肝干细胞分析研究进展

肝干细胞分析研究进展 吴燕综述；张津铭审校 (湖北大学生命科学学院，武汉，湖北430062) 摘要：近年来干细胞研究成为生物医学领域研究的热点。肝干细胞是一种具有双向分化能力和自我更新能力的 细胞，参与肝脏生长、发育与再生。肝干细胞分化的过程和机理较为复杂，利用肝干细胞进行细胞移植与生物人工 肝治疗各种终末期肝病被认为是最有前途的之一。本文综述肝干细胞领域近年来研究进展。 关键词：肝干细胞；研究进展；肝卵圆细胞；小肝细胞；肝母细胞；胚胎干细胞 中图分类号：R318 文献标识码：A 文章编号：1005．5673(20lo)02．0082．03 肝干细胞的可塑性及其分化机理的研究在基础 理论和临床应用等方面均有重要意义。一方面，肝 干细胞可能参与肝脏损伤的修复与重建，研究肝干 细胞的分化机理有助于阐明肝脏的发育机制；另一 方面，肝干细胞分化为具有功能的成熟肝细胞，将为 肝细胞移植和生物型人工肝提供了重要的细胞来 源。同时，阐明这些问也可为临床肿瘤等疾病的 基因治疗提供新的治疗手段⋯。肝于细胞分化的 过程及机理均较为复杂，关于肝干细胞分子免疫学 的研究成为肝干细胞研究的重要方面。肝干细胞的 基本特征可概括为两点：具有双向分化能力，可向肝 细胞和胆管细胞分化；具有自我更新能力。目前肝 干细胞范畴的界定还比较混乱，但较为一致的观点 是，卵圆细胞(Ovalcell)、胚胎肝细胞、小肝细胞和 骨髓造血干细胞都是肝干细胞的候选者。 1卵圆细胞 肝脏受损后的再生一般情况下由肝实质细胞分 裂增殖来完成，而当肝实质细胞严重受损不能增生 或受到有丝分裂原抑制剂损伤时，位于肝内低分化 的卵圆细胞即被激活，进一步增殖、分化为肝细胞和 胆管细胞来完成肝脏的结构与功能重建。卵圆细胞 在形态学和免疫组织化学方面与胆管上皮细胞相 似，形态呈卵圆形。Petersen等旧1建立了一种新的 促肝脏卵圆细胞增殖的小鼠模型，研究发现这种卵 圆细胞在达Sca．1、CD34及CD35的同时，还表达 A6及甲胎蛋白(AFP)，说明Sca．1、CD34及CD35是 小鼠肝卵圆细胞的特异标志。传统的造血干细胞抗 原如c．kit、fit．3、Thy．1及CD34等，在卵圆细胞上也 收稿日期：2009．12．25 作者简介：吴燕(1957·)．女，大学本科．微生物学与免疫学试验师。 E·mail：wuyanlSO@yahoo．cn 有表达，这说明至少部分肝卵圆细胞可能来源于骨 髓起源的前驱细胞。由于目前尚未发现肝干细胞的 特异性表面标志，故有关肝干细胞的分离纯化尚不 成熟，Fujikawa等一1利用绿色荧光蛋白(GFP)转基 因小鼠肝细胞的荧光活性纯化并富集肝干细胞，并 发现CD45(一)TER．119(-)AFP(+)的高表达GFP的 幼稚细胞具有增殖分化潜力，可以分化为肝细胞和 胆管细胞。肿瘤坏死因子(TNF)在肝干细胞的活化 及肿瘤的发生中有重要作用。Knight等H1观察到， 在缺乏胆碱而补充乙硫氨基酪酸饮食的大鼠卵圆细 胞增殖中，TNF具有正调节作用，同时卵圆细胞本身 也表达TNF。在TNF表达基因敲除的小鼠，卵圆细 胞的增殖被大大削弱，肿瘤的形成明显减弱。生长 因子受体酪氨酸激酶信号在正常肝细胞生长的调节 中具有重要作用。Kuroda等【51的研究发现，受体型 酪氨酸激酶家族中Tie．2-,c．Met、Flk．1在实验性大 鼠肝癌细胞中比正常肝细胞中显著增高。其中后两 者在GSTP(+)的癌前病变中过量表达，而Tie．2在 内皮细胞和卵圆细胞上有表达，考虑Tie．2、C．Met、 Flk．1与肝癌的发生有关。在人类肝脏，卵圆细胞 的数量随肝损伤的加重而增多。这种卵圆细胞的增 生是肝干细胞对肝损伤的反应，而不是受损肝细胞 的管样化生峥J。 2胚胎肝细胞 Cantz等⋯将胚胎13．5天的胎肝细胞用标记的 GFP移植到小鼠肝中，结果发现移植后胎肝细胞 AFP的表达逐渐降低，而白蛋白(ALB)的表达逐渐 升高。为了了解肝脏发育过程中肝干细胞标志的表 达情况，Fiegel等¨1选用干细胞标志Thyl和肝细胞 标志CKl8进行研究，分别选取胚胎第16、18、20天 及新生大鼠的肝脏分离提取肝细胞，采用磁珠分离 万方数据 法纯化胎肝细胞，结果发现在磁珠分离前，所有的胎 肝细胞均表达Thyl，磁珠分离后，仅有部分胎肝细 胞表达Thyl，而CKl8在磁珠分离前后的胎肝细胞 上均表达，表明在胎肝中有不同的肝细胞群同时存 在，其中一部分具有干细胞特征。Malhi等【91成功 分离人胎肝上皮细胞，在体外培养数月后，通过门静 脉移植入小鼠肝脏，在移植后l小时，小鼠肝脏中有 1．5％的移植细胞，继而发现14％一55％的移植细 胞进入小鼠肝脏，移植细胞占小鼠肝脏细胞总数的 1％。而在四氯化碳处理的小鼠肝内，移植的细胞出 现增殖并数量有所增加。 3小肝细胞 在惹卓碱处理的大鼠，2／3的肝被切除时，其肝 内小肝细胞可被激活并增殖、分化，能完全重建肝脏 的结构和功能。小肝细胞的形态与成熟肝细胞相 似，有较小的嗜碱性核，胞质中有空泡，有丰富的线 粒体、粗面内质网和糖原颗粒，能表达胎肝母细胞、 卵圆细胞和具有成熟肝细胞的部分分化标志，但又 与这些细胞不尽相同。在惹卓碱处理的大鼠，2／3 的肝被切除后的前5天，增殖的小肝细胞表达ALB、 转铁蛋白、H4抗原、OC2和OC5，但不表达OV6、 OC4和OCl0。2／3肝被切除后7天时小肝细胞的 分化标志即与完全分化的肝细胞相似。所以小肝细 胞被认为是不同于肝母细胞、卵圆细胞和完全分化 肝细胞的一种独立的有干细胞功能的细胞群。San． dler等研究发现¨0J，在肝切除后3～7天，小肝细胞 表达的肝脏富集的转录因子水平与成熟肝细胞表达 的转录因子水平完全不同，且小肝细胞不表达酪氨 酸转氨酶和a抗胰蛋白酶，而表达WTl和AFP的 水平增加；在肝切除后14天时，除AFP外，小肝细 胞表达的其它细胞分化标志与完全分化的肝细胞相 类似；而当肝切除后23天时，AFP的表达逐渐减少； 到肝切除后30天时，基本不表达AFP。此外他们还 认为，早期出现的小肝细胞不表达细胞色素P450， 而在细胞色素P450的作用下，惹卓碱被代谢为有丝 分裂抑制剂，因此小肝细胞有抗惹卓碱毒性的作用。 4骨髓干细胞 近年发现成年个体的造血干细胞可塑性很大， 可以分化为所有种类的组织细胞，造血干细胞不仅 能分化为血液系统细胞，还能分化为各种上皮细胞 如肺泡细胞和肝细胞。Petersen等【1u首先在大鼠中 发现一些骨髓细胞来源的卵圆细胞和肝细胞，研究 者将雄性大鼠骨髓细胞移植入经放射线致死量照射 的雌性大鼠，然后用2-乙酰氨基芴和四氯化碳损伤 83 此受体鼠的肝脏，肝损伤后9天，在受体鼠的肝脏中 发现了Y染色体阳性的卵圆细胞，而且在第13天 观察到一些Y染色体阳性的肝细胞。Avital等对骨 髓来源肝干细胞的研究发现【l2I，Thy．1(+)、B2．微 球蛋白(一)的骨髓细胞能分化为形态和功能都与肝 实质细胞相同的细胞；研究还发现，当培养体系中加 入含胆汁的血清时，这种分化的细胞可以将氨代谢 为尿素，通过电子显微镜及三维立体成像技术观察 这种分化细胞，其超微结构与肝实质细胞完全相同， 当经门静脉将这种骨髓细胞注入受体大鼠肝后，该 骨髓细胞即可分化为具有肝细胞功能的肝实质细 胞，而且在大鼠及人的正常肝脏及病肝中也可发现 Thy．1(+)、B2．微球蛋白(一)细胞的存在。所以 Thy．1(+)、岱2．微球蛋白(一)的骨髓细胞被认为具 有肝干细胞特征。国内姚鹏等¨副在开展的自体骨 髓干细胞肝内移植工作中，发现肝细胞生长因子 (HGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因 子(FGF)能促进骨髓干细胞的增生与分化。 Avital等¨卅将大鼠异体骨髓造血干细胞和成熟 肝细胞分别通过门静脉注入原位肝移植后发生排斥 反应的大鼠肝脏，结果发现约62％骨髓造血干细胞 定位于肝脏，而成熟肝细胞只有约2．5％定位于肝 脏，而且移植的骨髓造血干细胞表现出肝细胞和胆 管细胞的特征。Theise等的报道【l纠显示，人骨髓中 的造血干细胞也可以分化为肝细胞，用DNA特异性 探针在一例曾接受男性骨髓移植的女性病人肝脏中 发现有Y染色体阳性的肝细胞。而将曾接受男性骨 髓移植的女性病人肝脏再移植给另一男性患者，结 果在被移植另一男性患者肝组织中仍能发现有Y 染色体阳性的肝细胞，提示骨髓造血干细胞可以定 位于肝脏并分化为肝细胞。 5肝干细胞的分化机理 肝干细胞的分化是一个复杂的过程，是维持自 我复制或分化为成熟的功能细胞，取决于微环境、细 胞生长因子等多种因素的相互作用与平衡。具体来 说，肝干细胞分化与增殖的调控因素主要有：①生物 钟，通过改变细胞周期促进因子或抑制因子的水平， 决定干细胞的分裂次数。如Cul．1蛋白是一种细胞 周期促进因子，它与细胞周期蛋白Gl的破坏有关， 而P27是一种抑制因子，它促进干细胞分化并抑制 其增殖；②微环境。Grisham等【1叫将肝卵圆形细胞 移植到大鼠肝组织时可分化成为肝实质细胞，卵圆 形细胞经皮下移植时常可形成易转移和分化程度低 的肿瘤，其原因可能是皮下基质抑制卵圆形细胞分 万方数据 邀生物堂鱼瘥堂进屋兰Q!Q生筮!墨鲞箜2翅￡咝垫丛地!尘丝!鲤坚磐!丛型至Q!Q：!丛：兰墨堡旦：2 化为肝细胞，因而促进肿瘤的形成；③生长因子和细 胞外基质在肝干细胞分化为肝实质细胞的过程中具 有重要作用。Suzuki等m1报道，HGF可诱导白蛋白 阴性的肝干细胞转变为白蛋白阳性的肝祖细胞。此 外，肝细胞核因子HNFl、HNF．4a、HNF．3B、HNF．6 等转录因子对肝干细胞的分化调控都可能起重要作 用。 6结语 综上所述，有关肝干细胞活化、分离培养、筛选 及鉴定的机理和技术等目前均尚不成熟，肝干细胞 的研究仍有待进一步发展和完善，但可以肯定其分 子机制将是未来研究的主要内容，而分子免疫学将 会在未来肝干细胞研究中扮演其重要角色。 参考文献： [1】BhmHM，BmzdtonTR。WeimannJM．Theevolvingconceptofa stemcell：entityorfunction[J】．Cell2001。105(7)：829—841． [23PetersenBE，GresslⅪrdB，HatchHO．MouseA6-posi-tivehepatic ovalcellsalsoexpressseveralhematepoieticstemcell眦rI【哪[J]． Hepatology2003，37(3)：632-640． [3]FujikawaT。HimecT。FujiiH．Purificationofadulthepaticpro- genitorcellsusinggreenfluorescentprotein(GFP)-transgenicmice smifluomecence-activatedcellsorting[J]．JHepatol2003，39 (2)：162-167． 【4]KnightB，YeohC,C，HuskKL．Impairedpmnecplasticch∞gesand liverturnerfornnationin tumornecrosisfactorreceptor typelknockoutmice[J】．JExpMad2000。192(12)：1809· 1818． [5]KuredaH。}Itmlrua0，FutakuehiM．Distinctivegeneex-presoion 0freceptortypetyrosinekinasefamiliesduringrathepato-caroino- 萨nesis[J]．IntJMolMed2002，9(5)：473·480． 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