分子伴侣GroESL在大肠杆菌中的克隆,表达及分离纯化

了 ( 微 生 物 学 报 37(5)：344～348，1997 Acta ~ crotn'ologlca Sinica ． 分子伴侣GroESL在大肠杆菌中的克隆、 达及分离纯化 ．旦 塑．塑蛳 张 青 宋大新 陈永青⋯ (复旦大学微生物系 ￡海200433) Q ．f 2-1 摘 要 将含分子伴侣 Ca'oESL基因的 DNA片段，通过在合适的酶切位点进行酶切，将该基 因克隆人高表达载体 pKC220，含该表达质粒的工程菌经 42"C热诱导后，分子伴侣 Ca'oESL基 因在大肠fF菌中获得了高教表达，其中，分子伴侣蛋白Ca'oEL的表达量占细菌总蛋白的 40％， 其辅助蛋白GroES的表达量占细菌总蛋自的 l5％：同时，建立了较简单的分离纯化路线，通过 硫 酸铵沉淀，D】BAB_52柱层析、Sephadex G-50凝 胶过滤等方法得到纯化的分子伴侣蛋 白 子“～。大肠杆菌的热休克蛋白GroESL参与许多蛋白质的折叠 组装以及跨膜运输0。 ，属 于分子伴侣的一种，由单体分别为 60kD的GroEL和 l0 kD左右的 GroES两种成份组成． 在一定条件下，l4个 GroEL单体分子和 7个 GroES单体分子形成聚合体，其中 GroEL分 子排列成双层饼状，每层为 7个单体组成，而 7个 GroES单体分子排列成单层环状，与 GroEL十四聚体的一端结合。GroESL通过催化ATP水懈提供能量，瞬时维持其它蛋白质 在折叠过程中间态的稳定，阻止了聚集，帮助其它蛋白质形成正确构象 ～。 外源基因在大肠杆菌中高效表达时，往往形成无活性又不可溶的包涵体，包涵体大多 是蛋白质在过量表达过程中不正确折叠形成的。由于分子伴侣可以促进外源蛋白质的正 确折叠，在基因工程实际应用中具有广阔的前景。本研究主要是在大肠杆菌中高效表达 分子伴侣 GroESL，并且获得了大量分子伴侣GroESL的纯蛋白，为进一步研究分子伴侣的 作用机制打下基础。 1 材料和方法 1．1 酶厦试剂 限制性内切酶及 DNA连接酶等工具酶均购自美国Promega公司，DEAE-521~J自 英国 Whalraan公司，SephadexG-50购自美国 Pharmacia公司，其它化学试剂均为分析纯 ·国家自然科学基金资助项目 +· 复旦大学遗传学研究所。 ⋯ 联 作者 ． 本文于I996年7月15日收到 维普资讯 http://www.cqvip.com 5期 周 颖等：分子伴侣GroESL在大肠杆菌冲的克隆、表达及分离纯化 345 产 品 。 1．2 质粒及菌株 带有 GroES和 GroEL基因的质粒 pOt39 由美国Utah大学 Olivier Eayet博士惠赠： 表 达 质 粒 pKC220 带 有 热 敏调 控 型 强启 动 子P ，为本 实 验 室保 存：大 肠杆 菌 HB101[supFA4hsdS20recA1 3ara 14proA21acYlgalK2rpsL20xyl一5mtl—I】用作基因克隆及表 达受体菌，为本实验室保存。 1．3 基因工程的一般操作 有关质粒 DNA的抽提，酶切 连接和转化等基因工程一般操作均按 Sambrook等方法 进行。 1．4 SDS-PAGE和蛋白质浓度测定 不连续变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)采用Lammile系统“q， 分离胶浓度 12．5％。电泳后用考马斯亮蓝R-250染色。蛋白质浓度测定采用Bradford方法I】 ，以小牛血清 白蛋白(BSA)作为标准。 1．5 菌体的诱导表达 将带有 GroESL基因的高表达质粒经转化至大肠杆菌 HB10l中，将转化子于 2×YT 培养液中30"C过夜培养，以 l：100的比例转接人含 100 g／ml氨苄青霉素的2×YT培养 液中，3O℃培养 2～3 h至对数期，迅速于42℃热诱导6～8 h后，5000 r，min离心 10 min收 集菌体，按 l：10的比例 (湿菌体 ，体积)加入裂解缓冲液 (50 mmol／L Tris HCI．pH8．0， 50 mmol／L KC1．1 mmol／L EDTA，5 mmol／L B—巯 基乙醇，5％ 甘油)，超声波破碎 细胞，10 000 r，min离心 10 min，分别收集上清和包涵体沉淀，进行 SDS—PAGE分析。 1．6 GroESL的分离纯化 收集菌体，按 l：l0 ，v)比例加入裂解缓冲液(50mmol，L Tris—HC1，pH8．0，5％甘 油，lmmol／L EDTA，100mmol／L KC1)悬浮菌体，超声波破碎，l2000 r，rain离心 20 min收集上清，即为 GroESL粗品。粗品GroESL上清中加入固体硫酸铵至 70％饱和度， 4℃搅拌 lh，12000 r，min离心 30min，沉淀重新溶解于缓冲液 (50mmol，L Tris HC1， DH 8．0，5％甘油，lmmol／L EDTA，50mmol，L KCI)中，并对相同缓冲液透析过夜。透 析液上 DEAE-52纤维素柱，采用 100 mmol／L-500 mmol／L的 KC1进行梯度洗脱。收集 从 DEAE洗脱下来 的含 GroESL的峰，上Sephadex G-50凝胶过滤柱，用缓冲液 (5O mmol／L Tfis—HC1 pH 7．5，20％甘油)洗脱，分别收集 GroEL和 GroES蛋白峰。 2 结果和讨论 2．1 GroESL表达载体的构建 ’ GroESL基因已克隆在质粒pOF39上，pOF39为pBR322衍生质粒，在 EcoRI和BamH] 酶切位点间含有 GroESL的DNA片段。利用 EcoRI和质粒上 BamI-1]下游的 SalI位点，用 EcoRI和 SalI酶切将带有 GroESL基因的DNA片段切离，通过 DEAE膜纯化该片段，定向 克隆于表达载体的 EcoRI和 SalI位点，表达载体 pGroESL的构建见图 l。 2．2 分子伴侣 GroESL高效表达 含高表达质粒的大肠杆菌通过 42"C热诱导，分子伴侣 GroESL基因进行转录和翻 维普资讯 http://www.cqvip.com 微 生 物 学 报 37卷 一 ” ＼＼、 、 ＼ ／ 译，图2为表达产物的 sDS— PAGE电泳结果，与空载表达 质粒相 比较，含重组表达质 粒 pGroESL的 工 程 茁 在 60kD和 llkD处各有一条明 显的蛋白质条带，GroESL表 达 产 物 大 小 与 文 献 报 道 相 符，薄层扫描分析显示 GroEL 和 GroES的表达量分别占细 茁 总 蛋 白 的 40％和 l5％。 GroEL和 GroES的表达量随 时间增加而有所增加，但 10h 后，GroES有 降解趋势。 结 果 表 明， 在 30℃ 时 GroESL两个基 因都未表达， 42℃时两者都可获得高效表 达，这说明它们的表达仅受其 上游热敏调控型强启动子 P 的控制，尽管该基因片段自身 也带 有启动子。推测 GroEL 和 GroES在发挥正常生理功 能时，是以双顺反子形式共同 图1 表达载体pGroESL~构建示意图 受启动子的调控进行表达的。 ．I Cansmaction of the C~oESL expression vector 当两个基因串联表达时，上游 基因的表达 可以促进下游基 因的表达，例如有人将缩短的 巨噬细胞 克隆刺激 因子 (M-CSF】基因直接克隆于色氨酸启动子后，该基因不能表达，但将该基因与白细胞介素一2 基因串联后再克隆于色氨酸启动子后，两基因都可以获高效表达【l 。另外，进一步分析表 明，在破苗液上清液及包涵体中都有 GroESL的存在，包涵体中的GroES和 GroEL量约各 占总菌蛋白的5％和 l(F．4，推测包涵体中GroESL的形成原因是由于其过量快速表达自身错 误折叠而形成的。关于分子伴侣高效表达后也会形成包涵体的现象，文献中尚未有过报道。 2．3 GroESL蛋白的分离纯化 含表达质粒pGroESL的大肠杆菌经 42℃热诱导6h后，离 tL,收集菌体，经超声波破碎， 含高表达产物的可溶性上清液经 90~／8饱和度硫酸铵沉淀和 DEAE-52柱层析，GroESL可 以得到初步纯化。Gr0EgL在 20 mmol t L Tris—HC1，50 mmol，L KC1存在下可以较好 地与DEAE-52吸附。采用KC1梯度洗脱，先用 l00 mmol／L KCI洗脱除去大部分未吸附 的杂蛋白，然后用 100～500mmol，L KC1进行梯度洗脱。GroES和 GroEL蛋白大约在 200mmol／L左右时被同时洗脱下来，并与细胞中杂蛋白分离：当洗脱液浓度继续升至 300mmol，L时，GroEL以较纯的方式洗脱下来(图3)。将含 GroEL和GroES的收集样品 一 — c ●●●●● ‘ 维普资讯 http://www.cqvip.com 5期 周 颖等：分子伴侣Gr0EsL在大脑杆菌中的克隆、表达及分离纯化 347 图 2 重组基因 0mEsL表达产物的 SDS—PAGE电泳分析图谱 标准蛋白质分子量；b．HB101(pKC220)，42℃诱导 IOh；c HB10I(pGro~L)．28℃IOh；d． HB101(pGroES L)，42℃诱导 2h；e．HB101(pGroESL)，42℃诱导 4h； f I-IB101(pGroESL) 42℃诱导 8h；g．JIB】0】tpGroESL)，42℃诱导6h；h HB10I(pGroESL)，42℃诱导 10h。 FiP 2 SDS—PAGE anaJysis of the expression of recombinant GroESL genes in 凸cherichia coli Protein molecular weig~ markers；b HB1~)1(pKC220)．induced a1 42℃ for lob；c HB10I(pGroES L]，28℃ for IOh；d．e．t2 g．h liB10I(pGroES L]，induced at 42℃ for 2h，6h, 4 8h, 1Oh,respectively 图 3 重组 GroEL分离纯化过程的 sDS_PAGE分析 a．趋声波破碎后上清：b．硫酸铵沉淀；c DEAE纯化后样品 d标准 分子量蛋白质． Yig 3 CoomazsSe H n md gel containing GroEL at various stage of purification from Eacherichia coli extract(Samples from different st／ages in the preparation of cloned GroEL wem subjected t0 I2 5％ SDS-PAGB1 The crude￡ coli HB】0】(pO'oES L1 ce¨ ]ysate；b Sample from fll~rtlonium sulphate salt out；c Sample e】uted from the DEAE-52 column；d Protein mdec山al-weight markers 图 4 重组 Gr0Es分离纯化过裎的 SDS PAGE分析 a 标准分子量蛋白质；b Sephadex G一50纯 化 后 GroES蛋 自样品． 1qg 4 Coomassie blue．tamed gd containing purified GroES from Eseherichia coli extract (samples su ectedto】2，％ S[~-PAGE) a Protein molecular weight markers；b- Purified C~oES,the second Deak 0f SeDhadex G-50 colⅢ札 维普资讯 http://www.cqvip.com 微 生 物 学 报 37卷 经凝胶过滤 Sephadex G 50柱层析，由于 Sephadex G一50的排阻范围为3 000～3O000， GroEL在空体积被洗脱下来，GroES进入胶颗粒，可较为方便地将两者分离。图 3和图4 分别为所纯化的GroEL和 GroES的 SDs—PAGE电泳图谱，它们的纯度都达95％以上。经 Bradford定量后，液氮迅速冷冻后置 ～70℃保存。 外源基因在大肠杆菌中高效表达时，往往形成无活性、不可溶的包涵体。包涵体大多 数是由于蛋白质表达过程中不正确折叠而形成的，包涵体的体外复性还无一定的规律可 循 我们设想利用分子伴侣 GroESL，通过两种途径帮助不正确的变性蛋白质分子折叠成 正确构象，一种可以在体外加速和促进包涵体蛋白质复性，另一途径是将该基因和外源蛋 白的基因在体内共表达的方法，帮助体内外源蛋白表达过程中进行正确折叠，这方面的工 作正在进行之中。 参 考 文 献 【1] Ostermann工 Horowich A L．Neupert W et at Nature，1988，341：l25～132 【2] Bcehkareva E S．Lissin N C,irshovich A S Nature,l988，336：254～257 [3】 Jorg Thomas L R na B et aL Nature．199l，352：36～42． [4】 Johannes B Marion S，Miriam F et al~'ochemistry,l 1．30：1586～l5915． 【5l Oiothia C Ann v oehera,l990．59：l∞7～l叭3 【6】 Elena S B， ∞ M L G代go工y C F et J Chem，1992，267(10)．6796~6800 【7】 Fayet O．Louarn J Georgopoulos C Mol Gen Gene~ l986，202：400～440 [8】 Sl~ mke H Rosenberg Nature,l981，292：128～l [9] Sambmok^ FiiBch E E Maniatis T Molecdar Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed．New York=Cold Spring Habour~ tory．1989 [1。_ l；aernnCi U K Nature,l970，127：680～686 [11] Bradford M M． Biochem,l976，72：248～255． [1 2_ Kazuya Y_J Biochem,l 1，109：4o4～409． CLONING，EXPRESSION AND PURIFICATION OF THE CHAPERoNIN GRoESL IN 岛巴日E冠 哪 COLI Zhou Ying Yin Changchuan Zhang Qing Song Daxin Ellen Yongqing (Department of Microbio r,ogy，Fudan Univer5i牡，s g i 200433 Abstract The DNA fragment encoding the molecular chaperion GroESL was subcloned into higlr-expression vector pKC220，and the GroESL welq~ high expressed in the E coli slxain harboring the recombinant plasmid by high temperature induction． The amount of the expressed GroEL and GroES protein were about 40％ and 15％ of the total cellular proteins． respectively． Th ese two subunits were bo th purified from E coli by(N 2SO4 salt put,DEAE-52 chromography and Sephadex G 50 chromo- graphy Key words Chaperonin，GroESL High expression,Purification 维普资讯 http://www.cqvip.com