抗体纯化问题

用 户 园 地 Q & A 30 鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相 互作用，使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析 即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体 纯化提供很好的解决。然而要得到高质量高纯度的抗 体，需要我们从样品处理，纯化介质的选择以及纯化 上悉心考虑，这里我们就这些大家常见的问题来讨论。 1，对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品， 有哪些样品处理的方法？ 在纯化前，合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高 纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱，延长使用寿 命。对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂 蛋白，酚红，小分子污染物等等。 腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂 类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。方法一是 在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋 白，沉淀可以通过离心除去；方法二PVP能产生一个pH值 依赖的沉淀效应，PVP在pH＝7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球 蛋白。很多时候，可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释 腹水，不仅保证样品的结合pH，还有利于降低黏度。 酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，虽然 并不直接的影响纯化，但是酚红可能结合到某些纯化介质 上，应该尽可能早的被除去，可以使用脱盐柱除去酚红。 对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除，如 硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀的方法。 最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐，把样品换到 合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分 子。更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。 2，实验室需要纯化小鼠的IgG1，我是选择ProteinG 还是ProteinA？ 首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强 度”（图1）来获取选择哪种配基的指导，针对小鼠的 IgG1， ProteinA结合相对弱，可以选择ProteinG配基的介 质。但由于Protein G结合力较强，因此有时需要pH低于2.0 才能有效洗脱，容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。 此时可以考虑结合力相对较弱的protein A填料，结合缓冲 液中需要加入0.5~3M 的氯化钠以增加结合能力，目标抗体 在pH4.5左右就可以被温和的洗脱。 若实验室有AKTA系统，那么Hitrap ProteinG HP是高分 辨率方便快捷的首选。 若没有AKTA系统，MabTrap抗体纯化试剂盒可以给你 带来最大的快捷和便利，试剂盒含有一个Hitrap ProteinG HP1ml的预装柱，结合，洗脱和中和的缓冲液，一个具有 接头的注射器、以及经过优化的纯化操作规程。 Ab Spin Trap是预装了100ulProteinGHP填料的离心 柱，和的小离心机一起使用，仅用20分钟就可以完成 一次小规模的抗体纯化。 ProteinG HP MultiTrap96孔板适用于高通量的筛选。 3，面对ProteinA如此多的配基形式，它们有何区别 和应用？ 蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株 系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结 构域，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他 杂蛋白流穿，具有极高的选择性，通常一步亲和层析就可 达到超过95%的纯度。 ProteinA sepharoseCL-4B，是将从金黄色葡萄球菌表 达纯化出蛋白A通过CNBr的方法偶联在sepharose CL-4B的 介质上，可以纯化体液或细胞培养液中的免疫球蛋白。 nproteinA sepharose4FF，nprteinA即为天然 (Native Protein A)，表示其在生产过程中没有引入任何动物来源的组分。 rproteinA sepharose4FF，重组的蛋白A (rProtein A)， 经基因改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位 点定向偶联于琼脂糖骨架上，有效降低空间位阻，增加了 与IgG 的结合能力。同时配基在发酵和纯化过程中没有引 用人源的IgG，避免了人源IgG的污染风险。 rmpProteinA，多位点附着的技术，保证更低的配体 的脱落。一步高度纯化单抗和多抗。 2005年我们推出了新一代的MabSelect ，是第一个使 用高流速琼脂糖凝胶 ( High flow Agarose) 作为骨架的新型 蛋白A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计。相比传统 抗体纯化常见问题回答 Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator 铅笔工具 Administrator 铅笔工具 Administrator 铅笔工具 Edited by Foxit Reader Copyright(C) by Foxit Software Company,2005-2008 For Evaluation Only. 31 用 户 园 地 Q & A Fast Flow填料，高流速琼脂糖具有高流速高载量，更低的 配体脱落，易于清洗与除菌消毒，寿命更长、更经济，适 合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为治疗用单抗 纯化和放大的标准介质。 4，为什么洗脱之后没有看到正确的条带？ 首先我们先看样品是否结合了？先查不同的种属亚型 参考“相对结合强度”表（图1），看有没有亲和性，柱 子选得对不对。然后检查结合缓冲液和样品的pH是否7.3 附近。必要时将原始样品和流穿跑还原和非还原SDS-PAGE 进行分析，有条件可以做Western Blot，或检测Elisa是结合 上去没有洗脱? 检查洗脱缓冲液pH对否？建议依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脱，跑电泳或ELisa等检测洗脱产物 洗脱峰是否立即中和？蛋白长期在酸性条件下易水 解，中和后也容易产生沉淀 跑电泳的loading buffer是否新鲜配置？（常遇到还原 loading buffer中DTT失效，导致电泳条带位置不对） 5， ProteinA和ProteinG填料如何清洗再生？ 对于Sepharose基架的ProteinA和ProteinG填料的清洗 方法可以参考（预装柱同样适用此清洗方法）： 对于沉淀或变性的蛋白： 用6M盐酸胍清洗2个柱体积，立即用5个柱体积的 PH7-8结合缓冲液来清洗，反向冲洗，每次清洗时间不超 过10min。 对于去除疏水性的物质： 70%乙醇浸泡12小时左右，然后立即用5个柱体积的 PH7-8结合缓冲液来清洗，反向冲洗。 对于新一代的Mabselect SuRe的介质，通过改造对碱 敏感的Asp 氨基酸突变为耐碱的氨基酸得到新的四聚体配 基SuRe配基，将此新配基偶联到高流速琼脂糖基质上， 成为耐碱的新型高流速Mabselect SuRe 蛋白A 层析介质， 可以耐受0.1~0.5N的氢氧化钠在位清洗/消毒大大降低了抗 体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，清洗效果更 好，有利于延长介质使用寿命，同时也大大降低了CIP/SIP 的成本。 6，抗体药物纯化过程中，如何降低聚集体含量？ 在上游细胞培养，控制最佳的收获时机(TOH)，避免 培养过程中抗体聚集； 相比其他蛋白A填料，Mab select SuRe可以用更温和 的洗脱条件，即提高洗脱pH 0.5-1个单位； 亲和低pH洗脱液中加入保护剂 (Arg等)； 亲和低pH洗脱后，快速中和； 适当降低亲和层析进样量； 样品处理和纯化过程中，尽量保持较低的温度 (4-8C) 使用Superdex200, 离子交换层析, 疏水层析, Capto adhere等层析技术去除聚集体。（详细的方法请参考《抗 体纯化手册》） 7，含FCS培养表达的human IgG的纯化中，如何避免 牛IgG干扰？ 选用专为纯化human IgG而开发的新型Igselect填料, 可以特异的识别结合human的IgG，而不结合其它种属来 源的IgG。 也可以考虑先用传统的Protein A或G纯化，再使用疏 水层析HIC来去除牛IgG。 使用IgG含量较低的血清，也有助于后期的分离纯化。 8，我需要纯化抗体的Fab片段，有什么办法吗？ KappaSelect 是专为纯化 Fab（kappa）片断而设计 的亲和 介质，能有效地捕获 Fab，获得高纯度和高产量的 Fab。 KappaSelect 是通用电气医疗集团客户定制设计填 料项目之一，其以高度刚性的琼脂糖基质为基础，能在大 规模生产中承受高流速和低反压。它是一种亲和填料，配 体能与 Kappa 轻链的恒定区结合（也就是说，缺乏 Kappa 轻链恒定区的片断不会与之结合）。因此，KappaSelect 能够结合其它包含 Kappa 轻链恒定区的目标分子，如 IgA 和 IgM。配体通过长的亲水空间臂与基质相连，使之易于 结合目标分子（图2）。另外Protein G在某些情况下可以和 Fab有结合作用，因此可以用于Fab, F(ab')2的纯化。 注意：kappaselect 只能结合human抗体的k 轻链。 Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil Administrator Pencil 通用电气 (中国) 医疗集团