FAAS法测定噪声性耳聋豚鼠外淋巴液钙含量

火焰-原子吸收分光光度法测定噪声性耳聋 豚鼠耳蜗外淋巴液钙含量 叶怀庄 李莉（浙江大学医学院，杭州310031） 催彩霞（浙江省中医学院，杭州310003） 摘要：建立了噪声暴露豚鼠耳蜗外淋巴液中钙含量的火焰-原予吸收分光光度测定方法。采用常规进样方式，缩短预喷雾和积分时间。结果 钙浓度线性范围在0-5.00μg/mL，最低检测限为0.02μg/mL，回收率98.66%，相对差0.79%。外淋巴液钙含量模型组为262.14±77.93μg/mL、对照组为155.56±27.01μg/mL，两组比较有显著性差异（P＜0.05）方法简便、可靠，可满足了外淋巴液钙含量测定的要求。 关键词：火焰-原子吸收分光光度法，豚鼠，外淋巴液，钙 Determination of Ca in External Lymph in Inner Ear of Guinea Pig with noise deaf by FAAS Ye Huaizhuang, Lily (Zhejiang University Medical School, Hangzhou, China, 310031) Cui caixia (zhejiang Traditional Chinese Medical School, Hangzhou, China, 310003) Key Words: Flame atomic absorption spectrometry(FAAS)，Guinea pig，External lymph，Calcium 钙离子对耳蜗听觉功能具有重要生理意义，它使外淋巴液保持平衡，促进内耳细胞营养与代谢，参与催化外淋巴液中的生化反应，在“去极相”进入耳蜗“内毛细胞”促进递质释放、调节“外毛细胞”运动及其侧壁和顶膜上的钾通道的开放，从而参与耳蜗微音电位的产生[1-2]。钙离子又常常在有害因素导致耳蜗细胞损伤的过程中起不良媒介作用。如噪声等对内耳的损伤，常伴有耳蜗外淋巴液中钙等元素含量的改变。因而测定耳蜗外淋巴液中钙等元素含量，可了解内耳损伤及经受噪声的影响。 目前耳蜗外淋巴液中钙测定的原子吸收光度法常采用微量进样法[3-4]，以克服样品量不足的限制，但均需对原有仪器的进样装置加以改装，这样不利于推广。本研究不改变仪器装置，试图通过缩短预喷雾和积分时间，以达到快速检测目的。 1 材料与方法 1.1 仪器及器皿 AA-680原子吸收分光光度计（日本岛津仪器公司），钙空心阴极灯（日本HAMAMATSU PHOTONICS K.K.），空气压缩机（能控制压力在400-600 kPa），可调微量移液器（200μL、1000μL，法国Gilson公司），微量注射器20μL（上海精密仪器公司），TDT系统自制声控装置。 1.2 试剂 (1) 盐酸ρ=1.18g/mL，优级纯； (2) 盐酸溶液（1+99）； (3) 镧溶液（10g/L）：称取1.73g高纯氧化镧（La2O3），溶于10mL盐酸(2)中，移入100mL容量瓶内，用去离子水稀释至刻度。 (4) 钙标准使用液：国家标准溶液GSB G 62012-90（2001），1.0mg/mL（5%HCl介质）。 1.3 动物模型制备 选用健康杂色豚鼠24只，耳廓反射灵敏，性别不拘，由浙江大学动物中心提供，体重250-350g，分为实验组16只和对照组8只。 清理豚鼠双侧外耳道，对于实验组用TDT系统自制声控装置发出白噪声100 dB SPL，经过ER-10C型耳塞式耳机传入双侧外耳道鼓膜处，每天4小时，连续14天。实验结束时，腹腔注射1%戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，经监测实验组动物无脑干感音电位，建成双侧噪声性耳聋动物模型。 1.4 样品制备 用木锤敲击头部处死豚鼠，取出两侧耳蜗，在手术显微镜下用20μL微量注射器从豚鼠内耳中吸取外淋巴液8.0μL放入洗净塑料管中，加镧溶液120μL，再加1+99盐酸溶液l072μL，加盖摇匀，供Ca测定用。以去离子水代替样品同法制备样品空白。 1.5 仪器条件 灯电流6mA、狭缝0.5nm、分析线波长422.7nm；乙炔2.0L/min、空气8.0 L/min、燃烧头10cm；预喷雾2秒、积分时间3秒。 1.6 标准曲线制备 用微量移液器吸取钙标准使用液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL，置于50mL容量瓶中，各加镧溶液5.0mL，以1+99盐酸定容至刻度，配成Ca浓度为1.00、2.00、3.00、4.00、5.00μg/mL标准系列。按照“1.5节”仪器条件进样测定，结果见1，经统计处理，得到回归方程Y=0.0877X+0.001，钙浓度在5μg/mL以下呈线性，相关系数R为0.9990，最低检测限为0.02μg/mL。 表1 标准曲线测定结果 No. 浓度（μg/mL） 吸光度（Abs） 1 1.00 0.090 2 2.00 0.165 3 3.00 0.274 4 4.00 0.354 5 5.00 0.434 1.7 结果计算 式中：X—样品中待测元素质量浓度，μg/mL； A—样品测定液中待测元素质量浓度，ng /mL； A0—空白测定液中待测元素质量浓度，ng /mL； V—样品测定液定容体积，μL； V1—取样体积，μL。 2 结果与讨论 2.1 样品中钙释放剂的选择 火焰原子吸收光谱法测定钙时，镧能消除干扰，提高分析灵敏度。选用10g/L镧溶液作释放剂测定外淋巴钙，可消除PO4-3（500μg/mL）、SO4-2（200μg/mL）、K+（1000μg/mL）、Na+（1000μg/mL）以及Mg2+、Zn2+、Fe2+（200μg/mL）的干扰。 2.2 仪器检测条件的优化 仪器和火焰条件均采用岛津公司推荐的基本参数。由于样品量较少（约1.2mL），许多学者均采取微量进样[3-4]，本研究采用常规进样方式，将预喷雾和积分时间调整为2秒和3秒，经模拟样品（2.00μg/mL标准溶液）测试，与常规进样（预喷雾3秒、积分5秒）比较无差异（P＞0.05），结果见表2。但必须掌握样液喷雾开始、火焰平稳、开始测定的节奏，在保证火焰平稳（喷雾不间断）的前提下尽快按压“测定”按钮，完成一次测定约需样液0.5mL，对于1.2mL样液可以平行测定2次。 表2 缩短预喷雾和积分时间与常规进样测定结果比较 进样方式 吸光度（Abs） ±S P 缩短进样 0.165 0.163 0.160 0.159 0.171 0.168 0.164±0.005 0.09 常规进样 0.168 0.168 0.166 0.167 0.169 0.170 0.168±0.001 2.3 方法的精密度 通过多次测定，检验了方法的精密度，结果对同一标准稀释液（3.00μg/mL标准溶液）进行l0次测定，Ca元素的相对标准差为0.79％，符合方法学要求。 表3 方法精密度测定结果（n=10） No. 吸光度（Abs） ±S RSD（%） 1 0.270 0.272±0.002 0.79 2 0.273 3 0.271 4 0.270 5 0.275 6 0.275 7 0.272 8 0.270 9 0.273 10 0.269 2.4 方法的准确度 另取6只对照组豚鼠，按“1.4节”方法制备样品，在样品稀释过程中加入与样品中Ca含量相当的标准使用液150μL，按“1.5节”方法测定，结果平均回收率为98.66%（表3）。 表4 方法的准确度测定结果（n=6） No. 加入量（μg） 测得量（μg） 回收率（%） 平均回收率（%） 1 150 154.31 102.87 2 150 146.25 97.50 3 150 147.63 98.42 4 150 149.20 99.47 5 150 140.33 93.55 6 150 150.20 100.13 2.4 样品测定结果 模型组和对照组豚鼠耳蜗外淋巴液钙含量测定结果见表5，经统计处理，模型组钙平均含量为262.14±77.93μg/mL，对照组为155.56±27.01μg/mL，两组比较有显著性差异（P＜0.05）。说明噪声性听力损伤后，耳蜗外淋巴液钙含量升高，这与文献[5-6]等报道的噪声性耳聋的损伤机制相一致。 表5 模型组和对照组耳蜗外淋巴液钙测定结果（ ±S） 组 别 动物数量（只） 含量（μg/mL） 模型组 16 262.14±77.93 对照组 8 155.56±27.01 统计量 t=11.64，P=0.042 随着国民经济的日益发展，噪声及其所带来的各种问题越来越突出，对噪声性听力损伤的研究具有重要的现实意义。本研究建立的外淋巴液钙含量测定方法，具有快速、简便、灵敏等优点，是研究耳蜗外淋巴液钙离子浓度在听力损伤机制中作用的一种实用方法。 参考文献 [1] 王坚，董维嘉，陈继生等。降低外淋巴钙浓度对耳蜗电位的影响，生理学报，1994，46(1)：327。 [2] 胡联，董维赢，陈继生。提高外淋巴钙浓度对耳蜗电位的影响，中国应用生理学杂志，1997，13(2)：128。 [3] 黄安辉，王翔朴，孙虹。微量进样火焰原子吸收光度法测定大鼠耳蜗外淋巴钙，湖南医科大学学报，1994，19（3）：264。 [4] 林春竹，谢镇远，孙咏梅。微量进样一火焰原子吸收光谱法测定豚鼠内耳外淋巴液中钙、镁、钾、钠等元素含量，广东微量元素科学，1997，4（12）：48。 [5] Fridberger A，Hock A，Ulfendahl M，et a1．Acoustic overstimulation increases outer hair cell Ca2+ concentrations and Causes dynamic contractions of the heating organ．Proc Natl Sci USA，1998，95：7127． [6] Gao WY，Jiang YP. Effect of noise On concentration of amino acid in perilymph of guinea pig cochlea. Acad J Sec Mil Med Univ，2002，23：41 PAGE 5 _1183468137.unknown _1183470136.unknown _1183468055.unknown