第四章 核酸电泳与检测

nullnullnull核酸凝胶电泳 用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段 优点： 便于分离；便于检测；便于回收 1.基本原理 1.基本原理 琼脂糖凝胶电泳是以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 (1)电荷效应 在 pH 值为 8.0～8.3 时， DNA分子在高于其等电点的溶液中,核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 null(2)分子筛效应 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型。 分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快； 同等分子量的不同构型的核酸分子，cccDNA＞IDNA＞ocDNA null（3）DNA分子的大小 在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数值成反比，因此通过已知大小的物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 null根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小null如何提高核酸电泳的分辨率？ null（4）凝胶电泳的分辨力与凝胶的类型和密度相关 一、凝胶类型 1.琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间(＜20kb);可区分相差loobp的DNA片段， 常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段;垂直装置进行电泳 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 用于核苷酸多态性的分析 null不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度（％，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb)0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2二、凝胶的密度 null 可以通过提高琼脂糖的浓度减小凝胶孔径来提高电泳分辨率。 或者改用聚丙烯酰胺凝胶。 还可以降低跑电泳的电压，增大跑电泳的时间等。 如何提高核酸 电泳的分辨率？ 2.影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： 2.影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： （1）DNA分子的大小：双链线状DNA分子迁移的速率与其碱基对数值近似成反比。样品分子越大，在通过胶孔时的摩擦阻滞力越大，泳动速度越慢。null（2）构象：超螺旋环状＞线状＞切口环状 null（3） 凝胶浓度：浓度越低，相同核酸分子迁移越快。  凝胶浓度愈低,则凝胶孔径愈大(但凝胶的强度也愈低)。一般地分子量越大,选用的凝胶浓度应越小。 　 null（4）电压:低电压时DNA片段迁移率与所用电压成正比。但随着电压上升,不同长度DNA泳动的增加程度不同 ，分辨率会降低null（5）离子强度 缓冲液中无离子时, DNA几乎不移动 。而在高离子强度下，导电性极高,带电颗粒泳动很快,并产生大量的热,有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。null电泳缓冲液TAE TBE TPE三者区别 （1）缓冲容量：TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化。 TBE和TPE比TAE花费贵，但有高得多的缓冲容量。 （2）迁移速度：双链线状DNA片段中TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%， （3）分辨率：对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。 TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液 null（5）溴化乙锭     在DNA电泳中,溴化乙锭染料可插入到碱基对中,从而增加线性及开环DNA的长度。加溴化乙锭后进行电泳,可使DNA的泳动速度降低达15%。3.琼脂糖凝胶电泳3.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。当琼脂糖加热至90℃左右,即可熔化形成清亮、透明的液体,待冷至40-45℃时则可固化形成凝胶 。null基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶成像系统紫外灯下观察并照相保存结果 注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套null（1）琼脂糖凝胶电泳的基本过程nullnull上样缓冲液的三个作用 （1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内 （2）使样品带有颜色便于简化上样过程 （3）其中的染料在电场中可以预测泳动速率向阳极迁移。null6*上样缓冲液成分：（2）琼脂糖凝胶中DNA的检测（2）琼脂糖凝胶中DNA的检测 通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。null凝胶的EB染色（1）EB被认为是一种强致癌物质,见光分解。 （2）EB可用来检测单链或双链核酸 null （3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。 （4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。 EB替代品EB替代品 SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。nullsybr-green、sybrgold ---- 不稳定，毒性也很大 goldview ----宣称无毒,不灵敏,回收连接不好,荧光易猝灭。对于大片段DNA的染色效果还凑合，但是在对于500bp以下的片段效果不是很好。 GelRed/GelGreen低毒,效果很强!但价格昂贵。null（3）结果分析（3）结果分析 提取细菌基因组电泳图null琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成PCR产物的电泳nullRNA电泳图4.注意事项4.注意事项1、溴乙锭(EB)是诱变剂 ，应戴乳胶手套。凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品,必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。     2、加样量的多少决定于加样孔最大容积。加入样品的体积应略少于加样孔容积。     5.常见问题与对策5.常见问题与对策DNA带很淡或无带 nullDNA带拖尾 nullnull6.DNA浓度和纯度的测定6.DNA浓度和纯度的测定紫外吸收法、定磷法 （1）目测条带亮度来判断DNA浓度 跑胶时候marker 按说明书的量上样电泳，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和marker 条带的亮度做个大致的比较。        找出两者最接近亮度的条带。根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。 在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，如果质粒的量很浓的话。      null（2）分光光度法 DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。 波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。 对标准样品来说，浓度为1μg / ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02 当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg / ml                ssDNA浓度约为37μg / ml                RNA浓度约为40μg / ml                寡核苷酸浓度约为30μg / ml（由于底物不同有差异null当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。 一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。null经验值： 纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存） 若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用二的或其他方法进行估算。 null操作步骤 1、  UV-240紫外分光光度计开机预热10min. 2、  用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。 3、  设定狭缝后校零。 4、  将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，编号和稀释度。 5、  把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。 6、  设定紫外光波长，分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。 7、  计算待测样品的浓度与纯度。 DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000 RNA样品的浓度（μg / μl）：OD260×稀释倍数×40/1000null（3）溴化乙锭法 溴化乙锭（EB）插入堆积碱基之间。结合的EB的荧光产率远大于游离EB的荧光产率。荧光强度正比于嵌入溴化乙锭的量。 EB结合量的多少与DNA的大小和构型有关，对于单一构型的同种DNA样品来说，溴化乙锭的嵌入量与样品溶液的DNA含量成正比。RNA 电 泳RNA 电 泳 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 null如何通过分析电泳图谱评判基因组DNA、质粒DNA等的提取物的质量？ 为什么我的PCR产物跑电泳时发生拖尾？ 解决办法？