急性B淋巴细胞白血病动物模型的建立

收稿日期: 2007-07-18　修回日期: 2008-07-16 基金项目: 国家自然科学基金(编号: 30170391) ; 浙江省自然科学基金重点项目 (编号: Z205166) , 面上项目(编号: 301570) . 作者简介: 李丽霞( 1982- ) ,女,硕士研究生,主要从事小儿血液肿瘤的研究, 现在绍兴妇幼保健院工作. 通讯作者: 汤永民( 1957- ) ,男,教授,博士生导师; E -mail: Y- M- T ANG@ zju. edu. cn. http:∥w w w . journals. zju. edu. cn/ med DOI: 10. 3785/ j. issn. 1008-9292. 2008. 05. 016 急性B淋巴细胞白血病动物模型的建立 李丽霞,汤永民,顾伟忠,汤宏峰,钱柏芹,沈红强,罗春芳 (浙江大学医学院 附属儿童医院血液肿瘤科, 浙江 杭州 310003) [摘　要]　目的:建立急性B 淋巴细胞系白血病动物模型,为药物进行体内靶向杀伤研究奠定基 础。方法:裸鼠用环磷酰胺预处理后,尾静脉注射5×106个Nalm-6细胞, 观察小鼠症状,发病时 间,取其各个组织做病理检查,了解肿瘤细胞浸润情况。结果:小鼠注射肿瘤细胞( 19. 4±0. 55) d后 出现严重消瘦、脊柱侧弯和弓背症状,平均死亡时间( 24. 75±0. 87) d; 病理切片观察到小鼠骨髓、 肝、脾、肾、脑膜、脑实质、卵巢、肺都有肿瘤细胞浸润,部分肝脾组织出现坏死。结论:采用裸鼠成功 建立了急性B淋巴细胞系白血病的动物模型, 为靶向治疗白血病研究奠定了基础。 [关键词]　白血病, B细胞,急性; 疾病模型,动物; 白血病; 环磷酰胺/药理学 [中图分类号]　R 733. 71　　[文献标识码]　A　　[文章编号]　1008-9292( 2008) 05-0511-04 Establishment of animal model with B lineage acute leukemia in nude mice for evaluation of new therapeutic agents LI Li-xia, T ANG Yong-m in, GU Wei-zhong, T ANG Hong-feng, Q IAN Bai-qin, SHEN Hong -qiang , LU O Chun-fang ( Depar tment of H ematology-Oncology , The Af f i liated Children’s H osp i tal , College of Medicine , Zhej iang Univ ersity , H angz hou 310003, China) [Abstract]　Objective: To establish an acute leukem ia animal model for test ing new therapeut ic agents in vivo. Methods : Nude mice w ere intr aperitoneally injected w ith 2 mg cyclophosphamide, 24 h later 5× 106 acute B-cell leukemia Nalm-6 cells w as inoculated via the tail vein, then monitored daily. When animals w er e paralyzed or dying, the or gans including the liver, spleen, lung , heart , kidney, brain, bone marr ow , pancreas, testes w er e r emoved and f ixed w ith formalin, examined by r out ine histopatholog y. Results: Af ter Nalm-6 cel ls w ere inoculated the mean survival of m ice w ere ( 19. 4±0. 55) d ( n= 6) . T he paralysis of mice w as follow ed by w eight loss, bent spines, hogback, cachexia and death. Histopatholog ical exam inat ion show ed that the tumor cells inf ilt rated liver, spleen, kidney , lung, meninges, interior cerebrum, the liv er and kidney w ere the most af fected o rgans. Conclusion: B lineage acute leukemia animal model has been successfully established in the nude m ice, w hich is suitable for test ing new ther apeut ic agents. 第37卷　第5期 2008年 浙 江 大 学 学 报 ( 医 学 版 ) JOURNAL OF ZHEJIANG UNIVERSIT Y ( M EDICAL SCIENCES) Vol 37　No 5 2008 [ Key words ] 　Leukem ia, B-cel l, acute; Disease models, animal ; Leukemia; Cyclophosphamide / pharmacol [ J Zhejiang U niv ( M edical Sci) , 2008, 37( 5) : 511-514. ] 　　急性白血病是儿童常见的血液系统肿瘤, 急性淋巴细胞白血病 ( ALL )约占 70% , 其中 80%来自B细胞系, 联合化疗是当前主要的治 疗方法。但化疗因具有选择性差、全身毒副作用 大、易诱导药物耐药等缺点。为此,研究者正在 寻找新的治疗方法。其中,靶向治疗具有选择性 杀伤作用强、用量少、全身毒副作用小等优点而 备受关注。然而, 抗体治疗、分子靶向治疗及其 作用机制的前期实验研究均需在动物体内进 行。因此,动物模型的成功建立是药物进行体内 研究的重要环节。裸鼠和SCID小鼠常用于建立 血液系统肿瘤动物模型,裸鼠T 淋巴细胞缺陷, 而 SCID小鼠T、B 淋巴细胞联合缺陷,更容易 移植成功,但是价格昂贵。为此,本研究采用裸 鼠建立白血病动物模型。 1　材料方法 1. 1　细胞株　Nalm-6是急性B淋巴细胞系白 血病细胞株, 用含青霉素100 U/ m l、链霉素100 U /m l、15%灭活新生牛血清的 RPM I-1640完 全培养液,在 37℃含5% CO 2饱和湿度的培养 箱中培养。 1. 2　裸鼠( BALB/ C-nu/ nu )　购于中国科学 院上海试验动物中心, 5～6周龄,雌性, 体重16 g 左右, 饲养于浙江大学医学院附属第一医院 SPF 实验室。所用的水、饲料及垫料均经高压 消毒处理,每隔2～3 d换一次垫料。 1. 3　药物　环磷酰胺( 200 mg/支)为江苏恒 瑞医药股份有限公司产品。 1. 4　急性白血病动物模型的建立　� 用无菌 PBS液将环磷酰胺浓度调整到10 mg / ml, 腹腔 注射环磷酰胺2 mg /只,连续注射2 d; 24 h 后, 收集处于对数生长期的 Nalm-6细胞, 1 000 r/ min 离心5 min后,悬浮于无菌PBS中,调整细 胞密度至2. 5×107个/ ml ,尾静脉注射5×106个 /只( 200 �l)。� 每隔1～2 d 观察小鼠症状,以 后肢出现瘫痪为发病标准, 记录小鼠发病和死 亡日期。 待小鼠濒死时,颈椎脱臼法将其处 死, 立即取小鼠的肝、脾、肺、心脏、肾、肠、脑组 织、骨髓、胰腺、睾丸、卵巢等,经10%中性福尔 马林固定脱水、透明、浸蜡、包埋, 制成石蜡切 片, H-E 染色后在光镜下观察各个组织肿瘤细 胞浸润情况。 1. 5　骨髓片的光镜观察　具体骨髓片的制作 如下:剪掉小鼠大腿上的皮肤和肌肉,暴露股骨 及两端相连的关节,然后从股骨两端关节头处 取下股骨,剪断股骨一端, 用抽有生理盐水的1 m l注射器插入骨髓腔深处,注入 0. 5 ml, 将冲 出的骨髓液滴于洁净的玻片中间, 轻轻晃动使 其均匀铺开,晾干固定。将制得的骨髓片用瑞氏 染色,光镜下观察。 2　结　果 2. 1　裸鼠B系ALL 白血病动物模型　小鼠尾 静脉注射5×106个肿瘤细胞后( 19. 4±0. 55) d 后肢行动迟缓,而且迅速发展为双后肢瘫痪,随 着病情进展, 小鼠严重消瘦, 体重从发病前的 19. 8 g 下降到12. 7 g ,并伴有脊柱侧弯、弓背, 呈恶病质, 直至死亡 (图 1) , 平均死亡时间 ( 24. 75±0. 87) d。 2. 2　Nalm-6细胞光镜观察　骨髓中可观察到 肿瘤细胞, 同时与体外培养的Nalm-6细胞相 比,有相似的形态学特征,细胞大, 核大深染,染 色质疏松,有分裂象(图2)。 2. 3　组织病理结果　与正常小鼠组织切片相 比, 白血病小鼠的肝、脾、肾、脑膜、脑实质、卵 巢、肺都有肿瘤细胞浸润, 细胞呈团块状生长, 形成结节,有的呈弥漫性生长,其中以肝、脾、脑 膜、脑实质浸润最明显,小鼠部分肝脾组织出现 坏死,而心肌、胃、小肠、结肠黏膜下层未发现肿 瘤细胞(图3)。 3　讨　论 急性白血病动物模型的建立有静脉注射、 ·512·　　　 浙江大学学报(医学版) 第 37卷 图1　裸鼠B系ALL 白血病动物模型 Fig. 1　T he nude mice model of B-A LL 　　a: 骨髓中Nalm -6 细 胞; b: 体外培养后的 Nalm -6 细胞 图2　N alm-6细胞 Fig. 2　Nalm-6 cell 　　肿瘤模型小鼠组织内有大量肿瘤细胞浸润(见箭头所示) 图3　小鼠组织病理检查结果(×100倍) Fig. 3　The histopathological examination of each or gan (×100) 皮下注射和腹腔注射等途径 [ 1-2]。小鼠静脉注射 时常采用尾静脉, 鼠尾静脉共有3根,左右两侧 和背部各1根,两侧尾静脉比较容易固定, 故此 法常被采用。本研究也选择通过尾静脉注射肿 瘤细胞来建立全身白血病动物模型。 Nalm-6 是急性人B 淋巴细胞系白血病细 胞株, 在普通的 RMPI-1640培养基中容易生 长,繁殖快,恶性度高, 能引起弥散性疾病, 可移 植入裸鼠或SCID小鼠,被研究者广泛应用。本 研究中,小鼠注射5×106个肿瘤细胞后, 先观察 到小鼠行动迟缓,后肢瘫痪, 然后呈全身性表 现, 如消瘦,脊柱侧弯等, 这与Gunther 制备的 模型有相似之处,同时Gunther 在小鼠的颅骨、 脊柱骨髓和脑膜检测到白血病细胞 [ 3]。本实验 病理切片发现,各个小鼠的脑膜、脑实质内均有 大量白血病细胞浸润, 可见小鼠极易发生中枢 神经系统白血病,这也可能是导致瘫痪的主要 原因。 ·513·第 5期 李丽霞,等.急性B淋巴细胞白血病动物模型的建立 　 　 动物模型是否建立成功的影响因素有许 多,如注射途径、小鼠周龄、注射的肿瘤细胞数 目等。随着小鼠周龄的增长,体内残存的免疫功 能逐渐增强, 模型建立成功率会有所下降。 Ohsug i等 [ 4]用 5、7、9、11 周的 B-17 scid/ scid ( SCID)小鼠建立模型,结果5周龄的小鼠100% 有肿瘤形成, 7周龄小鼠肿瘤形成率为 50% , 9 周龄小鼠为20% , 11周龄的小鼠没有大体肿瘤 形成,所以随着小鼠周龄的增加,肿瘤形成率明 显下降,而且器官浸润阳性率也明显下降, 因此 小鼠周龄对模型是否建立成功有重要影响。 白血病小鼠的发病时间不仅与小鼠周龄有 关,也与注射的肿瘤细胞数目有密切关系, 但与 雌雄关系不大。Gunther 用 6周龄的 SCID 小 鼠, 每只注射1×106个 Nalm-6细胞, 平均32 d 后肢行动迟缓, 39 d 瘫痪; Uckun 用6～7周龄 的雌性SCID小鼠[ 5] , 每只注射1×106个Nalm-6 细胞, 有56%的小鼠平均 33 d 发生瘫痪, 39 d 全部死亡, 两研究小鼠发病时间相似; Her rer a 用 10～13周龄的SCID 小鼠[ 6] ,注射5×106个 Nalm-6细胞后平均36 d发病。本研究采用5～ 6周的裸鼠,每只注射5×106个Nalm-6细胞,平 均20 d发病,模型建立成功率100%,但是发病 时间比上述报道早, 可能是由于使用的小鼠周 龄小,注射肿瘤细胞数目多,进入小鼠体内后生 长繁殖较快, 导致小鼠发病较早。 本研究通过制备小鼠组织病理切片, H-E 染色后观察小鼠各个组织脏器中肿瘤细胞的浸 润情况,为模型是否建立成功提供依据。Uckun 建立的Pre-B 急淋动物模型病理结果显示[ 5] : 小鼠髓腔里正常的造血细胞已由CD45+ HLA -DR+ 的人白血病细胞所代替,脾红髓和血窦 中充满白血病细胞, 肝脏白血病细胞弥散性浸 润,有实质性白血病结节,卵巢、膀胱壁、胃黏膜 下层、结肠黏膜下层都可发现白血病细胞; 白血 病细胞广泛浸润蛛网膜下腔、脑血管周V-R间 隙、脊髓、脑膜。Her rer a等 [ 6]用 PCR法检测小 鼠的脑、骨髓、肝、脾、心、肺、睾丸、肾均有肿瘤 细胞浸润。本研究动物模型病理结果显示: 白血 病细胞广泛浸润脑膜、脑实质、肝、脾、肾组织, 卵巢、肺也有浸润, 部分小鼠的肝脾坏死, 但心 肌、胃黏膜,小肠、结肠黏膜、肾上腺中均未发现 白血病细胞, 这与U ckun报道的浸润范围有相 似之处[ 5] ,但是本研究中,小鼠的胃、小肠、结肠 黏膜下层均未发现肿瘤细胞, 原因不明,有待于 进一步研究。 Ref erences: [ 1]　VALLERA DA , TODHUNTER DA , KUROKI DW, et al. A bispecific recombinant immuno- to xin, DT 2219, tar g eting human CD19 and CD22 recepto rs in mouse xenog raft model o f B-cell leukemia / lymphoma [ J] .Clin Cancer Res, 2005, 11( 10) : 3879-3888. [ 2]　DEMEHRI S, CORBIN A , LORIAU X M, et al. Establishment o f a m ur ine model o f ag gr essive systemic mastocy tosis/ mast cell leukemia [ J] . Exp Hematol, 2006, 34( 3) : 284-288. [ 3]　GU NT HER R, CHELSTROM LM , T UEL- AHLGREN L , et al. Bio therapy for x enog raft ed hum an central ner vous system leukemia in mice w ith severe combined immunodeficiency using B 43 ( ant i-CD19 ) -pokeweed antiv ir al pro tein immunot ox in [ J ] . Blood, 1995, 85 ( 9 ) : 2537- 2545. [ 4]　OHSUGI T , YAM AGUCHI K , KUMASAKA T , et al. Rapid tumor death model fo r ev aluat ion of new therapeutic agents fo r adult T -cell leukemia [ J] . Lab Invest, 2004, 84( 2) : 263-266. [ 5]　UCKUN F M , MANIVEL C, ART HUR D, et al. 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