人类多囊肾病相关蛋白TMEM130基因的克隆及生物信息学分析

第 1卷 第2期 2010年 6月 热 带 生 物 学 报 JoURNAL oF TRoPICAL oRGANISMS V01．1 No．2 JuIL 2Ol0 文章编号：1674—7054(2010)02一O114—07 人类多囊肾病相关蛋白TM EM1 30基因的克隆 及生物信息学分析 齐兴柱 ，胡文婷 ，张俊芳 ，黄俊生 ，李 军 (1．海南大学 海洋学院，海南 海 口570228；2．海南大学 农学院，海南 海13 570228； 3．中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 儋州571737) 摘 要：以递交到 GenBank上的TMEM130蛋白基因序列(nm一152913)为引物，以人大脑 eDNA文 库为模板进行巢氏PCR扩增，并将 PCR产物克隆到pMD18．T载体上，成功获得 TMEMI30蛋白基因编码序 列，测序结果显示，获得的序列为TMEM130蛋白基因转录变异体2，其编码序列长 1 272 bp。该基因定位在 人类第 7条染色体 7q22．1区域，有 3个转录变异体。生物信息学分析显示该序列可编码 1个含 423个氨基 酸的蛋白质 ；Smart mode程序显示该蛋白质是 1个跨膜蛋白，在 100～250号氨基酸序列之间有 1个与多囊肾 病(PKD)相关的结构域。因此，鉴定 TMEM130蛋白是一个与人类多囊肾病相关的蛋白。 关键词：TMEM130蛋白；多囊肾病；生物信息学；克隆 中图分类号：R 318．04 文献标志码：A 多囊肾病(Polycystic Kidney Disease，PKD)是一种肾小管囊肿进行性扩张以及正常肾小管的结构和功 能进行性丢失并最终导致终末期肾衰竭的遗传性肾脏疾病，可分为常染色体显性遗传性多囊肾病(ADP． KD)、常染色体隐性遗传性多囊肾病(ARPDK)和成人多囊肾病(APKD)等。常染色体显性遗传性多囊肾 病(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease，ADPKD)是人类最常见的单基因遗传病之一，发病率约 为0．1％⋯。其主要临床特征是双侧肾脏形成多个液性囊泡，囊肿进行性生长，导致肾脏结构和功能的损 害，至6o岁时约50％患者发展为终末期肾功能衰竭，约占终末期肾功能衰竭病因的10％。多囊肾病患者 除肾脏改变外，还可累及全身多个器官，如肝、胰、脾囊肿、颅内动脉瘤、高血压_2 等。常染色体隐性遗传 性多囊肾病 (Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease，ARPDK)属于单基 因遗传病，发病率在 1／40 000～1／20 000，临床现为肾脏集合系统囊样扩张并伴有不同程度的胆囊发育不全、胆管扩张以及 肝门静脉周围纤维化。成人多囊肾病(Adult Polyeystic Kidney Disease，APKD)也是一种常染色体显性遗 传病，发病率高，大约有 1／1 000的人为致病基因携带者。多囊肾病为多发病，也是中年人尿毒症常见病 因。为研究人类 TMEM130蛋白的功能及其与人类多囊肾病的关系，笔者以人的大脑 cDNA文库为模板， 成功扩增并克隆了人类多囊肾病相关蛋白TMEM130转录变异体2的编码序列，并对该基因进行了相关 生物信息学分析和通过软件对该蛋白质的空间结构进行了预测。 1 材料与方法 1。1 人类多囊肾病相关的蛋白TMEM130基因编码序列的克隆 通过搜索 http： www．ncbi．nlm．nih． gov／网站的Nucleotide数据库，得到一段人类 cDNA序列(登录号nm一152913)，以该序列为模板，利用 Primer Premier5．0引物设计软件设计了2对 PCR引物：HTMEM130senl(5’，rrCTcGAGcTCCAcCTGcA，rrC 3 )，HTMEM130antl(5 CACTGAGATGGGGTGGGGAGG 3 )，HTMEMI30sen2(5 AATGGCCCAGGCAGTGT- 收稿 日期 ：2010—03—19 基金项目：海南省教育厅高等学校科研项目(Hjkj2010—13)；海南省自然科学基金(808122)；海南热带水生生 物技术重点实验室开放基金(shkyjj0801)． 作者简介：齐兴柱(1973一)，男，湖南津市人，海南大学农学院2009级在职博士研究生． 第2期 齐兴柱等：人类多囊肾病相关蛋白TMEM130基因的克隆及生物信息学分析 1 15 GGT 3 )．HTMEM130ant2(5 AGccGGAGTGcTcAcACGGT 3 )。通过 NCBI网站的 UniGene数据库查询， 发现该基因有大量来自人类大脑组织的 EST序列数据，推测该基因在人类大脑组织中有表达。然后，以 人类大脑 eDNA(购 自 Clontech公司)文库为模板 ，进行巢氏 PCR扩增，首先，HTMEM130senl和 HT— MEM13Oantl为引物进行第 1次 PCR扩增，然后以第 1次 PCR扩增产物为模板，HTMEM130sen2和 HT- MEM130ant2为引物进行第 2次 PCR扩增。反应体系为：超纯水 16．2 IxL，10 X ExTaq buffer 2．5 ILL，dNTP 2．5 ILL，正向引物和反向引物各 1．3 ，模板 1 ，ExTaq DNA聚合酶0．2 ，总体积25 。第 1次 PCR反应条件为：94℃变性4 min，94 oC 30 s，52 cI=30 s，72℃ 2 min，30个循环，72℃ 延伸8 min；第 2次 PCR反应条件为94 cC变性4 min，94 oC 30 S，60 oC 30 S，72 oC 2 min，30个循环，72℃ 延伸8 rain。PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的片段经纯化回收试剂盒进行回收。连接反应采用 TAKARA公司 pMD18．T载体连接试剂盒进行，连接产物转化大肠杆菌 DH5c~感受态细胞，提取质粒并经酶切鉴定，然后 将克隆成功的样品送上海生工测序。 1．2 TMEM130基因的生物信息学分析 TMEM130基因组信息的分析通过http：／／W'~c3q．ncbi．nlm．nih． gov／网站的Nucleotide、UniGene、UniSTS、数据库进行。同源序列的查询采用 http：∥www．nebi．nlm．nih． gov／网站的blast在线软件进行。序列比对及进化树分析分别采用 ClustalX及 MEGA4．0软件进行。蛋白 质序列分析采用 DNAStar软件进行。蛋白质的结构域三维模型分析采用 SWISS-MODEL软件进行，并用 WebLab viewer显示 。 2 结果与分析 2．1 TMEM130基因的克隆及序列分析 以人类大脑 cDNA 文库为模板，PCR扩增人类 TMEM130基因的开放阅读框 cD— NA序列，PCR产物长度在 1 ooo～1 500 bp之间，其附近无非 特异性条带(图 1)，将产物纯化后克隆到T载体上进行测序， 测序结果如图2所示(只列出 1个测序反应)，经 blast比对证 实克隆片段为人类 TMEM130基 因转录变异体 2(nm一 152913，blast比对结果未列出)的开放阅读框的 cDNA序列。 图3显示，TMEM130基因转录变异体 2的 cDNA全长 3 029 bp，开放阅读框长 1 272 bp，预测其编码 1个含423个氨基酸 的蛋白质。基因组信息查询发现该基因定位在人类第 7条染 色体7q22．1区域，在基因组上的跨度为23．562 kb，包含8个 外显子(图4)，1号外显子长 274 bp，2号外显子长 306 bp，3 号外显子长 160 bp，4号外显子长 166 bp，5号外显子长 85 2 3 4 图 1 PCR产物电泳图 (1～3．第 2次 PCR产物；4．marker) 2 000 bp 1 500 bp 1 000 bp bp，6号外显子长203 bp，7号外显子长 113 bp，该基因的转录本存在 3种拼接方式，即3种转录变异体 (transcript variant)，其中，转录变异体 1的 8号外显子长 1 757 bp，转录变异体 2的 8号外显子长 1 721 bp，而转录变异体 3则没有2号外显子，其 8号外显子与转录变异体 2的8号外显子一样长(图4)。3种 转录变异体的5 端均有 189 bp的非翻译区，3 端均有 1 568 bp左的非翻译区．起始密码子均开始于 190 bp处，其周围的碱基序列是 GCAATGG，与 Kozak所描述的真核生物起始翻译序列 APGNNATGG相一致， 表明此 ATG是TMEM130基因编码序列的起始密码子。 A TCTGC,CTTGCCTGCCTCCTGCCCTGGGCCCCGGCAGGGGTGGCCGCAGGCCTGTATGAACTC从TCTCACCACCGATAGCCCTGCCACCACGGGAGCGGTGGTGACC ATCTCGGCCAGCCTGGTGGCCAAGGACAACGGCAGcCTGGcCcTGCcCGCTGACGccCACCTC1'ACCGCTTCCACTGGATCCACACCCCGCTGGTGCTTACTGGCAA GATGGAGAAGGGTCTCAGCTCCACCATCCGTGTTGTCGGCCACGTGCCCGGGG从 TTCCCGGTCTCTGTCTGGGTCACTGCCGCTGACTGCTGGATGTGCCAGCCTG TGGCCAGGGGCTTTGTGGTCCTCCCCATCACAGAGTTcCTCGTGGGGGACcTTGT丁GT(=ACCCAGAACACTTCCCTACcCTGGCCCAGcTcCTATCTCACTAAGACC GTCCTGAAAGTCTCCTTCCTCCTCCACGACCCGAGCAACTTCCTCAAGACCGCCTTGTTTCTCTACAGCTGGGACTTCGGGGACGGGACCCAGATGGTGACTGAAGA CTCCGTGGTCTATTATAACTATTCCATCATCGGGACCTTCACCG1、GAAGcTCAAAGTGGTGGcGGAG GGAAGAGGTGGAGCCGGATGCCACGAGGGCTGTGAAG( AGAAGACCGGGGACTTCTCCGCCTCG( GAA( TGCAGGAAACCCTTCGAGGCATCCAAGTGTTGGGGCCCACCCTAATTCAGACCTTCCAAAAGATGACCGTGACC TTGAACTTCCTGGGGAGCCCTCCTCTGACTGTGTGCTGGCGTCTCAAGCCTGAGTGCCTCCCGCTGGAGGAAGGGGAGTGCCACCCTGTGTCCGTGGCCAGCACAGC GTACAACCTGACCCACACCTTCAGGGACCCTGGGGACTACTGCTTCAGCATCCGGGCCGAGAATATCATCAGCAAGACACATCAGTACCACAAGATCCAGTGTGCCC TCCAGAATCAGCCGGCTGTCTTTGCTTTCCATGTGCTACACTTATCACTGTGATGTTGGGCTTCATCATGTACATGACCCTGCGGATG l 10 100 190 图2 人类 TMEMI30基因克隆的测序及部分序列峰图 A．人类 TMEM130基因克隆的测序结果(只列出 1个测序反应)；B．测序的部分序列峰图 ACAGAGcG，rCCCa GCGAGGACGAGcGAGCA cGC黜 GAGGAGcGACCGCCGCAGTTCTcGAGCTCCAGcTGcATTCCCTCCGCG 礁 A Q A V W S R L 280 TATG从cTcAATCTCACCACCGATA Y E L N L T T D S AGCGGGCTG CCGCc( GC，rG G R I L l】I『 L A C L L P W A P A GGGGTGGccGCAGGccTG G V A A G L CCTGCc7 四10 Gj【GC( rGG，I Tc rCG( 【Gc( G( G【 C7 C(；GC GC P A T T G A V V T I S A S L V A K D N G S 370 cTGGccCTGCCCGCTGACGCCCACCTcTACCGCTTcCACTGGATCCACACCCCGCTGGTGCTTACTGGc从 GATGGAGAAGGGTcTcAGC L A L P A D A H L Y R F H W I H T P L V L T G K M E K G L S 460 TCCACCATCCGTGTGGTCGGCCACGTGCCCGGGGAATTCCCGGTCTCTGTCTGGGTCACTGCCGcTGACTGCTGGATGTGCCAGCCTGTG S T I R V V G H V P G E F P V S V W V T A A D C W M C Q P V 550 Gcc^GGGGcTTTGTGGTccTCCcCATCACAGAGTTCCTCGTGGGGGACCTTGTTGTCACCCAGAACACTTCCCTACCCTGGcCcAGcTCC A R G F V V L P I T E F L V G D L V V T Q N T S L P W P S S 640 TATCTCACTAAGACCGTCCTGAAAGTCTCCTTCCTCCTCCACGACCCGAGCAACTTCCTCAAGACCGCCTTGTTTCTCTACAGCTGGGAC Y L T K T V L K V S F L L H D P S N F L K T A L F L Y S W D 730 TTCGGGGACGG6ACCCAGATGGTGACTGAAGACTCCGTGGTCTATTAT从CTATTCCATCATCGGGACCTTCACCGTGAAGCTCAAAGTG F G D G T Q 矗l V T E D S V V Y Y N Y S I I G T F T V K L K V 820 GTGGcGGAGTGGG从 GAGGTGGAG0CGGATGcCACGAGGGcTGTGAAGCAGAAGACCGGGGACTTcTccGCCTCGCTGAAGCTGCAGG从 V A E W E E V E P D A T R A V K Q g T G D F S A S L K L Q E 910 ACcCTTAGAGGCATCCAAGTGTTGGGGCCCACCCTAATTCAGACCTTCCAA^u^GATGACCGTGACCTTGAACTTCCTGGGGAGCOcTcCT T L R G I Q V L G P T L I Q T F Q K M T V T L N F L G S P P 1000 CTGACTGTGTGCTGGCGTCTCAAGccTGAGTGCCTcCCGcTGGAGG从 GGGGAGTGCcACCCTGTGTCCGTGGCCAGCACAGCGTACAAC L T V C W R L K P E C L P L E E G E C H P V S V A S T A Y N 1090 CTGAcCCACACCTTCAGGGACCCTGGGGACTACTGCTTCAGCATCCGGGCCGAGAATATCATCAGCAAGACACATCAGTACCACAAGATc L T H T F R D P G D Y C F S I R A E N I I S K T H Q Y H K I I 180 CAGGT( GGOCI CCAG从 TCCAGCCGGCTGTCTTTGCTTTCCCATGTGCTACACTTATCACTGTGATGTTGGCC1 CATCATGTACATG Q V W P S R I Q P A V F A F P C A T L I T V M L A F I M Y M 1270 A。CCCTGCGGAATGCCACTCAGCAA^ A硬 G( G(蕊G7 C( =Ci G(刁 G1．Gi=，r 3i=a(G矾 口 赋 G T L R N A T Q Q K D M V E N P E P P S G V R C C C Q M C C G 1360 CcT竹 CTTGCTGGAGACTcCATCTGAGTACcTGG从 ATTGTTCGTGAGAACCACGGGCTGCTCCCGCCCCTCTATAAGTCTGTCAAAACT P F L L E T P S E Y L E I V R E N H G L L P P L Y K S V K T I 450 TACACCGTGTGAGCACTCCCCCTCCCCACCCCATCTCAGTGTTAACTGACTGCTGACTTGGAGTTTCCAGCAGGGTGGTGTGCACCACTG Y T V 木 1540 ACCAGGAGGGGTTCATTTGCGTGGGGCTGTTGGCI：TGGATCATCCATCCATCTGTACAGTTCAGCCACTGCCACAAGCCCCTCCCTCTCT 1630 GTCACCCCTGACCCCAGCCATTCACCCATCTGTACAGTCCAGCCACTGACATAAGCCCCACTCGGTTACCACCCCCTTGACCccCTAcCT 1720 TTG从 GAGGCTTCGTGCAGGACTTTGATGCTTGGGGTGTTCCGTGTTGACTCCCAGGTGGGCCTGGCTGCCCACTGCCCATTccTCTCAT l8 l0 ATTGGCACATCTGCTGTCCATTGGGGGTTCTCAGTTTCCTCCCCCAGACAGCCCTACCTGTGCCAGAGAGCTAGAAAGAAGGTCATAAAG 1900 GGTTAAA从TccATAACTA从GGTTGTACAcATAGATGGGCACACTCACAGAGAGAAGTGTGCATGTACACACACCACACACACACACAC 1990 ACACAcAcAcAC^ CACACACACAG从 ATATAAACACATGCGTCACATGGGCATTTCAGATGATCAGCTcTGTATCTGGTT从 GTCGGTTG 2080 CTGGGATGCACCCTGCACTAGAGCTGAAAGGAAATTTGACCTCCAAGCAGCCCTGACAGGTTCTGGGCCCGGGCCCTCCCTTTGTGcTTT 2 170 GTCTCTGCAGTTcTTGcGCccTTTATAAC-GCCATCCTAGTCCCTGCTGC-CTGGCAGGGGGCTGGATGGGGGGCAGGACTAATACTGAGTG 2260 ATTGCAGAGTGcT下TAT从ATATCAccTTA1vrTTATcG从ACCcATCTGTGAAACTT，rCACTGAGGA从AGGcC个TGCAGCGGTAGAAGA 2350 GGTTGAGTCAAGGCCGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGGCGGGTGGATCACGAGATCAGGAGATCG 2440 AGAOCACCCTGGCTAACACGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAA从TACAAAAAGTTAGOCGGGCGTGGTGGTGGGTGCCTGTAGT￡CCA 2330 GCT^ cGGG^ 6GcTG^ 66G^ GGA6^ ATGGT6cGAACCCGGGA66cGGAGc下TGcAGTGAGCCcAGATGGcGCCAcTGCAcTCCAG(：CTG 2620 AGTGAcAGAGCGAGACTc，rGTCTCCA从从AAAAAAAAGAAGAGGTTGAGTCAGcAGGGACTTGGGTTCCCTGTGTGTGAGGGGG6CATT 27 10 CTTGCCTGCCAGCTGCTCCCGAGGTGGCCTTGAGAAGG^uAGAAGCAGGATGACAGAGCCTGAGCAGCGGAACCAGCCTGCACCCTCCCTT 2800 CTGGCCCAGCGACCTGGGcTGTGGCTGAGACAATAATGAGGCCAGAAGTAGCCGGAGCCTGTCAGGAAGGGCAGGGGAGGACTGTGGGGT 2890 CTGGGCTCTGTCGCTGTAACCATCTGCTCCCAGGCTGTGTGCAGAAAATGGCATTTACACTATTGTGCAGCTCATTCTCATGAAATACTG 2980 CCATTGTTGcT从AT从AGCTTGTGTGcTCTG从TATAGCCAAGCATAGA 3029 图3 TMEM130基因转录变异体2的cDNA序列及其预测的编码蛋白 (其中，12—31及34O～362号氨基酸用下划线标出，是该蛋白质的跨膜序列。图中左边的数字表示核苷酸对序号。) 2．2 TMEM130基因的分子特征及其进化分析 经检索蛋白质数据库表明，人类 TMEM130蛋白质可能 是一个人类多囊肾病相关的蛋白，在哺乳动物和鸟类中存在多个同源蛋白质，如 NP_808403．2(Mus mM．．$C／／,- ，小鼠)、NP_001163870．1(Rattus norvegicus，大鼠)、NP_001076838．1(Bos taurus，黄牛)、XP_001136233．1 第2期 齐兴柱等：人类多囊肾病相关蛋白TMEM130基因的克隆及生物信息学分析 117 (Pan troglodytes，黑猩猩)、NP_O01126556．1(Pougo abelii，苏门答腊猩猩)、XP_O01494483．2(Equus cabal— Z ，马)、EFB25467．1(Ailuropoda melanoleuca，大熊猫)、xP一001512168．1(Ornithorhynchus anatinus，鸭嘴 兽)、XP_001111417．1(Macaca mulatta，猕猴 )、xP一851082．1(Canis lupus familiaris，狗)、xP一414751．2 (Gallus gallus，红原鸡)，XP_002192176．1(Taeniopygia guttata，斑胸草雀)，但在低等动物、无脊椎动物以 及其他低等脊椎动物中没有发现 TMEM130蛋白的同源蛋白基因。这说明TMEM130蛋白基因是一个高 度进化的基因。笔者将人类 TMEM130蛋白质及其在其他物种中的同源蛋白输入 DNAstar软件，利用其 中的Clustal V程序进行同源蛋白序列比对排序，并利用其中的进化树分析程序进行了进化树分析(图5) ，表明该蛋白与黑猩猩、苏门答腊猩猩和猕猴的同源蛋白聚为一个大的分支，其中，人类TMEM130蛋白与 黑猩猩的 MEM130蛋白亲缘关系最近，其同源性达到93％，这与整个动物进化分支是一致的。 A B 转录变异体1 ／ j==== ／ 图4 人类TMEM130基因转录本的3种拼接方式，结果产生3种转录变异体。 图中1号外显子中的黑色方框表示 5 非翻译区，8号外显子中的黑色方框表示3 非翻译区 浅黑色方框表示外显子的编码区，虚线条表示内含子。 78． Ailuropoda melanoleuca 59。矿L—Canis lupus familiaris L — Bos Taurus I L——一 Equus caballus 厦l 67．0广Homo sapiens l 7 9． L Pan troglodytes LPongo abe—lii— Macaca mulatta - - — — MUS musculus Rattus norvegicus 91．9 L_．— 一 TaeniOpygia guttata 0rnithOrhynchus anatinus 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Amino Acid Substitutions(xl 00) Bootstrap Trials= 1000．seed=1 1 1 图5 人类 TMEM130转录变异体 2的蛋白及其同源蛋白的进化树 Gallus gallus 。 ． ． ． ． ． 、 g蠢 ． 、 、 、 、 、 ． ． ． ． ～～ ， 侉 妒 雾 转 一 118 热 带 生 物 学 报 2010正 2．3 TMEM130蛋白的结构域分析 笔者将克隆后测序并比对正确的TMEM130蛋白基因cDNA序列输 人 DNAStar软件中的EDITSEQ程序，预测到该编码序列的编码蛋白，由423个氨基酸组成，分子质量为 46 988．79 D，等电点为6．684。将该蛋白质输入到 NCBI蛋白质数据库中进行blast搜索，发现该蛋白质的 100～250号氨基酸组成结构是一个与人类多囊肾病即PKD相关的结构域。图6为该蛋白质与典型的人 类 PKD蛋白质结构域保守序列的比对结果。笔者将该蛋白序列输入在线 SWISS—MODEL软件，以1B4R _ A 序列为模板分析蛋白质的结构域三维模型，并用 webLab viewer显示 ，获得了该蛋 白质的三维空间模 型 (图7)。图8显示的是典型Cn3D4．1软件显示的典型PKD结构域的三维空间模型示意图，其蛋白 质的二级结构含有 6个卢折叠区域 ，卢折叠区域之间也有 Ot螺旋，其超二级结构属于3种基本结构中的 卢Ol型。而图7显示的TMEM130转录变异体 2蛋白质的三维空间模型图中也有 3个 折叠区域。从 3 个卢折叠的排列和走向看，与图8中卢折叠区域非常类似。因此，笔者从 3个方面[1)蛋白质的序列组 成；2)与典型PKD结构域的序列比较(图6)；3)TMEM130转录变异体 2蛋白的三维空间模型与典型PKD 结构域的三维空间模型比较(图7～8)]进行预测，鉴定该蛋白质是一个与人类多囊肾病相关的蛋白质。 将该蛋白质序列输入到smart mode在线软件，预测到该蛋白质 1～24号氨基酸为信号肽，同时，l2～31及 340～362号氨基酸为该蛋白的跨膜序列，因此该蛋白为膜蛋白。这与它的 PKD结构域及作为细胞膜上 的蛋白质与蛋白质或蛋白质与糖类相互作用的配基位点是一致的。 FlajoritY —H一—E—一V—V—一PEA--C—一P一-L-—．PLLX~CDC