×１２３０ １／１６　印张 ０．７５　字数 １２ 千字 ２０１１年４月第一版　２０１１年４月第一次印刷 印数１—１６００  书号：１５５０６６·２２１８０４　定价 １６．００ 元 版权所有 · 禁止翻制、电子发售