胶体金法

· 52 · 中国国境卫生检疫杂志2oo7年 2月第 3O卷第 l期Chinese Frontier Health Ouarantine Feb．2oo7。Vol 30。No．1 [检 测 技 术 ] 胶体金免疫层析法检测水产品中O 群 霍乱弧菌方法的建立与优化 何艳玲 林 松 王陆迪 唐慧林 刘 振 王 静 李 瑾 (1．中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任公司，北京 100025； 2．中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所。北京 100025 摘要 [目的] 研究了O 群霍乱弧菌免疫层析试纸的制备方法，通过对试纸材料的处理达到优化胶体金免疫层 析体系的目的。[方法] 建立了快速检测食品中 O，群霍乱弧菌的胶体金免疫层析方法，并应用该方法对弧菌属、假单 胞菌属及其他常见肠道致病菌，共 29株进行检测，同时对 180份水产品进行了样品添加试验 ，并用《出口食品中霍乱 弧菌检验方法)(SNfr1022—2001)进行确证，全面评估了该方法的灵敏度、特异性、准确性等。[结果] 该方法检测食 品中O。群霍乱弧菌的灵敏度为 105cfiffml，与食品中常见的致病菌无交叉反应。该方法检测水产品中O。群霍乱弧菌的 假阳性率为6．25％。[结论] 该方法操作简便，灵敏度高，特异性强，准确性高，适用于食品的快速检测。 关键词 水产品；弧菌，霍乱；胶体金；免疫层析 [中圈分类号] R516．5 [文献标识码] B Development and Improvement of Colloid Gold lmmunochromatography for Rapid Detection of Vibrio Cholerae 0l Serotype in Aquatic Products He Yanling，Lin Song，Wang Ludi，et a1．Chinese Academy of Inspection and Quaratine，Beijing 100025，China 【Abstract] Objective To study the prepareration of colloidal gold dipstick for rapid dtection of Vibfio cholerae Ol serotype， the material optimization of colloidal gold immunochromatography system． Method The method of colloidal gold immunochromatography for rapid detection of Vibfio cholerae Ol serotype in food sample was established．29 strains of different foodbome pathogens，including Vibrios，Psedomonas and other intestinal pathogens were tested with the colloidal gold dipstick．180 pieces of Aquatic Products sam ples being added Vibrio cholerae 0l serotype were tested with the colloidal gold dipstick and confirmed with SN／T1022—2001．The sensitivity， the specificity and the presision of the method were evaluated． Result The sensitivity of the method for the detection of Vibfio cholerae 01 serotype in Aquatic Products was 105 cfrdm1． There was no cross-reaction with usual intestinal pathogens and the fales-positive rate for the method was 6．25％ in Aquatic Products sam ples testing． Conclusion Th e rapid detection method provides high sensitivity and specificity．SO it Can be extensively used to fast screen ofplenty of sam ples． 【Key words] Aquatic products；Vibfio；Cholerae；Colbidal gold；Immunochromatography 霍乱弧菌 01群 (Vibrio cholerae O1 serotype)是 人类霍乱的病原体之一，主要通过污染的水源或食 物经口等途径传播。自1817年以来，全球共发生了 7次世界性霍乱大流行。霍乱弧菌产生的霍乱肠毒 素可作用于小肠粘膜，使肠液过度分泌，导致患者出 现剧烈的腹泻，由于大量脱水和失盐，可发生代谢性 酸中毒、血液循环衰竭、甚至休克或死亡。霍乱流行 迅速，病死率高，属于国际检疫传染病。建立食品中 霍乱弧菌的快速检测方法，对保障食品安全、防治霍 乱流行等均具有重大意义。胶体金免疫层析法特异 性高，灵敏度好，以其为基础的一步快诊法在病人粪 便霍乱弧菌快速检测中已取得了较为理想的效果 ； 但在水产品 0。群霍乱弧菌检测中，其灵敏性 lO％fu／ IIll，不及常规的直接分离培养法 102cfu／ml的检测 限，需通过适当增菌后进行检测。由于检测样本种类 繁多，增菌液成份复杂 ，容易出现假阳性[1】，因此 ，需 要优化胶体金免疫层析试纸，在提高灵敏度的同时 降低非特异性吸附造成的假阳性，使其更利于进出 口食品在口岸快速通关，提高检验检疫的效率。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 标准菌株：O。群霍乱弧菌(小川型和稻叶型)、 副溶血性弧菌(ATCC33847；ATCC17802)、溶藻弧菌 (ATCC17749)、拟态弧菌 (ATCC33653)、创 伤弧菌 (ATCC27562)、嗜水气单胞菌(11801)、铜绿假单胞 基金项目：北京市科学技术委员会研发攻关类科技计划(DO206O10o40391) 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国国境卫生检疫杂志 2007年2月第30卷第 1期 Chinese Frontier Health Quarantine Feb．2007，Vol 30，No．1 ·53 · 菌(10211)等，中国检验检疫科学研究院保存。 1．1．2 抗体与血清 抗 O 群霍乱弧菌多价单克隆 抗体、抗 O 群霍乱弧菌多克隆抗体由上海市疾病预 防控制中心提供，羊抗鼠IgG(原血清)购 自晶美生物 有限公司，氯金酸购 自北京化学试剂厂，牛血清 白蛋白(BSA)购自鼎国生物制品公司。霍乱弧菌抗 血清：AS491霍乱弧菌 O 群多价抗血清 ；As492霍 乱弧菌稻叶型抗血清；AS493霍乱弧菌小川型抗血 清；购自泰国S&A公司。其它试剂均为分析纯。 1．1．3 免疫试纸耗材 硝酸纤维素膜 (Hi-flow Plus Membranes：HFO90o2、HF13502、HF180o2)、样 品垫 、 胶体金结合垫 、吸水垫 、PVC塑料薄板 ，均购 自 Millipore公司。 1．1．4培养基 碱性蛋白胨水 (APW)，营养琼脂 (NA)，质量分数为 3％NaCl胰酪胨大豆琼脂 (3％ NaC1 TSA)，TCBS琼脂等，均由北京陆桥技术有限责 任公司提供。 1．2 方法 1．2．1 免疫层析测试条的制备 1．2．1．1 抗体预处理 抗体标记前，取适量已纯化 好的抗体溶液，对400ml 2mmol／L pH9．0硼酸缓冲液 透析，4℃ 12h，其间换液 3次；收集透析后溶液，使用 0．221~m微孔滤膜过滤 ；以透析液为空白，测定抗体 溶液在 260nm和 280nm波长处 OD值，计算抗体浓 度；使用透析液稀释抗体浓度至 0．2mg／ml，4~C保存 并尽快使用。 1．2．1．2 胶体金颗粒的制备 将氯化金溶于超纯水 配制得质量分数为0．01％的氯化金水溶液，取 100ml 加热至沸腾，在搅动状态下加人 lml的体积分数 1％ 柠檬酸三钠水溶液。继续加热煮沸 15min，随后冷却 至室温，用超纯水恢复至原体积，4℃避光保存。 1．2．1．3 免疫胶体金 的标记 用 0．1mmol／L HC1和 25mmol／L K2CO3将 100ml胶体金溶液调至最适 pH 值；根据最适蛋白量计算出所需抗体量 ；在快速搅拌 下逐滴加入所需抗体，室温下放置 10min，加入过滤后 的 10％BSA至终浓度为 1％，继续低速搅拌 10min； 在 4~C，13000r／min离心 45min；小心弃去上清，根据 标记物所需 OD值，用0．01mmol／L TBS(pH8．2，含质量 分数 1％BSA和质量分数0．02％叠氮钠)将沉淀重新 悬浮，0．221~m微孔滤膜过滤，4℃避光保存。 1．2．1．4 试纸中样品垫的处理 配制不同的缓冲溶 液作为样品垫处理液，分别浸没所需数量的样品垫 10min，取出样品垫，放人37℃烘箱中干燥 24h，取 出，干燥室温贮存备用。 1．2．1．5 免疫试纸的组装 胶体金标记单克隆抗体 包被到胶体金结合垫上作为移动探针，硝酸纤维素 膜上包被多克隆抗体作为检测线 ，包被羊抗鼠IgG 作为控制线 ，喷点完毕后立即在 37℃烘箱中干燥 4h；在干燥环境中将硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、 样品垫 、吸水垫依次贴在 PVC塑料薄板上组成免疫 胶体金检测试纸，切割成 0．4cm的条，干燥室温贮存 备用。 1．2．2 快速检测食品中霍乱弧菌的胶体金免疫层析 方法 称取 25g样品，加入 225 mlAPW，8000 r／min 均质 1～2 min，(36+1)℃(如果是牡蛎样品 ，应在 42℃)培养 6-8h，取 1001~1增菌液，直接滴加到免疫 胶体金检测试纸的样品垫上，10min左右观察结果。 结果判定：检测线和控制线均显色为阳性；仅控 制线显色为阴性；若控制线不显色则表明检测体系 失效。 1．2．3 灵敏度测定试验 将小川型和稻叶型霍乱弧 菌分别接种于质量分数为 3％NaCl胰酪胨大豆琼脂 (3％NaC1 TSA)，(36~1)℃培养 18-24h，刮取菌落，用 比浊法制备 1O 菌液，用霍乱弧菌抗血清(O 群、小 川型和稻叶型)分别进行血清凝集试验进行确认；同 时将 1O 菌液梯度稀释后，取不同稀释度分别用于 免疫层析检测，用倾注法计数。 1．2．4 特异性试验 将标准菌株划线接种于NA或质 量分数为 3％NaCl TSA (弧菌属细菌)，(36+1)oC培养 18-24h，挑取菌落，用比浊法制备 1O 菌液；或将标准 菌株接种于 NB或APW(弧菌属细菌)，(36+1)oC培养 6～8h。取 1001~1菌液可直接用于免疫层析测定。 1．2．5 样品添加试验 实验选取市售的虾、牡蛎、海 鱼 3类水产品，样品经 《出口食品霍乱弧菌检验方 法>>(SN／T1022—2001)确认为霍乱弧菌阴性。各样品 分别称取 6O份 ，每份 25g，其中 2O份作为阴性对照， 2O份低浓度人工污染，添加标准菌浓度为 1-10 efu／ 25g；另外 2O份高浓度人工污染，添加标准菌浓度为 1O～100cfu／25g；人工污染后的25g(n~)样品采用 1．2．2 方法进行测定，同时用 SN／T1022—2001方法进行确 证。所添加标准菌为小川型和稻叶型霍乱弧菌的等 量混菌。 2 结果 2．1 硝酸纤维素膜的选择 分别使用 HF09002、 HF13502、HF18002作为层析膜组装成试纸进行测 试，从试纸灵敏度以及非特异性吸附造成的假阳性 显色等方面进行综合对比，HF13502效果较好。 维普资讯 http://www.cqvip.com · 54 · 中国国境卫生检疫杂志2007年 2月第 3O卷第 1期 Chinese Frontier Health 0uarantine Feb．2007，v01 30。N0．1 2．2 样品垫处理液的选择 配制不同离子强度和 pH值的磷酸盐缓冲溶液和硼酸盐缓冲溶液作为样 品垫处理液，分别对样品垫进行处理，然后装配成试 纸。按照 1．2．2的方法对 1．2．5中20份阴性样品进行 检测，综合考察层析试纸因非特异性吸附造成假阳 性显色的情况以及灵敏度，结果显示 pH值为 8．5的 0．1mol硼酸盐缓冲溶液对应试纸的效果最好。 在 pH值 8．5的 0．1mol硼酸盐缓冲溶液中分别 添加质量分数为 0．5％、1％、2％、4％BSA得到 4种处 理液，分别对样品垫进行处理，然后装配成试纸。按 照 1．2．2的方法对 1．2．5中20份阴性样品进行检测， 考察层析试纸因非特异性吸附造成假阳性显色的情 况，结果显示质量分数为 1％BSA对应的效果较好。 最终确定采用含有质量分数为 I％BSA、pH值 8．5、0．1mol硼酸盐缓冲溶液作为样品垫处理液，用于 层析试纸。 2．3 灵敏度试验 取不同稀释度的小川型和稻叶型 霍乱弧菌菌悬液，用免疫试纸进行检测，同时根据倾 注法计数结果计算不同梯度菌液的实际浓度，以免 疫试纸出现阳性结果的最低浓度为检测灵敏度。该 免疫试纸检测 O 群霍乱弧菌的灵敏度为 10 efu／ml， 结果见表 1。 表 1 免疫试纸检测 0。群霍乱弧菌灵敏度试验结果 2．4 特异性试验 取不同菌株的新鲜菌悬液 (浓 免疫试纸与常见的致病菌均无交叉反应。 度>10 efu／m1)，用免疫试纸进行检测，结果见表2。该 2．5 样品添加试验 表 2 免疫试纸检测不同菌株特异性试验结果 序 号 菌名(血清型) 菌 号 结 果 序 号 菌名(血清型) 菌号 结果 1 霍乱弧菌(小川型) 一 + 16 甲型副伤寒沙门菌 CMCC50001 — 2 霍乱弧菌(稻叶型) 一 + 17 乙型副伤寒沙门菌 CMCC50094 — 3 副溶血性弧菌 ATCC33847 — 18 猪霍乱沙门菌 CMCC50191 — 4 副溶血性弧菌 ATCC17802 — 19 肠炎沙门菌 CMCC50o41 — 5 溶藻弧菌 ATCC17749 — 20 鼠伤寒沙门菌 CMCC50115 — 6 拟态弧菌 ATCC33653 — 21 福氏志贺菌 CMCC51571 — 7 创伤弧菌 ATCC27562 — 22 痢疾志贺菌 CMCC51253 — 8 嗜水气单胞菌 CMCC1 1801 — 23 弗氏枸橼酸杆菌 CMCC11732 — 9 铜绿假单胞菌 CMCC10211 — 24 普通变形杆菌 CMCC49101 — 10 大肠杆菌 0157：H7 ATCC43888 — 25 奇异变形杆菌 CMCC49005 — 1 1 金黄色葡萄球菌 ATCC27217 — 26 肺炎克雷伯菌 CMCC46114 — 12 表皮葡萄球菌 CMCC26069 — 27 粘质沙雷菌 CMCC41002 — 13 单增李氏菌 CMCC54001 — 28 产气肠杆菌 CMCC12021 — 14 粪链球菌 CMCC32221 — 29 乙型溶血性链球菌 CMCC32210 一 15 蜡样芽孢杆菌 CMCC63301 — 免疫层析测试条检测结果与传统微生物检测法 相比，假阳性率为6．25％。结果见表 3。 3 讨论 以膜为固相载体的胶体金免疫层析技术是 20 世纪 80年代在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、 单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基 础上发展起来的一项新型体外诊断技术14]。由于其快 速、便捷，不需特殊设备，结果判断直观，近年来越来 越受到人们的重视，已有众多科研机构对使用胶体 维普资讯 http://www.cqvip.com 20o7年 2月第 3O卷第 l期 Chinese FrontierHealth 表 3 样 品添加试验结果 · 55 · 金免疫层析技术检测致病微生物进行了研究 [5-63，并 已在临床诊断、检验检疫等领域中得到了广泛应用。 由于胶体金免疫层析技术基于抗原抗体特异性 反应进行检测 ，因此在检测实际样本时，由于待检样 品种类繁多，成分复杂，容易影响抗原抗体反应以及 胶体金颗粒与蛋白的吸附，造成假阳性结果，所以需 要将试纸的整个反应体系调节到最适合抗原抗体反 应的环境，并降低非特异性吸附造成的假阳性结果。 在本实验中采用预处理样品垫的方法达到调节的目 的。对应增菌所使用的碱性蛋白胨水(北京陆桥技术 有限责任公司提供)，样品垫处理液为含质量分数为 I％BSA、pH值 8．5、0．1mol硼酸盐缓冲溶液时，效果 最佳。 应用该方法对弧菌属、假单胞菌属及其他常见 肠道致病菌等共 29株进行检测，结果显示试纸与食 品中常见的致病菌无交叉反应；对 180份水产品进 行了样品添加试验，并用传统微生物检测方法(SN／ T1022—2001)进行确证 ，结果显示该方法的假阳性率 为6．25％。该方法检测食品中O。群霍乱弧菌的灵敏 度为 10 cfu／ml。 本研究建立的快速检测食品中霍乱弧菌的胶体 金免疫层析方法，经过灵敏度试验、特异性试验、样 品添加试验、以及与传统微生物法的比对试验，结果 表明，该方法操作简便 ，灵敏度高，特异性强，准确性 高，适用于食品样品的快速检测。 参 考 文 献 1 谢昭聪，宋志强，马淑锦，等．应用胶体金免疫层析法检测水产品中 霍乱弧菌的研究[J】．中国国境卫生检疫杂志，2005，28(3)：163-165 2 G Frens．Controlled Nucleation for the Regulation of Particle Size in Monodisperse Gold Solutions[J~Nature Physical Science,1973(20)'．241 3 Schleicher Schuell Bio—science．Colloidal Gold Conjugation Protocol 『n1．DASSEL：Schleicher＆ Schuell Bio—Science，1NC．2004，E1／9／04 4 李永勤，杨瑞馥．以膜为固相载体的免疫胶体金快速试验[JI．微生物 学免疫学进展，2003，3 1(1)：74—78 5 李伟，闫中强，王静，等．应用胶体金免疫层析技术建立炭疽杆菌芽 孢快速检测方法[JI．中国国境卫生检疫杂志，2004，27(6)：329-33 1 6 杜玉萍，陈清，王雅贤，等．胶体金免疫层析法检测金黄色葡萄球菌 的初步研究[JJ．热带医学杂志，2006，6(6)：650-652 [收稿日期：2006—12—19] 维普资讯 http://www.cqvip.com