腹腔镜手术对大肠肿瘤微转移的影响

福建医科大学 硕士学位 腹腔镜手术对大肠肿瘤微转移的影响 姓名：刘晓东 申请学位级别：硕士 专业：外科学 普通外科 指导教师：罗琪 20090301 腹腔镜手术对大肠肿瘤微转移的影响 中文摘要 目的：探讨大肠肿瘤术后淋巴结和外周血的微转移情况，借此比较腹腔镜手 术和传统开腹手术对大肠肿瘤微转移的影响。 方法：回顾性研究DUKE’SC期大肠肿瘤病例40例，经术前检查证实均为 达CEA病例，实验组18例行腹腔镜手术，对照组22例行传统开腹手术，免 疫组化方法检测常规病理阴性的淋巴结中CEA的表达，计算两种术式的淋巴结 转移漏诊隋况。同期研究大肠肿瘤手术病例108例，实验组52例行腹腔镜手术， 对照组56例行开腹手术，12例健康志愿者同时抽血作阴性对照，RT．PCR方法 检测术前术后外周血CKl9mRNA表达情况，计算各组病例外周血CKl9mRNA 表达水平的变化情况。借此比较两种术式对肿瘤微转移的影响。 结果：免疫组化检测淋巴结情况：腹腔镜组清扫淋巴结146枚，平均每例8．11 枚，常规病理阳性88枚，阳性率60．27％，常规病理阴性者表达CEA7枚，漏诊 率为12．07％；开腹组清扫淋巴结182枚，平均每例8．27枚，常规病理阳性112枚， 阳性率61．42％，常规病理阴性者表达CEA19枚，漏诊率为27．14％。两组淋巴 结清扫情况及常规病理结果没有明显差别(P>0．05)，二者漏诊率差别有显著性 意义(尸0．05)，B期、C期变化情况差别显著(尸<0．01)，有统计学意义。 结论：腹腔镜手术在大肠肿瘤根治、淋巴清扫方面和传统开腹手术相比没有 明显差别，是～种可以值得推广的术式。但同传统开腹手术相比，腹腔镜手术对 肿瘤周围淋巴结和外周血液微转移的影响明显小于开腹手术，在减少大肠肿瘤术 后复发和转移方面更有意义。 关键词 结直肠肿瘤腹腔镜微转移CEACKl9mRNA EffectofLaparoscopicSurgeryOllMicrometastasisof ColorectalCancer Abstract Objective：Toinvestigatemicrometastasisinlymphnodeandperipheralblood afterthecolorectalcancerandthenthedifferenceofmicrometastasisofcolorectaI cancerbetweenlaparoscopicsurgeryandopencolorectalsurgerywascompared． Methord：FortycolorectalcancerofDUKEstageCdatawhichwereprovedtO beexpressingCEAwereanalyzedbyretrospectivestudy．Theexperimentalgroup dataof18patientsacceptedlaparoscopiccolorectalsurgeryandthecontrolgroupdata of22patientsacceptedopencolorectalsurgery．TheexpressionofCEAoflymph nodeweredetectedbyimmunohistochemistry,andthemisseddiagnosisoflymph nodemetastasisWasrecordedandanalysed．Onehundredandeightcolorectalcancer datawerestudyedatthecorrespondingtimeperiod．Theexperimentalgroupdataof52 patientsacceptedlaparoscopiccolorectalsurgery，thecontrolgroupdataof56 patientsacceptedopencolorectalsurgeryandthenegativecontrolgroupdataof12 patientswashealthvolunteer．TheCKI9mRNAexpressionratiobetweenpreoperotive peripheralbloodandpostoperativeperipheralbloodwasdetectedbyRT-PCRandthe CK19mRNAexpressionratiovarianceofperipheralbloodineverygroupsWas accounted，thentheinfluenceofthetwooperationwaysinthemicrometastasisof colorectalcancerwerecompared． Result：TheresultofSPdetectioninlymphnode：146lymphnodeswas obstained(8．11 nodesonaverage)inpatientsacceptedlaparoscopiccolorectalsurgery， 88ofthemwaspositiveinpathologyexamination(60．27％)．8ofnegativein pathologyexaminationwaspositiveinCEAexpression(rateofmisseddiagnosis： 13．79％)．182nodeswasobstained(8．27onaverage)inpatientsacceptedopen colorectalsurgery,l12nodesWaspositiveinpathologyexamination(61．42％)，19of negativeinpathologyexaminationwaspositiveinCEAexpression(rateofmissed diagnosis：27．14％)．Thereisnodifferenceinlymphnodedissectionandphthology 2 examination(P>O．05)，andsignificantdifferenceinmisseddiagnosis(P<0．01)between twogroups．TheCK19mRNAexpressionratiobetweenpreoperotiveperipheralblood andpostoperativeperipheralblood：AstageO．153+0．078，Bstage0．287+0．032，Cstage 0．361+0．089，Dstage0．192--匕0．051 inexperimentalgroup；Astage0．097+0．043，B stage0．287+0．032，Cstage0．3614-0．089，DstageO．1924-0．051 incontralgroup．The stagingwasdoneaccordingDUKE、S．TherewasnotdifferenceinAstageandDstage (尸>O．05)，butWassignificantdifferenceinBstageandstage(尸<0．01)betweentwo groups． Conclusion：ThereisnodifferenceinradicalCUreandlymphnodedissection betweenlaparoscopicsurgeryandopencolorectalsurgery．Thelaparoscopicsurgeryis anoperationwaythatisworthyofpopularizing．Incontrastwithopencolorectal surgery,themicrometastasisinlymphnodearoundthecancerandperipheralblood waslessobviouslyinlaparoscopicsurgery．Ithasmoresinificanceinreducing metastasisandrecurrenceafteroperation． Keywords：colorectalcancer；laparoscopicsurgery；micrometastasis；CEA； CKl9mRNA． 3 主要缩略词表 英文缩写 英文全名 中文全名 bp B-actin cDNA DNA Dntp HRP IHC KD mRNA OD basepair Beta-actin complementaryDNA Deoxyribonucleicacid 碱基对 p-肌动蛋白 互补DNA 脱氧核糖核酸 deoxynucleotidetriphosphates脱氧核苷三磷酸 Horseradishperoxidase辣根过氧化物酶 Immunohistochemicaltechnique免疫组化技术 Kilodalton messengerRNA opticaldensity 千道尔顿 信使RNA 光密度值 Poly-L-Lysi Poly-L-Lysine 多聚赖氨酸 RNA Rnasin Rpm SDS ribonucleicacid 核糖核酸 RNAinhibitor 核糖核酸酶抑制剂 rotateperminute 每分钟转速 Sodiumdodecylsulphate十二烷基硫磺酸钠 SDS—PAGESodium—dodecylsulphate—p01yacrlam十二烷基硫磺酸钠一聚丙烯 DAB DMSO DEPC PBS RNase SPSS CEA CKl9 Rr．PCR diaminobenzidine 二氨基联苯胺 dimethylSulfoxide 二甲基亚砜 diethylpyocarbonate 焦碳酸二乙酯 phosphatebufferedsaline 磷酸盐缓冲液 ribonuclease 核糖核酸酶 statisticalpackageforsocial 社会科学统计软件包 Carcinoembryonicantigen cytokeratin 癌胚抗原 细胞角蛋白19 Reversetranscription-polymerasechainreaction逆转录一多聚酶链式反应 学位论文原创性声明和版权使用#授权

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# 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得 的真实成果。除文中己注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名(手写)： d月上日 导师签名(手写)： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构(如国家图书馆、中国学术期刊电子杂志社的《中国 优秀博硕士学位论文数据库》、中国科学技术信息研究所的《中国学位论文全文 数据库》等)送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权福 建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 作者签名(手写)： !半年上啦日 导师签名(手写)： 吐月翌日 ．“—釜 刖 声 结直肠肿瘤是危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤，而且发病率逐年上升， 有报道部分地区已跃升至恶性肿瘤的第二位¨1。虽然治疗方法不断改进创新，但 每年仍有许多患者死于此病。究其原因，肿瘤术后的复发和转移是最主要的致命 原因‘21。如果能早期、及时地发现肿瘤的复发和转移，给病人加以及时准确的 治疗，无疑可以大大降低肿瘤的死亡率，改善患者生存质量，延长患者生命。 腹腔镜手术是--fq新兴的外科技术，以其特有的创伤小、恢复快的优点而在 外科领域得以迅速发展u1，但是对于肿瘤的根治性手术，腔镜手术能否替代传统 开腹手术，经过众多学者的统计，在淋巴结清扫方面，腹腔镜手术和开腹手术没 有明显差别，这一点大家已经达成共识¨1；但在肿瘤术后复发转移方面，腹腔镜 手术和开腹手术是否有差别，尚无定论，有待进一步研究巧1。 肿瘤微转移是近些年临床医学领域研究的一个热点，因为微转移与否和早晚 直接影响到肿瘤的预后情况‘61。所有肿瘤的复发和转移均起源于早期的微转移， 如果能及时准确的发现肿瘤细胞的微转移，我们将可以尽可能旱、尽可能准确的 明确肿瘤的扩散情况，给患者施以积极有效的治疗，会大大改善患者的预后。 微转移(micro．metastases)是指在各种机体组织、体液及细胞移植物中检测到 的镜下及亚显微水平的肿瘤残留，常无任何临床表现，常规检查方法如CT、M鼬、 普通病理检查等方法不能检出的、隐匿在原发灶以外组织的、非血液系统恶性肿 瘤的转移盯1。 微转移的发生机制：一般认为肿瘤发生转移大致归纳为四个步骤玛1：(1)癌 细胞表面粘附分子减少。正常上皮细胞表面有各种粘附分子，它们之间的相互作 用有助于使细胞粘附在一起，阻止细胞移动。肿瘤细胞表面粘附分子减少使细胞 彼此分离。(2)癌细胞与基底膜的粘着增加。正常上皮细胞与基底膜的粘着是通 过上皮细胞基底面的一些分子介导的，如层粘连蛋白受体，癌细胞有更多的层粘 连蛋白受体，并分布于癌细胞的整个表面，使癌细胞与基底膜的粘着增加。(3) 细胞外基质的降解。癌细胞产生蛋白酶(如IV型胶原酶)，溶解细胞外基质成分(如 IV型胶原)，使基底膜产生局部缺损，让癌细胞通过。(4)癌细胞迁移。癌细胞借 阿米巴运动通过基底膜缺损处移出，癌细胞穿过基底膜后，进一步溶解间质结缔 组织，在间质中移动，到达血管壁时又以相似的方式穿过血管的基底膜进入血管。 4 但进入血道或淋巴道的肿瘤细胞未必都能形成有临床意义的转移，微转移的转归 取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境。多数肿瘤细胞 被机体免疫系统破坏，或发生凋亡，少部分进入休眠状态，极少数发生增殖。淋 巴结、血循环、骨髓中存在微转移，提示肿瘤不再局限于原发灶，有发展为远处 转移瘤的可能，但微转移灶可长期处于GO期或增殖与死亡处于平衡状态。只有 当机体遭受种种打击或免疫力下降时，休眠的肿瘤细胞才摆脱抑制状态而持续增 值，并发展为临床显性转移‘9·Ⅲ。 大肠癌最常见的转移方式为血行转移和淋巴转移。长期以来我们一直借助影 像检查和常规病理检测来判断肿瘤的进展情况，但这些检查都无法发现早期转移 的肿瘤细胞。近年来随着基础医学，尤其是免疫学及分子生物学的迅猛发展，使 我们对肿瘤的微转移检测成为可能11110微转移的检测分两个层面：蛋白检测和基 斟检测。 蛋白检测通常采用免疫组化的方法，选用针对肿瘤细胞特异标志物的抗体， 用显色剂标记，在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的成色反应，对组织 切片、细胞涂片进行染色，来检测标本中某种蛋白的表达，以达到微转移检测的 目的，并且可直接观察微转移细胞的形态／1210文献报道免疫组化技术可从l～10万 个淋巴细胞中找出1个肿瘤细胞。其诊断准确度及辨别率均优于常规组织切片染 色1131。 该方法具有简便、直观、灵敏度高、结果可靠等优点。目前临床上很多指标 的检测均采用此种方法。缺点是易遗漏而出现假阴性结果，需连续切片，单抗与基 质或炎症细胞交叉反应也可能使检测出现假阳性结果。还有采用放射免疫检测和 流式细胞仪等方法。上述方法有其优点，但对于血液中的微小转移则难以发现。 基因水平的检测：首推PCR和RT-PCR。此法相对免疫组化出现较晚，但发 展迅速，目前已被广泛应用于基础实验及临床检验中，其最大的优点在于可以进 行极微量物质(特别是基因)的检测。PCR技术FhMullis1985年发明并荣获诺 贝尔奖。。Kubota等¨41首次将RT-PCR技术用于胃癌微转移的检测。理论上PCR、 RT-PCR可在106～107个正常细胞中检测出1个癌细胞，已广泛应用在许多肿瘤 标志物的表达研究方面1151．具有高灵敏度、高特异性、高效率和污染小的特点， 邓君等¨印用该技术检测外周血CKl9mRNA的含量，发现对乳腺癌的诊断、治疗 和预后提供了更可靠客观的依据，被认为是目前检测微转移的最有效方法，尤其 对于血液中的微转移检测其有不可替代的优势，因为这种方法可以使极微量的物 质反复扩增，最终达到我们肉眼可视的结果1171。当然，上述方法也不是完美无 缺的，因为检测目标是基因，特别是采用RT-PCR检测RNA时，因其极不稳定， 在常规条件下非常容易降解，所以取材必须新鲜，标本处理要迅速，间隔时间不 能过长，提取RNA和反转录时随时都要防止RNA的降解。 不管是检测蛋白，还是检测基因，均要借助于特异性的肿瘤标志物来反映肿 瘤的微转移。肿瘤标志物是由肿瘤细胞生物合成、释放或者是宿主对癌类反应而 产生的一类物质。这种物质一般仍保持原来细胞的抗原性。在正常细胞不表达或 有微量表达，但在肿瘤发生时其含量要明显高出良性肿瘤或正常组织¨81。肿瘤 标志物种类众多。(1)特异性基因：肿瘤发生是多基因参与伴多步骤改变的复杂 过程，通常经过一系列基因改变后才能发展到具有潜在转移可能，包括染色体的 异常、基因点突变、基因缺失等等。正常组织一般不伴有这些改变，检测相关特 异性基因可诊断微转移。如p53、raS、DCC、erb．B2等等。(2)肿瘤特异性标志 物：指在肿瘤细胞中存在而在正常细胞中不存在，如CEA、AFP等，此类标志物 常用于淋巴结和癌旁组织的检测。(3)组织特异性标志物：指在肿瘤起源组织中 存在，而在其他组织中不存在，特别是在淋巴细胞和血细胞中不存在，如角蛋白 19(cytokeratin，CKl9)、CK8、CK20等，此类标志物常用于血液和骨髓的检 测。(4)转移特异性基因：肿瘤转移中常伴随某些基因改变或缺失，通过检测 可提示转移情况和判断预后，如nm23基因。(5)肿瘤伴随的病毒：某些病毒可 能导致肿瘤，检测到病毒基因或基因产物可协助诊断肿瘤及微转移。如人乳头状 病毒、T细胞白血病病毒等。 理想的标志物应同时具备高敏感性、高特异性，但这样的标志物几乎不存在。 癌胚抗原(Carcinoemb呵0nicantigen，CEA)是迄今为止临床上出现最早，应用最广 泛、效果最肯定的肿瘤标志物之一，尤其对消化道肿瘤有很强的特异性，仅在肿 瘤组织中表达，在正常组织中不表达，CEA作为大肠癌的一种辅助指标，在评估 大肠癌的预后、判断治疗效果及预测复发和转移方的应用价值，已得到国内外学 者的认同。关于CEA与大肠癌浸润、转移相关性的报道亦较多，鲁瑶等¨鲫的研 究发现，CEA与大肠癌浸润深度、淋巴结转移、血管侵犯、Dukes分期明显相关， 6 认为CEA与大肠癌的浸润转移密切相关。现在已成为肿瘤普查、术后复查及疗 效监测的常规指标1201。 细胞角蛋白(cytokeratin，CK)广泛分布在单层上皮细胞内，而间叶组织缺乏 角蛋白。在细胞恶性转化和肿瘤发生过程中，角蛋白继续存在于上皮性肿瘤内，间 叶细胞恶变后仍不表达角蛋白，这为角蛋白在肿瘤转移中临床应用提供了理论依 据1211。 CKl9是一种细胞角蛋白，对上皮细胞和上皮性肿瘤细胞有严格的特异性， 许多研究‘22·231表明CKl9在间叶组织(外周血、骨髓、淋巴结等)中无表达， 而在上皮性肿瘤组织中(乳腺癌、胃肠癌、肺癌等)稳定表达。近些年CKl9已 被广泛应用于乳腺癌、胃肠癌、肺癌等上皮性恶性肿瘤微转移的检测，显示了 很高的敏感性和特异性。 本实验旨在通过检测癌旁淋巴结中CEA的表达和肿瘤患者术后外周血中 CKl9mRNA的表达，分别来检测大肠肿瘤淋巴结和外周血的微转移情况，借此 进行腹腔镜和开腹两种术式的比较，比较二者在肿瘤根治、淋巴清扫及减少术后 复发和转移方面的差别，以期能尽早明确肿瘤的转移情况，为临床手术方式选择、 术后肿瘤分期和患者的后续治疗提供参考。 7 第一部分腹腔镜手术对大肠肿瘤淋巴结微转移的影响 免疫组织化学是根据免疫学原理，利用抗原抗体特异性结合及适当的显色 剂，对抗原进行定位及半定量测定的技术。本研究采用免疫组织化学法检测CEA 在肿瘤周围淋巴结中的表达，探讨肿瘤细胞的淋巴结微转移情况，借此比较两种 术式对微转移的影响。 一、材料与方法 l、标本来源 收集我院2004．2007年间经外科手术治疗的DUKE’SC期结直肠肿瘤病例 标本共40例，其中传统开腹手术22例，男性14例，女性8例，年龄23-85岁， 平均年龄52．3岁；腹腔镜手术18例，男性12例，女性6例，年龄25．79岁，平 均年龄50．1岁。术前抽血化验均为表达CEA的病例，其年龄、性别、病理类型 均没有统计学差别。术前全部患者均未化疗，收集每一标本的所有淋巴结，计数 后选取常规病理阴性的淋巴结，再次计数，组织标本经10％甲醛固定，石蜡包埋， 行4pm连续切片。 2、主要仪器及试剂 表1 免疫组化主要试剂名称和厂家 试剂名称 厂 家 兔抗人CEA单克隆抗体 即用型免疫组化EliVisionTmplUS试剂盒(鼠／ 兔) 聚赖氨酸Poly-L—Lysine 枸橼酸盐抗原修复液 DAB显色试剂盒 无水乙醇 福州迈新生物技术有限公司 福州迈新生物技术开发有限公 司 福州迈新生物技术有限公司 福州迈新生物技术有限公司 福州迈新生物技术有限公司 国药集团化学试剂有限公司 主要试剂配黄： (1)0．01％Poly-L—Lysine多聚赖氨酸：取Poly-L-Lysinel份，蒸馏水9份，充分 8 混合为多聚赖氨酸溶液。 (2)0．01M枸橼酸盐缓冲液(PH=6．O)：取枸橼酸盐抗原修复夜l份，蒸馏水499 份，充分混合为0．OlM枸橼酸盐缓冲液(PH=6．O)。 (3)0．02MPBS缓冲液：取Nacl9克，Na2HP047克，NaH2P040．5克，加蒸馏 水定容至1000mL，室温保存。 (4)95％酒精：取无水乙醇l份，蒸馏水95份，充分混合为95％酒精。 表2 免疫组化主要实验仪器名称和厂家 仪器名称 石蜡切片机 OLYMPUSCX2l生物显微镜 恒温烤箱 微波炉 ．20℃冰箱 厂家 德国Leica公司 日本OLYMPUS公司 北京东方仪器厂 INVERTER 山东海尔 主要器具处理： (1)玻璃器具消毒：吸管、各种容量玻璃瓶和培养皿经沸水煮泡后于重铬酸钾． 浓硫酸溶液中浸泡24小时以上，取出后自来水冲洗浸泡数小时，再用冲水 器冲洗30min，双蒸水涮洗三遍，烘干，封口包装后高压灭菌15磅30min， 120℃高温烤箱烘干2h (2)载玻片：将载玻片用自来水冲洗后，浓硫酸浸泡24小时，流动自来水冲洗 24小时，蒸馏水漂洗，蒸馏水浸泡过夜，60。C烤箱干燥，再置于多聚 赖氨酸防脱片剂中3分钟，烤箱干燥备用； 3、实验方法 本实验采用即用型免疫组化方法进行检测，主要操作步骤如下： (1)切片脱蜡水化：将切片置于60。C烤箱中烘烤l小时；放置100％的二甲苯中 脱蜡l小时；再于100％一95％酒精中浸泡各1分钟梯度水化； (2)自来水中浸泡1分钟后用蒸馏水冲洗三次，每次3分钟； 9 (3)切片置于500mlO．01M枸橼酸盐缓冲液(PH=6．0)抗原修复工作液中，加盖 放置85。C烤箱中修复过夜； (4)室温下自然冷却至室温后取出切片，PBS(PH=7．4)冲洗三次，每次3分钟； (5)每张切片加入50ul的聚合物增强剂，室温放置20分钟，PBS(PH=7．4)冲 洗三次，每次3分钟； (6)每张切片加入50ul的兔抗人CEA单克隆抗体，4摄氏度冰箱过夜，PBS (PH=7．4)冲洗三次，每次3分钟； (7)每张切片加入100ul新鲜配制的DAB显色溶液，显微镜下观察显色情况： (8)自来水冲洗，苏木素复染10秒，自来水冲洗，饱和碳酸锂返蓝5秒，自来水 冲洗； (9)95％--100％酒精中各1分钟梯度脱水，再用电吹风吹干； (10)待切片干燥后，中性树胶封片编号标记。 4、统计学分析 采用SPSSl3，0统计软件，两组病例淋巴结清扫情况采用t检验，常规病理 阳性率及漏诊率采用x2检验，检验水准Q=0．05。 二、实验结果 1．免疫组化结果判断

标准

excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载

CEA蛋白主要表达于肿瘤细胞浆中，在细胞膜周围和细胞浆中见到棕色或棕褐 色、弥漫分布的条状或环状物质者为阳性表达。选择5—10个高倍(X400)视野， 每个视野计数100--200个细胞，根据染色深浅程度及染色细胞百分率进行分析评 分，阳性细胞百分率：(a)oYr，≤5％；(b)1分，5％～25％；(c)25-)-，25～50％；(d)3 分，≥5l％。肿瘤细胞显色深浅按：(a)基本不着色。0分；(b)色淡为1分；(c)色中 为2分；(d)色深为3分。计算两者乘积，以得分≤3分为阴性，4～9为阳性表达。 所有切片均经仔细阅片两次，保证了结果的可重复性。 2、淋巴结清扫情况及常规病理转移情况 腔镜组共清扫淋巴结146枚，平均每例8．11枚，常规病理阳性88枚，阳性 率60．27％：开腹组共清扫淋巴结182枚，平均每例8．27枚，常规病理阳性112 10 枚，阳性率61．42％。二者比较，清扫淋巴结总数及常规病理阳性率均没有明显 差别。 表3：淋巴结清扫情况及常规病理转移情况 )(2=0．054；尸=0．816>0．05 3、常规病理阴性淋巴结的微转移情况(CEA表达情况) 开腹组常规病理阴性淋巴结58枚，CEA表达7枚，阳性表达在结肠癌的胞 浆中，呈棕色或棕褐色、条状或环状物质。表达率(即常规病理漏诊率)13．79％； 腔镜组常规病理阴性淋巴结70枚，CEA表达19枚，表达率27。14％。二者比较， 差异显著(尺0．05)。 表4：常规病理阴性淋巴结的微转移情况(CEA表达情况) )(2=4．453；户E0．035<0．05 豳1：HE染色×100倍 图2：空白对照×100倍 图3：阳性xtoo倍 幽4：阳性x400倍 图5：阴性×100倍 第二部分腹腔镜手术对大肠肿瘤外周血微转移的影响 聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)：由DNA聚合酶催化，利用 极微量DNA片段扩增，经过多个循环周而复始，使目的DNA片段达到扩增。 逆转录～聚合酶链反应(RT-PCR)先经过逆转录使mRNA转化成DNA，再进行 上述扩增的过程。是检测mRNA最常用的方法。 一、材料与方法 (一)标本来源 收集我院2007-2009年间经外科手术治疗的结直肠肿瘤病例共108例，其中 传统开腹手术56例，男性36例，女性20例，年龄28—83岁，平均年龄50．6 岁；腹腔镜手术52例，男性33例，女性19例，年龄30—75岁，平均年龄48．1 岁。均为术前肠镜活检病理确诊且未经过化疗，其年龄、性别、病理类型均没有 统计学差别。健康志愿者12例，平均年龄43．5岁。所有病例均征得患者同意， 于术前3天采集空腹外周血，采用标准穿刺技术，垂直拿管，低于患者手臂，为 防止穿刺针头上皮细胞污染，收集中段血3ml，立即加入经去RNase处理的抗凝 试管中，立即送实验室离心提取RNA。手术病例再于手术中肿瘤即将移除前采集 外周血3ml，方法同前。 (二)主要仪器试剂 仪器和试剂 厂家 RNAfastl000总RNA快速抽取试剂盒 二乙基焦磷酰胺(DEPC) 氯仿(分析纯) 乙醇(分析纯) AMV逆转录酶 TaqDNA聚合酶 RNA酶抑制剂Rnase dNTPs Maker Oligo(dt) DEPC 淋巴细胞分离液 CKl9引物 13．action 低温超速离心机 琼脂糖(Agarose) Du．650紫外线分光度计 紫外线透射仪 电热恒温水浴箱 PCR扩增仪 槽式电泳仪 深低温冰箱 可调式微量移液器 凝胶成像及分析系统 (上海飞捷公司) (GibcoBRL公司) (北京鼎国生物技术发展中心) (北京鼎国生物技术发展中心) (Promega公司) (Promega公司) (Promega公司) (Promega公司) (TaKaRa公司) (TaKaRa公司) (上海生工生物

工程

路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理

公司) (上海生工生物工程公司) (上海申友生物公司) (上海申友生物公司) (德国Heraeus．1abofuge400r) Promega公司 (美国产Beckman) (上海生物工程研究所) (湖北黄石医疗器械厂) (美国PE公司GeneAmpPCR) (日本) (日本SANYO公司) (德国EP公司) (英国UVltec公司) 16 (三)实验方法 1、引物的设计与合成 登陆PubMed，搜索6enebank数据库人CKl9基因序列，利用Primer Premier5．0软件辅助设计引物序列，所有引物包括内参13一actin引物均由上海 申友公司合成。其中CKl9扩增片段为314bp，13actin扩增片段为184bp。引物 序列见表5： 表5：CKl9基因及内参照B．actin基因引物序列 2、实验步骤 RT-PCR试剂配置： 1)75％乙醇的配制：75ml无水乙醇加入25ml无Rnase水，4。C冰箱保存TAE5x 的配制：Tris1089，EDTA9．39，硼酸559，加双蒸水至800ml，搅拌溶解，再加 水至1000ml，4"C冰箱保存。 2)无核酶水的配制；1ml--基焦磷酰胺(t)EPC)2UX2蒸水至1000ml，37"C 水浴2tJx时后，121℃20min高压灭菌，4℃冰箱保存。 3)l％、2％琼脂糖电泳胶板配制：用电子天平准确称取0。59(1．0g)琼脂糖 倒入三角烧瓶，加IxTAE50ml，置微波炉加热至完全溶解，补充加热丢失的水 分，待稍冷却为60"C后即倒入已装配好的电泳板，自然降温凝固。 4)引物的配制：粉剂打开盖之前先12000rpm离，t二,5min，溶于一定量的无菌 去离子水中，使其终浓度为109mol／L，并以此为工作浓度。．30’C冰箱保存。 实验准备： RNAfastl000．，O。,RdqA快速抽提试剂盒，氯仿，75％7,醇，DEPC水。所用的 加样枪用75％7,醇擦洗，各类枪头和1．5mL的离心管均提前一天高压，操作前台 面照紫外半小时。 操作步骤： 1)收集的血液标本采集回来立最lJ4000rpm离一tl,5min，去上清，用预冷0．0I mol／LPBS洗两遍，12000rpm离一t∑,lmin，弃上清； 2)预冷PBS重悬细胞浓度大于l×107／1009l，充分吹打直至没有细胞团块， 取1009l放),、．eppendo艚中； 3)处理好的样本中，加入RBl液lml，充分颠倒混匀直至完全溶解，室温放 置5min： 4)加入氯仿200I_tl，充分颠倒混匀lmin，成均一的乳糜状，离-t],5mim 5)将上清液小心转移至llRNase—free的1．5mieppendor俚(离心分层后，可以 吸取上层无色液体约为350I．tl，注意不要吸取任何中间层物质)； 6)加入RB2液3509l，充分颠倒混匀lmin； 7)将混匀后的液体吸入或直接倒入内套管，离一t二,lmim 8)弃去外套管中液体，内套管中加入500gl洗液，离一t二,lmin，再重复此过 程洗一次； 9)取出内套管，弃去外套管中液体，仍然套回内套管，不加洗液，离一IL,lmin； 10)将内套管移入新的eppendor借中，在膜中央加入洗脱液(或PH>7．O的 DEPC处理水)25．509l，室温静置lmin，离一L,lmin，获得总RNA。 3、RNA浓度测定及纯度分析 1)RNA浓度测定 所提取的RNA溶液用DU650可见紫外分光光度计进行核酸浓度测定。EP管 中加入luLRNA溶液和59uLDEPC水，充分混匀后移入石英比色杯，以60uL DEPC水作为空白对照，读取260nm波长下的吸光度值。按照下面公式计算RNA 浓度： A260nm光密度值×40×60／1000=u∥laLRNA 2)A260／A280的比值分析 RNA进行浓度测定的同时读取紫外分光光度计280nm波长下的光密度值，计 算A260／A280的比值，纯RNA样本的A260／A280的比值一般介于1．8—2．0。如低于 1．8，表明可能存在蛋白质污染；如大于2．2，说明RNA已经被降解。 3)RNA电泳 配制1％琼脂糖凝胶，50倍TAE电泳缓冲液稀释成l倍，更换旧的电泳缓冲液。 18 取4laLRNA混入lpL荧光染料、luL6×loadingbuffer(上样缓冲液)，120V电 压，电泳15分钟。UVIPRO凝胶成像系统拍照电泳结果。琼脂糖电泳应该出现 明显的28s、18s条带，隐约可见5s条带。 4、两步法RT-PCR 1)逆转录反应： RNA 11．5UL Oligo(DT) 2laL 混匀，离心，PCR扩增仪上70℃5min，冰上冷却，并短 暂离心； RNaseInhibitor 0．5IlL 5×反转录缓冲液4taL 10mmoULdNTP 1止 M—MLV l此 42℃反应60min，70℃变性10min。 2)聚合酶链反应(PCR) 一“ 反应体系： cDNA luL MIX 10此 上游引物 0．5uL 下游引物 O．5IlL 士I[IDEPC水至20uL PCR扩增条件设置：94*(2预变性5min，使模板DNA完全变性；循环条件， 94"(2变性30sec，55"(2退火30sec，72℃延伸lmin，35个循环；最后72"(2维持10min， 使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 5、琼脂糖凝胶电泳 配制2％琼脂糖凝胶，50倍TAE电泳缓冲液稀释成l倍，更换旧的电泳缓冲液。 取扩增产物4此，内参照13一actin49L，6×LoadingBuffer2pL、荧光染料2止，混 匀后加样于2％琼脂糖凝胶点样孔中，电压l10V，电泳时间20min。UVIPRO凝胶 成像系统分析照相。 使用Quantityone软件读取目的基因电泳条带的光密度值，并与B—actinl内参 19 基因的光密度值相比，此比值代表目的基因的相对表达量。 (四)统计学分析 用各组检出率的比较用独立样本t检验，数据采用SPSSl1．5统计软件分析 P<0．05为差异有显著性。 二、实验结果 大肠癌患者外周血中CKl9mRNA的表达阳性率：腹腔镜组为55．77％ (29／52)；开腹组为53．57％(30／56)。而12例健康志愿者的外周血均无表达。 统计学分析表明：大肠癌患者与健康志愿者外周血CKl9mRNA表达的差异有显 著意义(尸<0．01)。 表6：大肠癌患者与健康志愿者外周血CKl9mRNA的表达情况 表7：开腹组和腔镜组术前术后CKl9mRNA和B．actinmRNA灰度值比 表8：开腹组和腔镜组术前术后CKl9mRNA和13．actinmRNA灰度值比差值 组别 灰度值比差值 开腹组 腔镜组 0．171+0．074 0．310a：0．110 仁5．74269P<0．们 表9：按DUKE’s分期开腹组和腔镜组 术前术后CKl9mRNA和0．actinmRNA灰度值比差值 tAM．089P>0．05a tB--6．604P<0．01：tO=5．柏1P<0,01；tD=0．767P卸．05 术 前 tim=-- 图5部分RNA的凝腔电泳 讨 论 大肠癌是我国常见的消化系恶性肿瘤之一，近些年随着生活水平的不断提 高，高脂肪、高蛋白饮食不断增多，再加上各种污染的不断加剧，发病率不断上 升，而且有年轻化的趋势124]。虽然临床上很多治疗方法(包括外科手术、内科 药物化疗、射线放疗和免疫治疗等)不断进步，但患者的生存期仍未有明显提高， DukesA，BI期5年生存率为85％一90％，DukesB2期为75％．80％，DukesC期 为25％．30％，约有33％的患者复发，50％患者死于肿瘤转移125]。可见淋巴结阳 性的患者，约有70％的病人在术后5年内死于肿瘤转移或复发。转移是影响结直 肠肿瘤预后的最主要因素之一，也是决定肿瘤分期和制定个体化治疗方案的主要 参考指标。 腹腔镜手术是近20年来新兴的一种外科技术，以其特有的创伤小、恢复快 的优点而在外科领域得以广泛迅速发展。目前已广泛应用于普外科、泌尿科、妇 科、胸外科和骨科等很多临床科室。腹腔镜虽然已在很多临床科室都得到广泛应 用，但是对于肿瘤的根治性手术，腔镜手术能否替代传统开腹手术，曾经有过争 论126]前些年争论的焦点在于腹腔镜手术是否能清扫彻底，是否能根治性地切 除肿瘤，经过众多专家、学者的研究统计，在淋巴结清扫方面，腹腔镜手术和开 腹手术没有明显差别，从而使得这一技术得以广泛推广；但在肿瘤术后复发转移 方面，腹腔镜手术和开腹手术是否有差别，能否降低术后复发转移率，这一点尚 无定论1271有关的报道也不多。 肿瘤微转移是近些年临床医学领域研究的一个热点，因为微转移与否和早晚 直接影响到肿瘤术后的复发和转移128]。微转移的肿瘤细胞常以单个细胞或微小 细胞团形式经淋巴系统、血液系统转移至淋巴结、骨髓和其他组织器官，也可直 接侵袭周围组织或种植于体腔。肿瘤转移和复发是其固有的一种生物学行为，而 微转移则是前两者的基础，在常规病理发现转移之前，微转移已经发生1291。研 究表明，很多常规病理阴性的淋巴结其实已经有癌细胞转移，这势必会影响肿瘤 的术后分期和辅助治疗[3010尽管大部分这样的患者在手术前并没有发现转移癌， 但实际上许多微小的转移灶已经存在，只是用我们常规的检测方法难以发现。正 是这种隐匿的微转移不断积累导致了肿瘤扩散，最终令患者死亡。 可见大肠癌患者的预后与有无转移密切相关，而癌细胞在腹腔内、淋巴结、 骨髓及外周血中的微转移则是导致大肠癌术后复发转移的重要因素1311。因此， 早期发现肿瘤的微转移及其转移范围对临床诊断、治疗及预后判断具有重要意 义。 众所周知，肿瘤最常见的转移方式有两种：血行转移和淋巴转移。大肠癌也 不例外。其中淋巴结转移可以导致肿瘤局部复发。随着手术方法的不断改进，对 于原发肿瘤，手术根治性切除基本可以控制，但根治术后肿瘤的复发和转移率高 达50％[3210人们发现早期大肠癌可有远处转移，借助活体显微电视系统更可直 接观测到手术中癌细胞播散，特别是“无淋巴转移”的DukesB期患者中，有近 30％5年内死于局部复发或远处转移，提示肿瘤在淋巴系统或全身存在微转移 t33】 O Stathopoulou等‘341和Ooka等哪!认为微转移检出与无瘤生存率和总生存 率相关，是判断预后的参考指标。其价值优于传统的肿瘤分期，微转移的检出是 肿瘤复发的高风险因素，许多研究表明，微转移患者的预后明显差于无转移者。 肿瘤的浸润与转移是一个多阶段过程，肿瘤细胞脱落、侵袭并进入循环只是这一 过程的最初阶段，并非检出的所有瘤细胞都一定能形成转移，但有瘤细胞检出毕 竟增加了转移的危险性13610临床上许多早期的常规检查阴性的胃肠癌患者根治 术后仍然有复发或远处转移，这可以用肿瘤的微转移来解释。基因诊断监测出肿 瘤微转移可对确定手术方式及清扫范围、选择术后辅助化疗、建立个体化治疗方 案起到重要作用[371。 为了提高结果的准确度，本研究从大肠癌最常见的两个转移途径入手，同时 采用两个不同的具有严格特异性的指标1EA和CKl9，均为临床上应用广 泛、效果肯定的指标，分别采用免疫组化和RT-PCR的方法，来检测大肠癌淋巴 结和外周血的微转移情况。采用不同指标同时从蛋白和基因两个层面来检测肿瘤 的微转移，从不同的角度，来验证同一个问题。实验前经术前抽血检查严格筛选， RT-PCR组选择CKl9表达病例，免疫组化组均选择CEA表达病例，而且严格限 定为DUKE、SC期病例，这样就有效避免了不同病理分期对淋巴结转移的影响， 尽可能减少了干扰因素。选择指标经典，课题设计严谨，筛选病例严格，有效地 降低了检测结果假阴性的可能。 如前言所述，肿瘤标志物有很多种，采用任何一种标志物都可以检测肿瘤的 微转移，但大部分标志物不具备特异性，难免假阳性的出现，或者指标具备特异 性但表达率太低，从而导致实验过程操作复杂、繁琐，影响因素太多，上述因素 无疑会影响结果的准确度。本实验选用临床上最经典、应用最广泛的肿瘤标志物 CEA，来检测淋巴结的微转移；同时选用具有严格上皮细胞特异性的CKl9，来 检测外周血的微转移。从所选指标来看，应该是很有说服力的‘3＆391。 癌胚抗原(CEA)是1965年由Gold和Freedman首先从结肠粘膜组织中分离 而得到，是一种分子量为22kD的多糖蛋白复合物，45％为蛋白质，编码基因位于 19号染色体，通常仅有低浓度存在于胚胎及胎儿内脏、胰腺和肝细胞中。是癌组 织和胎儿细胞共有的一种抗原。在妊娠期2个月起存在于胎儿消化系统中，如肠 道、胰腺和肝脏中，胎儿出生后其浓度明显下降。但成人的肿瘤组织，包括胚胎性 肿瘤，结肠、胃、肺、乳腺等癌组织中可出现表达，并分泌于体液中。CEA属于特 异性肿瘤相关抗原，分泌CEA的肿瘤大多位于空腔脏器，如胃肠道、呼吸道、泌尿 道等Ⅲ1。迄今为止，是临床上应用最早、结果最稳定、也是应用最广泛的一种 肿瘤标志物，特别是对胃肠道肿瘤有很强的特异性，几乎能在所有的上皮细胞包 括癌细胞中检出，而非上皮细胞则不能被检出，敏感性高【411，主要应用于胃肠 道癌肿，尤其是大肠癌的诊断。目前CEA在临床上主要用于结直肠癌患者预后的 判断和疗效观察以及术后复发和转移的监测[4210 本研究严格筛选限定DUKE、SC期病例，术前抽血检测证明均为表达CEA 的病例，避免了假阴性的可能；通过测量肿瘤标本常规病理阴性的淋巴结中CEA 的表达情况，即常规病理的漏诊率，来比较腔镜手术和开腹手术对大肠肿瘤微转 移的影响，借此推测两种术式对肿瘤术后复发和转移的影响。 CK是分布于外胚层起源细胞中的中间纤维丝，为细胞骨架的组分之一。CK 分为酸性和碱性两大家族，至少包括20个成员。研究表明：CK在细胞转化过 程中～般保持其亚微结构和免疫学特性，检测角蛋白类型可判断肿瘤组织学来 源。如癌组织是以富含CK为特征，肌肉肉瘤富含结蛋白，非肌肉肉瘤富含波形 蛋白[4310CKl9是CK家族中的一员，是一种细胞角蛋白，其优点在于对上皮细 胞和上皮性肿瘤细胞有严格的特异性，许多研究表明CKl9在间叶组织(外周血、 骨髓、淋巴结等)中无表达，而在上皮性肿瘤组织中(乳腺癌、胃肠癌、肺癌等) 均有表达，而且表达稳定。CK．19mRNA基因定位于人染色体17q21--q23，编码 24 细胞角化蛋白19亚型，近些年CK．19mRNA被广泛应用于乳腺癌、胃肠癌、 肺癌等上皮性恶性肿瘤手术切除淋巴结、骨髓以及外周血中微转移的检测，显示 了很高的敏感性和特异性。CKmRNART-PCR法是一种非侵袭性的、敏感的、 特异的检测外周血循环癌细胞的方法，是扩散性疾病早期诊断的有用指标，可以 判断手术时微转移细胞是否存在，从而确定有无早期复发的可能，是否需要辅助 性治疗。 微转移的检测方法也有很多种。本实验同时采用免疫组化和RT-PCR两种方 法，都是临床上应用己久、效果可靠的检测方法，分别从蛋白和基因两个层面来 检测淋巴结和外周血的微转移。虽然上述两种方法都应用已久，但也有其不足之 处：免疫组化检测可能出现假阳性及单抗的质量、交叉反应、机体产生自身抗体 等因素影响其敏感性和特异性。本实验所用试剂盒均购自福州迈新生物制剂公 司，也是我院所有日常病理工作所用试剂的固定生产公司，信誉可靠，质量稳定。 再者，因为检测的是淋巴结的微转移，所以在实验设计上采用淋巴结多个方向切 片，尽可能的减少了假阴性。 再看PCR和RT-PCR方法，该技术也已被广泛应用于临床工作，优点在于 具有高度敏感性、特异性，理论上可准确检测lg组织或lml液体中的1个癌细 胞，被认为是目前检测微转移的最有效方法Ⅲ1，但是用这一方法检测胃肠癌微 转移也可能会导致假阳性和假阴性的结果。假阳性产生的原因有：(1)靶RNA 的非特异性表达；(2)标本采集时上皮细胞的污染：(3)PCR扩增条件的控制 不当；(4)非特异性细胞低水平的非法转录。假阴性产生的原因是：(1)提取的 总RNA被灭活不全或污染的RNA酶降解；(2)靶RNA低水平表达达不到检测 的限度要求；(3)血样标本的采集处于癌细胞释放的间歇期14510为避免出现假 阳性和假阴性，我们应采取的相应措施：(1)检测中需加设阳性及阴性对照。以 表达靶RNA的肿瘤细胞作为阳性对照，以不表达靶RNA的健康志愿者的血液 标本作为阴性对照；(2)设立内参对照，验证提取的RNA是否完整；(3)操作 过程小心，避免采集标本时针头接触皮肤而造成假阳性至关重要，本实验中在采 血时特别强调采集第二管血标本，采血负压针头等用品均为～次性使用，以最大 限度保证实验的可靠性。(4)对检测组织优化PCR反应条件。 在数据处理上本实验采用率的对比，对比两种术式的淋巴结漏诊率和术前术 后外周血CKl9mRNA表达变化情况，采用率的对比更优于单纯变化幅度和漏诊 例数的数量对比，更加符合统计学原理，误差较小。 目前，我们推断大肠癌患者预后和选择术后治疗方案主要是根据患者的分 期，但这些分期是根据肿瘤大小、组织浸润程度、淋巴结常规病理转移情况和器 械检查远处脏器转移情况来决定的，指标显然过于粗糙，有失精确，已经不能作 为唯一指导治疗和判断预后的标准。微转移的检出是一个重要的指标，它能帮助 我们解释一些现象，比如前面提到的在临床上有许多早期的病例，DUKE、SB期 甚至A期的患者，术前远处器官影像检查及术后淋巴结常规病理均为阴性，行 原发灶根治性切除术后仍然有复发或远处转移，这一点我们可以从肿瘤细胞的早