第五讲 放射免疫分析技术(2007)

null放射免疫分析技术 放射免疫分析技术 null在廿世纪60年代初，Berson和Yalow首次应用放射免疫分析法定量测定胰岛素，开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。从此放射免疫分析以其灵敏度高、特异性强、重复性好、准确度高等特点而被广泛应用于医药研究中。 随着放射性碘化标记技术的不断革新、分离技术的改进和亲和素-生物素系统放大技术应用于放射分析技术中，放射免疫分析法的分析精密度、特异性和灵敏度更为提高，操作流程更加简化方便。 null1968年Miles和Hales建立了免疫放射分析方法，利用标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，故其灵敏度比放射免疫分析法明显提高，而且标准曲线的测量范围也明显扩大。 由于特异性单克隆抗体用于免疫放射分析，使本法得到了更快的发展。近年来，基因工程抗体和抗原应用于本技术，使得免疫放射分析法更加完善。 放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类竞争性体外放射分析技术.放射免疫分析基本原理 放射免疫分析基本原理 放射免疫分析的基本原理：放射性标记抗原与非标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）与有限量的特异性抗体发生可逆性竞争结合 ,这种竞争可用以下反应式来表示： null反应体系中同时存在*Ag、Ag和Ab，而*Ag的量一定、Ab的量固定，而且Ag+*Ag＞＞Ab时，随着Ag的增加，*AgAb的量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈负相关。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原-抗体复合物与游离的标记抗原分离，测定其放射性。以标准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原-抗体复合物的结合率（B/T、B/F、或F/T）为纵坐标，绘制剂量反应曲线，也称剂量效应曲线（calibration curve）。 nullnullnull抗原抗体的结合反应遵循质量作用定律，且一般是均一单价的，所以：当反应达到平衡时，v1=v2，k1[Ag][Ab]=k2[AgAb]。设KA为平衡结合常数（equilibrium association constant），也即亲和常数，则有：k1和k2分别代表结合速率常数（association rate constant）和解离速率常数（dissociation rate constant），[Ag]、[Ab]、[AgAb]分别代表游离抗原、游离抗体和抗原抗体复合物的浓度 。null假设Ab0和Ag0分别代表抗原、抗体的初始浓度，B和F分别代表反应平衡时结合和游离抗原的%（以分数表示，B+F=1），则结合抗原AgAb也等于[Ag0]×B，于是[Ab]=[ Ab0－AgAb]=[ Ab0]－[Ag0]×B，[AgAb]/[Ag]=B/F。 则：因为F=1－B，上式也可写成该式展开，重排，即得B的函数式，为一元二次方程。同理，也可将R=B/F和B=F/（1+R）代入，或将B=1－F代入，得R和F的函数式 ，同样也都是一元二次方程。对每一特定的RIA系统，[Ab0]和KA是固定的，[*Ag0]也是固定的，所以B、R、F在直角坐标上随非标记[Ag0]呈双曲线走向定律 。当抗原的浓度使50%抗体形成复合物时，[AgAb]=[Ab] ：放射免疫实验方法的建立 放射免疫实验方法的建立 （一）、抗原纯化及标准品制备 1．抗原纯化的必要性：提供高纯度抗原是建立任何RIA法所必须的关键条件。 首先，用高纯度抗原制备RIA的标准品，使检测标准化并用它来监测生物样本的回收率 ； 第二，用高纯度抗原制备标记抗原，用作RIA的示踪剂 ； 第三，用高纯度抗原制备免疫原，以生产特异抗体。 null 在RIA系统中，最理想的是用作标准品的标记物的抗原，与待测的内源性抗原具有同一性，但两者间有时会出现种种差异。这些差异包括：（1）种族差异 ；（2）组织差异 ；（3）物质的多型性 。 由于抗原存在种种差异，在选用纯化抗原及评价RIA检测结果时，应予充分考虑。 null2．抗原纯化的方法 RIA中抗原纯度至少要求达90%以上，在采用免疫电泳法鉴定时，应仅出现一条抗原体结合的沉淀线，或在聚丙烯酰胺凝胶电泳中只出现一条区带。抗原纯化的方法有以下3种 ： （1）理化方法 包括盐析法、有机溶剂抽提法、离子交换法、凝胶过滤法、各种电泳分离法以及各种层析分离法等。 （2）免疫方法 包括解离法、戊二醛固相吸附法及亲和层析法等，采用单克隆抗体的免疫吸附柱的纯化效果更为理想。 （3）理化法与免疫法相结合 此为最常用的方法，纯化效果亦较好，一般是先用理化法提纯抗原，然后再用免疫法进一步纯化。null3．标准品的制备 用作标准品的物质除应具有高纯度外，还须具有相当的稳定性，标准品的制备原则如下： （1）同批制备大数量的标准品 ：为避免不同实验室或不同时间制备的标准品出现变异，应同批制备供应许多实验室且至少够用一年以上的公共标准品 ； （2）在标准液中保持足够量的蛋白质 ：当其本身的蛋白质浓度不够时，可加入一定时的载体蛋白以提高抗原的稳定性，还可防止反应试管对微量蛋白的吸附，以提高检测的准确度 ； （3）制备一套不同梯度浓度的标准品时，采用“容积交换法”，即各个浓度的标准品，都应从一个总标准品来独立制备，以免除倍比稀释法所致的累积误差。 null（二）、抗体的制备 RIA法的特性在很大程度上取决于抗体的特异性和亲和力，而抗体的特异性又主要取决于免疫原上的抗原决定簇 。 1．免疫原 免疫原与抗原的概念不同，抗原是指能和专一抗体相结合的物质；而免疫原是指那些能引起主动免疫反应的抗原，即注入动物体内能诱发产生抗体的物质。抗原必须具备下列性质才可用作免疫原： （1）分子量大 一般说，物质的免疫原性与其分子量直接相关，但免疫原性并不仅仅取决于分子量，还要求具有一定的复杂结构 ；（2）异己性强 ，抗原蛋白质的氨基酸排序与被免疫动物体内蛋白质结构差别越大，其免疫原性越强 ；（3）分子的立体构型，当抗原氨基酸排列相同时，由于立体构型能把抗原决定簇暴露在外，则免疫原性强 ；（4）溶解度小 在水中溶解度小的免疫原易诱发免疫反应 。null2．半抗原 ：本身不具备免疫原性，当它们以共价键结合到载体物质上才具有免疫原性 。如甾体激素、甲状腺激素及前列腺素等多种小分子物质 。通常使半抗原的羧基与载体蛋白质的氨基间形成肽键，若半抗原不含羧基，可使用偶联试剂作为半抗原与载体间的联接桥梁。 （1）载体物质的选择：①蛋白质类，蛋白质是首选的优良载体，常用的有含较多赖氨酸的牛血清白蛋白（BSA）或人血清白蛋白（HSA）、血蓝蛋白、卵清蛋白、兔丙种球蛋白等，至于使用何者易获高质量抗体，须通过试验来选择；②非蛋白类 ，将半抗原与含较多自由氨基的聚赖氨酸联接 ，优点是排除了抗蛋白抗体所引起的交叉反应的干扰 ；③其他 ，将多肽激素半抗原静电吸附于大分子聚合物可溶性颗粒上，也可诱发动物产生优质抗体。常用的载体有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素、乳胶等 。null（2）联接位置 半抗原联接载体的位置对抗体的特异性至关重要，该联接位点必须远离抗原决定簇，才能对动物产生免疫刺激。 （3）联接方法 常用的方法有下列几种。 ①碳化二亚胺法 碳化二亚胺的化学性质很活泼，将其加入到按一定比例混合的半抗原和蛋白质溶液中，经一定时间内的反应，即形成CO—NH键而结合。是应用最广的方法。 ②戊二醛法 戊二醛可促使半抗原的氨基与蛋白质的氨基以共价键结合。 ③混合酸酐法 有的半抗原（如类固醇）无羧基和氨基，可先使其与琥珀酸酐反应生成带羧基衍生物，再与蛋白质上的氨基以共价键结合。null3．抗血清的制备方法 制备抗血清的方案有多种，可以根据具体情况选用不同的方案，但应注意： （1）免疫原的剂量 一般认为不存在一个简单的免疫剂量应答关系 。但是1 mg以上的大剂量易使动物产生耐受，对第二次及其后的加强注射不发生应答。 （2）佐剂的使用 “完全福氏佐剂”与抗原之比应等于或大于2:1（V/V）。 （3）免疫动物的选择 多选用家兔或豚鼠；若须收获大量抗血清（1L以上），可选用羊、马等大动物。 （4）免疫途径 皮下注射应用最广，也常用皮内多点注射法。 （5）注射及收集抗血清的时间 基础免疫后2周加强免疫一次，免疫原用量减半，2周后再加强免疫一次，经7—10天抽血，测定抗体效价。以后2～3个月内再加强注射1～2次。若采血测定结果显示抗血清效价已达到标准，可大量采血 。null4．抗血清的质量鉴定 经免疫流程获得的抗血清，应经过特异性、亲和力和滴度三方面的鉴定，从中挑选优质者用于RIA。 （1）特异性检验 是保证RIA准确性的必要条件，通常是用抗体与抗原及其结构类似物的结合力比值的百分率，即交叉反应率来表示。 （2）亲和力 抗血清亲和力的大小可用抗体的亲和常数（K值）来表示。 K值愈大，检测的灵敏度愈高，故在RIA中，应尽量选用K值高的抗血清。 （3）滴定测定 抗血清的使用滴度通常以能与50%示踪剂结合的抗血清稀释倍数的倒数来表示。应根据实践要求的灵敏度和检测范围，通过抗血清稀释曲线来选择抗血清的工作滴度，同时调整标记抗原的用量，使之匹配及符合实际要求。 null（三）、放射性标记物 用高纯度抗原制备标记抗原，用作RIA的示踪剂。常用的标记核素有125I和3H。分离纯化后的标记抗原需要进行质量考察： 放射核纯度 放射化学纯度 放射性比活度 生物活性和免疫活性 标记位置和定量分布情况null（四）、分析方法 1.反应方式 (1)．平衡加样法（balance assay）反应的时间较长，灵敏度相对较差，但操作方便，精密度较好。 (2)．顺序加样法（sequential assay）目的是使非标记抗原与抗体结合的几率比标记抗原大，提高了非标记抗原的竞争的能力，使较少的非标记抗原就导致结合率有统计学上的显著差别，于是提高了方法的灵敏度。 2.反应条件的优化 对缓冲液的pH、离子强度等需要进行优化；另外，在缓冲体系中加入一定量的血清、BSA、EDTA、叠氮化钠和其他的一些添加剂对反应的进行都有一定的好处。null反应的温度和时间 抗原、抗体反应最终达到平衡所需的时间受反应温度的影响，反应温度每升高10℃（不超过37℃），抗原抗体结合达到平衡的速度约提高一倍，达到平衡的时间就会缩短。但温度升高会使KA值略有下降，尤其是对于某些特定的分析系统，KA值有明显的温度依赖性，降低温度有利于提高KA值，增加灵敏度。因此，在选择反应的温度和时间时，要在不同的温度、时间条件下进行实验加以对照，综合评价，获得合适的温度和时间的搭配参数，然后根据需要灵活选择，以满足实验室和临床诊断的要求。待检样本量多时，可采用以下方法，如在低温下操作，加样时间尽量缩短（必要时可使用连续加样器），在样品管的一定间隔内再插入质控管，快速分离等加以避免。null（五）、分离技术 在放免分析中，当抗原、抗体反应达到平衡后，必须将游离部分（F）与结合部分（B）分离，分别测定其放射性。因此能否选择合适的分离技术，将会直接影响分析结果的精密度和准确度。 理想的分离技术应兼备以下几点： ①将B与F尽可能完全分离，并且不改变最初的平衡状态； ②B与F的分离不易受血浆或血清等外界因素的干扰； ③分离试剂廉价易得，操作简便、分离迅速、重复性好。 null1.双抗体法（double antibody method） 在RIA中，当抗原、抗体反应达到平衡后，由于抗原和抗体的浓度都很低，抗原-抗体复合物的浓度也很低，而且处于可溶性状态，不能直接通过离心的方法加以分离。在反应体系中加入第二抗体，形成抗原-第一抗体-第二抗体复合物，通过离心沉淀下来。 双抗体法的主要缺点是分离时间长，第二抗体用量多，易受反应环境中蛋白质及盐含量的影响。 2.沉淀法（precipitation method） 在一般RIA中，反应体系pH值多为中性附近，接近蛋白质的等电点，γ球蛋白所带的电荷很少，形成水化层的能力较弱，当加入适当浓度的聚乙二醇或碱金属中性盐例如硫酸胺等，夺取其周围的水分子，使它失去水化层，从而将抗体γ球蛋白[B]沉淀下来，与游离部分的抗原分离。这种分离方法的优点是操作简便，并且有些抗原也可能被同时沉淀下来，所以，非特异性结合高。null3.双抗体+PEG的分离方法（double antibody+PEG method） 是目前被广泛应用的一种方法，它兼顾了双抗体法和沉淀法各自的优点，克服了双抗体法分离时间长和沉淀法非特异性结合高的缺点，并且，使第二抗体和PEG的用量大为减少，在常温下加入分离剂后，无需温育，直接离心，可获得满意的结果。 4.吸附分离法（adsorptive separation method） 应用经过特殊处理的吸附剂，将游离的抗原或半抗原吸附，经过离心，随吸附剂的沉淀，将F沉淀下来，而抗原-抗体复合物分子大，不被吸附，仍保留在溶液中，从而将B与F分离开。常用的吸附剂有葡聚糖包被的活性炭（DCC），离子交换树脂，羟基磷灰石，硅酸盐等。吸附分离法简便快速，价廉易得，不足之处是非特异性结合偏高。 null5.固相分离技术（solid phase separation method） 这种分离技术是将抗原或抗体（包括第一抗体和第二抗体）通过特殊技术联接在固相载体上，免疫反应在固相载体上完成，达到平衡后形成固相的抗原-抗体复合物，可与游离部分分离 。 固相分离技术的主要优点是操作简便、迅速，分离效果好，非特异性结合低，是一种比较有前途的分离方法。 6.磁化分离技术（magnetizing separation technique） 磁化分离是将磁化材料引入RIA体系，当反应达到平衡后，借助磁力将B与F分离，从而省去了离心的步骤。这种分离技术由于磁化材料的不同，分离的方法也不相同。 磁化分离技术操作简便，快速，分离完全，非特异结合低，重复性好，不用离心，设备相对简便，便于推广。 null7.葡萄球菌A蛋白分离法（staphylococal protein A separation method, SPA method） 多数金黄色葡萄球菌细胞壁中含有A蛋白可以和结合型抗原－抗体复合物（B）结合，通过离心，将结合部分沉淀下来。 8.微孔滤膜法（millipore filter method） 微孔滤膜通常采用醋酸纤维素滤膜或玻璃纤维滤膜，在放免反应达到平衡后，将反应液加入有微孔滤膜的滤器上，抗原抗体复合物保留在滤膜上游离部分被滤掉。null（六）、数据处理 放射免疫分析的数据处理是以标准品的检测结果为依据，拟合出标准曲线，再通过标准曲线求出待测样本的检测结果所对应的浓度值。 （七）、方法考核 常用的评价指标有精密度、准确度、特异性、灵敏度、稳定性、有效性。null1．精密度（precision） 精密度是指在相同条件下，对某一样品多次检测所得结果的符合程度。 （1）平均批变异系数（ABCV）：指该批所有检测标本（包括标准管、待测管、质控管）变异系数的均值 。 （2）反应误差关系（RER）：用多指复管计数的历史资料构成大样本（如含复管200对以上），用回归方法建立样品计数误差SD（N）与计数N之间的函数关系，称为反应误差关系（RER）。一旦建立了自己系统的RER，随机误差的估算便不再依赖复管实测计数N1、N2进行计算，而是直接将复管计数均值N代入RER函数，求得计数误差的理论估算值，从而获得浓度可信限CCL（X）和精密度图。 （3）精密度图（precision profice，P-P图） null2．准确度（accuracy） 准确度是指测量值与真值的接近程度，评价方法如下： 回收率（recovery rate）的测定：回收率是反应测定值偏差的质控指标，测定方法是设回收管和对照管，对照管中加入待测样品，回收管中加入待测样品和已知量的分析物，经过测定全过程，比较已知量和测得量之间的一致程度，理论上回收率一般以90%～110%之间 。 3．灵敏度(sensitivity) 灵敏度是指刚能与不含有标准配体的零标准管的测定结果在统计学上区别开来的最低浓度，即应用该方法时的最小可测值，计算方法是累积多批(一般为10次)测量结果，计算出零标准管的结合率为x-2SD时对应的剂量值，即为灵敏度，由此可见，方法的灵敏度和精密度有一定关系，当精密度好时，零标准管的结合率较高，对应的浓度值较小，即最小可测值较小，灵敏度较高。 null4．稳定性(stability) 稳定性是指测定试剂在合理保存和正确使用的条件下，在的有效期内，保持其全部原有性能不变能力，常用指标有：零标准结合率(Bo%)、非特异性结合率(NSB％)、标准曲线直线化转换后的截距、斜率、相关系数、ED25、ED50、ED75和质控图等，这些指标在连续工作条件下，应保持恒定。 5．特异性(specificity) 特异性是指该反应体系不受干扰物质影响的程度，反应的是对分析物测定的专一程度。常用的指标是交叉反应率。交叉反应率越小、反应体系对分析物测定的专一性越好。 6．有效性(effectivity) 有效性主要指临床诊断符合率及临床使用评价、检测结果能有效地实现实验目的，应有可信的正常值及正常范围，在正常和异常之间应有良好的分离，以便得出结论，如有些要作有或无、阳性或阴性的回答，有些要确定浓度的高低等。 7．健全性(perfectly) 健全性一般借助于标准曲线与样本稀释曲线的平行性分析来判断，做法是将一份待测样本经一系列倍比稀释后，进行测定，如果各稀释度测定值在标准曲线上，或其连线与标准曲线平行，则说明被测样本与标准品具有一致的免疫活性，也说明被测样本的测定值不会因稀释度不同而发生变化，方法的健全性很好。RIA分析方法的应用RIA分析方法的应用（1）甲状腺的激素与自身抗体的含量测定； （2）性腺和胎盘激素类的含量测定；如雌二醇（E2）、雌三醇（E3）、促滤泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）、人胎盘泌乳素（hPL）的检测、绒毛膜促性腺激素（HCG—β）等； （3）垂体激素类的测定：促甲状腺素（TSH）、垂体泌乳素（PRL）； （4）肿瘤诊断方面 检测血清AFP以诊断肝癌、检测血清CEA以监测结肠癌等多种癌瘤的扩散、复发或转移等 （5）心血管疾病诊断方面 检测血清肌红蛋白可早期诊断急性必肌梗塞；血浆肾素-血管紧张素-醛固酮系统的RIA法的建立，对高血压病、醛固酮增多症的分型和鉴别诊断有相当大的价值。