_淀粉样蛋白对衰老模型大鼠脑海马神经元的毒害作用

收稿日期: 2001- 09- 19 � � 修回日期: 2002- 04- 12 文章编号: 1001� 6325( 2002) 06�0546� 04 ��淀粉样蛋白对衰老模型大鼠脑海马神经元的毒害作用 李 � 亚1, 王建军1, 陈启盛2 ( 1� 南京大学 生命科学院 生理学教研室, 南京 210093; 2� 南京医科大学 生理学教研室, 南京 210029) 摘要: 研究��淀粉样蛋白(��AP)对衰老大鼠海马神经元的影响。采用 D�半乳糖( D�gal)建立衰老动物模型,海马内 微注射��AP,检测各组大鼠 Y�迷宫分辨学习和一次性被动回避反应的变化, 并测定海马超氧化物歧化酶 ( SOD)活 性、丙二醛( MDA)含量、Na+ �K+ �ATP 酶活性和海马线粒体膜流动性。可见 ��AP加上 D�gal组大鼠学习记忆能力, 与只用��AP或 D�gal组比较有显著性差异; 与��AP或 D�gal组比较Na+�K+�ATP酶活性显著降低、MDA 含量显著增 加、海马线粒体膜流动性显著降低。结果明, ��AP与 D�gal联合使用可导致衰老大鼠脑海马自由基损伤加重, 学 习记忆能力显著减弱, 关键词: ��淀粉样蛋白; 阿尔茨海默病; 衰老; 学习记忆 中图分类号: Q244� � 文献标识码: A � � ��淀粉样蛋白( ��amyloid protein, ��AP) , 是老年 性痴呆(Alzheimer� s disease, AD)患者的大脑中特有 的一种蛋白,它在老年性痴呆的发病机理中的作用 已引起人们的重视。生化研究表明, ��AP 是老年性 痴呆患者脑海马和皮层老年斑( senile plaque, SP)的 主要成分, 它与AD的病理形成过程关系密切。AD 是一种进行性中枢神经系统退行性疾病, 表现为学 习记忆能力障碍,感觉、定向能力及推理判断能力都 发生不可逆变化, 是老年人的常见病和多发病。目 前尚缺乏一个十分理想的而能模拟人类AD特征的 动物模型。已有报道 ��AP 对正常大鼠海马神经元 的毒害作用[ 1, 2] ,但有关 ��AP 对衰老大鼠海马神经 元的作用,国内外均少有报道, 本研究是在 D�半乳 糖所致衰老动物模型基础上进行海马内微注射 �� AP,观察大鼠学习记忆能力和脑海马 SOD 活性、 MDA含量、Na+ �K+�ATP 酶活性和海马线粒体膜流 动性,探讨 ��AP的毒害作用及其作用机制。 1 � 材料与方法 1�1 � 动物和试剂 雄性健康 SD大鼠, 体重 100~ 120g (江苏省实 验动物中心提供) , ��AP 为美国 Sigma公司产品( �� AP1�40,Lot NO�76H49611) , D�半乳糖( D�galactose, D� gal)、硫代巴比妥酸 ( TBA) 为上海试剂二厂产品。 SOD活性、Na+ �K+ �ATP 酶活性测定试剂盒由南京 建成生物工程研究所提供。DPH( 1, 6�diphenyl�1, 3, 5�hendtriene)为美国 Sigma公司产品。 1�2� 分组与给药 将大鼠随机分成 4组: 生理盐水 NS+ NS( N) 组; ! NS+ ��AP(A) 组; ∀ D�gal+ NS( D)组; #D�gal + ��AP( D+ A)组。 ∀ #组动物腹腔注射 D�半乳糖: 50mg/ kg∃d,连续注射 6周建立衰老动物模型; ! 组动物腹腔注射等量生理盐水。于第 4周! #组大 鼠进行双侧海马内注射 ��AP, 每侧注射 1�L( 4g/ L) ; ∀ 组注射等量生理盐水。海马定位注射方 法:大鼠用 4%戊巴比妥钠( 40mg/ kg ip�)麻醉,立体 定位仪(日本 NARISHIGE SN�3型)上固定,坐标按照 图谱[ 3] ,以前囱定位: AP= - 3�5mm,ML= % 2�0mm, DV= 2�7mm,钻开颅骨, 用微量进样器垂直进针, 每 侧注射时间为5 min, 留针 5 min, 缓慢起针, 局部消 毒后缝合皮肤,肌注抗生素抗感染。 1�3� 学习记忆能力检测 D�gal连续腹腔内注射 6w 后进行。 1�3�1 � Y�迷宫分辨学习( Y�maze discrimination learn� ing)能力检测[ 4] : Y�迷宫为三等分辐射式反射箱。 以大鼠被电击后逃至安全区为一次正确反应,连续 546 基础医学与临床 � � Basic Medical Sciences and Clinics 2002�22( 6) 10次测试中有 9次 ( 90% )正确反应, 定为学会标 准。记录每个大鼠达到学会的训练次数。所有 检测过程均由计算机完成。 1�3�2 � 一次性被动回避反应 ( one�trial passive avoidence response) [ 5] :根据大鼠趋暗习性, 记录其在 通道上的停留时间, 即步入潜伏期( step�through la� tency, STL) ;动物进入暗箱后立即给予电击( 0�3mA, 5s) ; 24h后检测大鼠的 STL。以 STL 作为记忆保持 的指标, STL 越长表明对电击的记忆保持越好。检 测以 240s为限。 1�4 � 生化指标测定 行为检测结束后大鼠断头处死, 在冰台上迅速 取出两侧海马, 用冷生理盐水为匀浆介质, 制成 5% (W/ V)的海马组织匀浆。丙二醛( malindialdehyde, MDA)的测定:采用 TBA 比色法, 752紫外分光光度 计532nm 波长处检测。超氧化物歧化酶( superoxide dismutase, SOD)的测定: 采用黄嘌呤氧化酶法, 按照 试剂盒说明进行, 752紫外分光光度计 550nm 波长 处检测。海马组织 Na+ �K+ �ATP 酶活性的测定: 按 照试剂盒说明进行, 酶活性单位为: �molPi/ mgprot∃ h) 。线粒体膜流动性测定[ 6] : 制备海马线粒体, 次 日用 DPH 标记。DPH 以四氢呋喃为溶剂, 先配成 2 & 10- 3mol/ L 的贮存液, 低温密封保存在棕色瓶中。 临用前稀释 1 000倍, 配制成终浓度为 2 & 10- 6mol/ L 的实验用液。取 1mLDPH探针溶液加入 1mL 膜悬 液,混合均匀, 25 ∋ 温育 30min后用 RF540荧光分光 光度计(日本岛津)测定各样品的 4个荧光强度: IVV (起偏器和检偏器光轴均为垂直方向时的荧光强 度)、IVH(起偏器光轴为垂直方向, 检偏器光轴为水 平方向时的荧光强度)、IHV (起偏器光轴为水平方 向,检偏器光轴为垂直方向时的荧光强度)、IHH(起 偏器和检偏器光轴均为水平方向时的荧光强度) , 按 公式计算出偏振度 P和膜粘滞系数 : P= ( IVV- GIVH) / ( IVV+ GIVH) , G= IHV/ IHH, = 2P/ ( 0�46- P)。 实验数据用 ( x( % s )表示, 组间差异用 t 检验; 一次性被动回避反应采用 Mann�whitney 非检 验。 2 � 结果 2�1 � Y�迷宫分辨学习能力检测 达到学会标准所需训练的次数, N 组: 21�4 % 5�8;A组: 34�6 % 16�7; D 组: 42�4 % 17�2; D+ A 组: 48�0 % 16�8。前两者比较无显著性差异, D 组与 N 组比较有显著性差异( P< 0�05) , 而 D+ A组,达到 学会标准所需平均训练次数亦多于 D 组 ( P < 0�01)。 2�2� 一次性被动回避反应 从表 1可见 D+ A组记忆保持能力明显下降, 电击后 24hSTL 显著缩短,与 A组或 D组比较有显 著性差异( P< 0�05) � 表 1 � ��淀粉样蛋白对大鼠步入潜伏期的影响 Table 1� The effect of �AP on the step� through � � � � latency behavior in rats( s) Group n Before electro�attack Median Quart ile 24h after electro� attac Median Quartile N 10 24 10- 35 � � 240 190- 240 A 9 25 10- 29 � � 182 117- 190 D 9 23 20- 34 � � 187 136- 197 D+ A 9 33 22- 77 � � 127* )# 88- 135 *P < 0�05 vs N group; )P < 0�05 vs D group; # P < 0�05 vs A group 2�3� 各组大鼠脑海马生化指标的变化 结果见表 2,统计结果表明, D+ A 组与 N组比 较, SOD活性、MDA含量、ATP 酶活性有极显著差异 ( P< 0�01) ,与 D组比较, MDA含量、ATP 酶活性也 有显著差异( P< 0�05) ; D 组大鼠 SOD活性和 ATP 酶活性显著低于 N组 ,MDA 含量显著高于 N组( P < 0�05)。D+ A组、D组和 A 组大鼠线粒体膜粘滞 系数与 N 组比较有显著性差异 ( P < 0�01、P < 0�05) ; D+ A组与 D组和 A组比较也有显著性差异 ( P< 0�05)。 3 � 讨论 有研究报道, 连续注射 D�半乳糖, 可导致动物 学习记忆能力下降,诱发自由基蓄积,引起脂质过氧 化损伤, 是产生拟衰老变化的原因之一。细胞膜是 最易受脂质过氧化攻击的目标。细胞膜蛋白功能的 维持与其膜流动性密切相关。Na+ �K+ �ATP 酶是生 物膜中最为重要的酶, 它在维持膜通透性、膜内外离 子成分及维持细胞正常代谢等方面起重要作用。而 生物膜适宜的流动性是完成生物膜正常功能的必要 条件。本研究结果表明: D- 半乳糖致衰老大鼠学 5472002�22( 6) 基础医学与临床 � � Basic Medical Sciences and Clinics 表 2� ��淀粉样蛋白对大鼠海马生化指标的影响 Table 2� the effect of�AP on the content of MDA and viscous coefficient , SOD and ATPase activity in rats( x( % s) Group n SOD ( NU/ mL) MDA ( nM/mL) Na+�K+�ATPase (�molPi /mgprot∃h) viscous coefficient ( ) N 10 � � � 398�9 % 7�7 � � � 217�4 % 16�8 � � � 38�53 % 7�02 � � � 1�67 % 0�19 A 9 � � � 393�6 % 12�7 � � � 234�9 % 12�6 � � � 32�11 % 4�29* � � � 2�16 % 0�38* D 9 � � � 360�2 % 9�4* � � � 264�8 % 18�5* � � � 30�66 % 4�59* � � � 2�15 % 0�27* D+ A 9 � � � 301�3 % 15�6 � � � 305�4 % 8�8) * * � � � 21�15 % 3�48# )* * � � � 2�63 % 0�33# )* * � *P< 0�05, * * P < 0�01 vs N group; # P < 0�05 vs A group; )P< 0�05 vs D group 习记忆能力显著降低, 海马 SOD和 Na+ �K+ �ATP 酶 活性显著降低, MDA 含量显著增高, 产生明显的脂 质过氧化损伤; 且其海马线粒体膜流动性明显下降。 AD作为一种常见的老年性退行性疾病, 与衰老 有着密切的关系。一些学者认为, ��AP 可引起学习 记忆减退、认知障碍等[ 7] ,是 AD各种病理和临床表 现的始发因素。��AP 具有沉积作用和神经毒性, 较 高浓度的��AP 能引起神经退化和死亡[ 8] ; 这种毒性 作用是否依赖于衰老也是一个值得探讨的问。有 研究报道, AD 患者脑组织中线粒体的功能受到破 坏,氧代谢率明显降低,且自由基的升高可以导致线 粒体膜的流动性下降[ 9]。脑内自由基的形成, 可引 起Na+ �K+ �ATP酶结构发生变化而影响其活性[ 10]。 本研究结果表明: 在衰老模型动物基础上经海马内 注射 ��AP处理后,可导致大鼠学习记忆能力显著降 低,线粒体膜粘滞系数极显著增加,线粒体膜流动性 明显降低;MDA含量显著增高,Na+ �K+ �ATP 酶活性 显著降低,说明 D�半乳糖和 ��AP 有协同效应,导致 自由基损害加重。因此,可以认为 ��AP对衰老动物 海马组织可产生明显的毒害作用, 从而影响海马组 织的功能活动。本实验结果提示, 把 AD的病理学 特征与老年特性结合起来, 可望成为更接近 AD的 一种动物模型。 参考文献: [ 1] Yankner BA, Duffy LK , Kirschner DA. 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The con� tent of MDA and the viscous coefficient( ) of mitochondrial membrane were measured. In the D+ A rats, the abilities of learning�memory were remarkably attenuated as compared with other groups( P< 0. 05 , P< 0. 01 ) ; SOD and Na+ � K+ �ATPase act ivity was markedly lower while the content of MDA was increased markedly. The fluidity of mitochondrial membrane was remarkably lower than N group( P< 0. 01) . The result suggested that the combination of D�gal and ��AP could induce the increase of damage by free radical in rat hippocampus and a conspicuous reduction of learning�memory ability in rat. Key words: ��amyloid protein(�AP) ; Alzheimer� s disease; aging ; learning�memory (上接 542页) 电波烧蚀法可大幅减轻癌症疼痛 据美国生物科技网报道,日前美国罗彻斯特Mayo Clinic研究诊所证实了利用无线电波频率烧蚀( radio�frequency ( RF ) abla� tion)可以减轻癌症病患的骨痛, 并提高其生活质量。这项研究成果已经美国食品药物管制局( FDA)于本月 21日批准该治疗方 法可使用在有两到三处骨转移的癌症患者。 无线电波烧蚀法目前已经被广泛使用在治疗肾脏癌和肝脏癌。而该研究机构的研究证实, 该治疗方法也可以用来杀死 会造成骨头疼痛的癌细胞。BIO. COM( 2002/ 10/ 30) 精神分裂可能是多种紊乱的综合症 发表在最新一期美国心理学协会的∗神经心理学+杂志上的研究显示, 医学界认为, 精神分裂症可能不是一种疾病, 而是 患者脑部受到不同类型的损伤导致的多种紊乱的综合症。( Neuropsychobiology) 中风病患的救星 据英国∗路透社健康通讯+纽约报道,最新的医学研究显示, 一项正在进行动物实验的药物可以有效的停止因中风对脑部 所造成的伤害。科学家希望这个药物对人类也能一样有效。Reuters Health, NEW YORK, 2002/ 10/ 30 怀孕妇女过多服用止痛片婴儿可能会有气喘病 据英国∗路透社健康通讯+伦敦报道, 伦敦国王学院的一项最新研究指出, 妇女在怀孕期间经常服用类似于扑热息痛 ( Paracetamol)的止痛片可能会增加孩子患上气喘病的危险。 对数千名妇女做的调查显示,那些在怀孕后期每天都吃止痛片的妇女生育出的婴儿患上气喘病的几率是其它婴儿的两 倍。虽然患气喘病的婴儿并不一定会发展成患有哮喘,但是气喘病是发展成哮喘病的可能因素。但是, 专家表示扑热息痛仍 然是妇女怀孕期间最安全的止痛片。Reuters Health, LONDON, 2002/ 11/ 01 (下转 553页) 5492002�22( 6) 基础医学与临床 � � Basic Medical Sciences and Clinics