J亚群禽白血病ELISA抗体检测方法的建立

第 27卷 第 4期 2 0 0 5年 7月 中 国 预 防 兽 医 学 报 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine V01．27．No．4 Ju1．20O5 J亚群禽白血病 ELISA抗体检测的建立 郭 艳 一，付朝阳 ，宋素泉 一，高宏雷 ，王笑梅 ，王 英 ，张厚双 ，王晓艳 ，胡建民 (1．中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150001；2．沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110161； 3．东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030) 摘要：本研究分离纯化了具有反应活性的 J亚群禽白血病JL-2株 gp85表达蛋白，并以其为抗原，开展了相关反应条 件、特异性、重复性 、敏感性、现地应用以及国外试剂盒符合率等方面的研究，初步建立了 J亚群禽白血病 E1JSA诊断方 法。 关键词：J亚群禽白血病； gp85表达蛋白； ELISA诊断方法 中图分类号：$852．65 文献标识码：B 文章编号：1008．0589(2005)04-0304-04 Establishment of ELISA diagnostic method of subgroup J 8vian leukosis GUO Yan 一，FU Chao-yang。，SONG Su-quan 一，GAO Hong-lei ，WANGg Xiao—mei ，WANG Ying ， ZHANG Hou-shuang1，WAN G Xiao-yan ，HU Jian-min2 (1．Harbin Veterinary Research Institute CAAS，Harbin 150001，China；2．ShenYangAgricultural University u∞NiI1g ShenYang 110161，China；3、Noah Eastern Agricultural University，Harbin 150030，China) Al，sIl-aIct：The expressed gpS5 of subgroup J avian leukosis vires strain JL-2 was isolated and purified．By using the expressed gp85 as antigen，the gp85一ELISA diagnostic method was established after related research on reaction conditions，specificity，repetition，sensitiv— ity and verification in chicken farms． Key words：Subgroup J avian leucosis； expr~ gpS5； ELISA diagnostic method J亚群禽白血病是由 J亚群禽 白血病病毒 (Subgroup J avian leucosis vires，ALV．J)引起的一种 主要导致肉用型鸡发生髓细胞瘤的传染病，该病 自1991年 由 Payne首次在英 国发现并报道 以 来u J，在世界范围内广泛流行，目前已遍布世界上 所有的养鸡国家，其中在美国、英国等国家肉种鸡 群中的感染率接近5O％，给世界养禽业造成了巨 大的经济损失。我国自1999年从市场上商品代 肉鸡中分离并检出了 ALV—J，现已在山东、江苏、 河南、宁夏、内蒙、吉林、黑龙江等省市分离到了多 个ALV—J病毒流行株[ “j。勿庸置疑，我国已经 受到J亚群禽白血病威胁，并造成了严重经济损 失。 目前，世界各国均缺乏针对 J亚群禽白血病 感染的治疗方法和有效疫苗，利用特异性诊断方 作者简介：郭艳(1977～)，女，硕士研究生，主要研究生理 及分子病毒学 ． *通讯作者：E-mail：xmw@hvri．ac．cn 收稿日期：2004—04—29 法淘汰阳性鸡、开展种群净化是现阶段控制该病 的主要手段。ALV—J亚群表型的决定因素是位于 病毒表面、与宿主细胞受体相互作用的囊膜蛋白 gp85，因此建立针对 ALV—J囊膜蛋白go85的血 清学诊断方法，可特异、敏感地检测鸡群中ALV—J 的感染，适合于在大范围普查中应用，通过定期抗 体监测，查知全群抗体水平以及突发的抗体变化， 可初步确定 ALV—J阳性感染场。在此基础上，再 结合其他病原学诊断方法，可为切实有效地开展 ALV—J的净化提供强有力的技术支撑 J。 在本研究中，我们在分离国内流行株、克隆和 表达 JL一2株 gp85基因、确定表达产物反应活性的 基础上，对表达产物进行了进一步分离和纯化，将 其作为检测抗原，对相关反应条件、特异性、重复 性、敏感性以及现地应用等方面进行了研究，目前 已初步建立了J亚群禽白血病 ELISA诊断方法。 1 材料和方法 1．1 病毒株 ALV—J JL-2株由本实验室分离、鉴 定[3j3。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 4期 郭 艳，等 ．J亚群禽白血病 E1．NA抗体检测方法的建立 305 1．2 茵种和质粒 PGEX一6P-1／gp85重组质粒为 本实验室构建 ，大肠杆菌感受态 DH5a、BL21为 本实验室保存。 1．3 SPF鸡 由哈尔滨兽医研究所 SPF实验动 物中心提供。 1．4 血 清 ALV—J阳性血清由本实验室制备； 阴性血清采自SPF鸡；交叉实验用血清由哈尔滨 兽医研究所维科公司技术服务部提供；现地试验 血清分别采自吉林省某养鸡厂的不同鸡群。 1．5 主要试剂 辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡 IsG抗体购自Sitka公司；氧化性谷胱甘肽、还原 性谷胱甘肽购自上海华舜生物工程有限公司。 1．6 包被抗原的制备 1．6．1 JL-2株 gpS5的诱导、表达、活性检测方法 见参考文献[6]。 1．6．2 表达蛋白的变性与复性：方法按参照文 献[7]进行。 1．6．3 蛋白的纯化：用Amerishman Biosaerles微量 GST蛋白纯化柱纯化，具体步骤参见产品。 1．7 间接 ELISA最佳工作条件的选择及试验术 式的确立 参照 IDEXX公司生产的 gpS5．ELISA 试剂盒(Avian I．eukosis Virus Antibodv Test Kit—Sub— group J)使用说明书初步确定试验术式，并对相关 工作条件进行如下研究。 1．7．1 抗原的最佳工作量：用碳酸盐缓冲液稀 释 gpS5表达蛋白，按不同浓度包被反应板，每孔 100 t,L。按常规程序测定阴、阳性血清。 1．7．2 封闭液及封闭时间：仅改变封闭液种类 及封闭时间，同时设不封闭对照，实验用血清 1： 100倍稀释，酶标记抗体 1：5 000倍稀释，其他按 常规步骤进行测定。 1．7．3 最佳血清稀释度及工作时间的确定 将 ALV阳性血清作 1：50 1：6 4OO倍稀释，作用时间 分别为3O、60、90 min，其他按常规步骤进行测定。 1．7．4 酶标二抗的最佳作用时间的确定：采用 不同作用时间，其他按常规步骤进行。 1．7．5 gpS5间接 ELISA诊断方法试验术式的确 定：按以上试验结果，确定试验术式。 1．8 gpS5间接 ELISA判定 测定 51份 SPF 阴性血清，按文献[8]用统计学方法进行计算。 1．9 特异性试验 检测传染性法氏囊病 、马立 克、新城疫、H7亚型禽流感、H9亚型禽流感、传染 性支气管炎、传染性喉气管炎等禽病阳性血清，确 定诊断方法特异性。 1．10 重复性试验 1．10．1 批内重复性试验：取两份 ALV．J抗体水 平不同的阳性血清和一份阴性血清在同一批次实 验中进行测定。 1．10，2 批间重复性试验：取四份 ALV．J抗体水 平不同的阳性血清和一份阴性血清在八个不同工 作日进行测定，进行统计学。 1．11 SPF鸡攻毒后抗体检测试验 用 ALV—J病 毒肌肉接种 SPF鸡后，分别在 1O、25、35、45、55 d 采集血清并检测，直至 110 d。 1．12 对比试验及现地试验 分别使用实验建立 的 gpS5一ELISA诊断方法和国外 ALV．J gpS5抗体 诊断试剂盒对某养鸡厂三个鸡群共计48O份血清 进行检测，分析试验结果，计算符合率。 2 结 果 2．1 JL-2株 gpS5的诱导、表达、活性检测的结果 见参考文献[6]。 2．2 包涵体蛋 白的分 离与纯化的结果 蛋 白经 纯化后纯度可达90％。作为抗原(见图 1)。 1．尿素裂解后的上清；2．尿素洗 涤后的包涵 体；3．标 准蛋 白 Mark；4．Triton—x-100洗涤后的包涵体；5．纯化后的蛋白；6．Nacl 洗涤后的包涵体 图 1 包涵体蛋白的分离与纯化 Fig．1 Isolation and purification of expressed protein 2．3 抗原最佳工作量的确定 结果表明，抗原以 4 孔、2 to,／孔、1 to,／孔、O．5 孔、0．25 孔、 0．125 孔 、o．0625 孔 、0．03125 包被聚 苯乙烯微量反应板时，阳性与阴性血清 OD比值 (P／N值)分别为 2．5、2．7、2．95、2．9、2．25、2．65、 2．18、1．34。综合阴性血清 OD值高低以及 P／N 值大小这两个因素，确定 0．125 作为抗原的 最佳工作量 。 2．4 最适封闭液及封闭时间的确定 结果表明 不封闭、使用含 3％脱脂奶粉、O．1％明胶、O．5％ 马血清、5％牛血清、1％牛血清 PBST封闭后的 P／N值分别为 3、5．1、3．52、4．17、4．36、4．30，确定 最适封闭液为含 3％脱脂奶粉的 PBST，60 min封 闭，P／N值最高，故最佳封闭时间定为60 min。 2．5 最佳血清稀释度)L．x-作时间的确定 分别 将阳性和阴性血清 50、100、200、4O0、8OO、1 60O、 3 200倍稀释，测得的 P／N值分别为 3．1、3．45、 3．51、3．1、2．02、1．4、1．3；作用 30、60、90 min，测得 维普资讯 http://www.cqvip.com 中 国 预 防 兽 医 学 报 2005矩 的 P／N值分别为 4．0、6．0、4．9。依据以上结果， 我们选择 1：400作为血清最佳稀释度；60 min作 为最佳作用时间。 2．6 酶标二抗最作用时间的确定 酶标抗体作 用3o、60、90 min，测得的 P／N值分别为 3．9、4．8、 4．4。因此，60 min为最佳工作时间。 2．7 gp85间接 ELISA诊断方法的试验术式的确定 2．7．1 诊断反应板的制备：将重组 gp85表达蛋 白用 0．05 mol／L的碳酸盐缓冲液(CBS PH 9．6)作 适当稀释，按 0．125 t-,．g／：~L包被 反应板，每孔 100 ，4 oC过夜或37℃，3—4 h，用洗液 PBST(含 0．05％ Tween20的 0．01 mol／L，PH 7．4 PBS)洗涤 三次，3—5 min／次，吸水纸沥干。然后用封闭液 (含3％脱脂奶粉的PBS)每孔 200,uL封闭 1 h，洗 涤同前。干燥后置 4℃或 一2o℃冰箱保存备用， 即为抗体检测快诊板。 2．7．2 加待检血清：将待检血清用稀释液(含 0．1％牛血清白蛋白的 PB )1：400稀释后，每孔 加 100,uL，37 oC温箱内作用 1 h后，同上洗涤。 2．7．3 加酶标抗体：羊抗鸡辣根过氧化物酶标记 抗体用稀释液 1：5 000稀释后，每孔加 100 ，37 ℃温箱内作用 1 h，同上洗涤。 2．7．4 加底物溶液：使用溶液 A(0．1 mol／L柠檬 酸溶液)和溶液 B(0．2 mol／L NazHPO4溶液)，将 2．43 mL的A液与 2．57 mL的 B液混合，加 5 mL 的灭菌水，4 的 OPD，20 的过氧化氢，室温 避光反应 8—10 min，用 2 M的浓硫酸终止反应。 处进行测定，用空孔调零后，测定每孔内光密度吸 收值(OD值)。每份样品平行做 2 4孔，取其平 均值。 2．8 gp85间接 ELISA判 定标 准的确 定 51份 SPF鸡血清样品，在最适条件下进行间接 ELISA 测定，结果进行统计学分析，样品 P／N值平均值 为 1．37，标准差为0．36。99％置信区间 x+3s= 2．45因此，我们把 2．45作为 gp85间接 ELISA的 临界值，为了降低假阳性及假阴性结果设一个可 疑区，介于临界值加减一个标准差即为判定标准， 即被检血清 P／N大于或等于2．81为阳性，P／N小 于或等于2．09判为阴性。为了数据统计方便，将 P／'N大于等于2．8定为阳性，P／N小于等于 2．10 定为阴性，2．1—2．8之间应重测，或判定为疑似。 2．9 交叉试验 应用 gp85间接 ELISA诊断方 法，对 SPF鸡血清、鸡传染性法氏囊病、马立克氏 病、新城疫、H7亚型禽流感、H9亚型禽流感、鸡传 染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎等阳性血清测 定的 P／N值分别为 1．0、1．11、1．12、1．33、1．38、 1．95、2．05、1．69、3．72，按确定的标准，该诊断方 法与上述血清没有交叉反应，特异性比较强。 2．10 gv85间接 ELISA重复性试验 2．10．1 批内重复性试验：对数据进行统计学分 析，其变异系数位于 2．8 8．6％之间，均小于 10％，重复性较好(见表 1)。 2．10．2 批间重复性试验：对数据进行统计学分 析，其变异系数位于6．1—14．5％均小于 15％，重 2．7．5 测定：用 自动酶标测定仪在波长 492 nln 复性较好(见表 2)。 表 1 批内重复性试验结果 Table 1 The result of repetition test batch 维普资讯 http://www.cqvip.com 第4期 郭 艳，等 ．J亚群禽白血病 ELISA抗体检测方法的建立 307 2．11 gp85间接 ELISA敏感性试验：我们按常规 攻毒剂量对 20只 SPF鸡接种 ALv．J JL-2毒株，攻 毒后 10、25、35、45天采血，使用 gp85．ELISA诊断 方法检测的阳性率分别为 4／18、11／17、14／17、14／ 14、使用进口ELISA试剂盒检测阳性率分别为 3／ 18、14／17、14／17、14／14，检测敏感性较高，对阳性 鸡只进行跟踪监测，结果表明，直至攻毒后 85天， 血清检测结果仍为阳性。 2．12 现地试验及对比试验结果：使用 gp85间接 ELISA诊断方法对某现地养鸡厂 3个鸡群进行检 测的结果表明，其中鸡群一 78只、鸡群二 306只、 鸡群三96只鸡血清的检测阳性率分别为 7．6％、 9．8％ 、59．7％；使用国外 AIJv．J gp85试剂盒的 检测结果表明，三个鸡群的阳性率分别为6．7％、 9．36％ 、51．6％，两者在三个鸡群中血清检测的 符合率分别为 89％ 、95．5％、86．4％。 3 讨 论 3．1 J亚群禽白血病在鸡群中不仅可以水平传 播还可垂直传播，导致感染鸡群的死亡率升高、产 蛋量下降、发生免疫抑制、带来直接危害，另外免 疫抑制还可严重影响禽流感等禽类烈性传染病的 免疫预防效果，降低禽只对各种病原体的抵抗力， 从而引发更为严重的危害。因此，自该病在国内 不同地区出现和流行以来，就引起了兽医工作者 和养禽生产者的高度重视。目前，现地生产中急 需开展该病普查和净化的技术手段。虽然，国外 用于检测 ALv—J囊膜蛋白gp85的血清学诊断试 剂盒已经商品化，但是因为 gp85存在着极为普遍 的抗原变异，世界各地区 ALv—J分离株 gp85的 分子变异规律不尽相同，不能确保来自国外的血 清学试剂盒在中国境内使用的效果，最不容忽视 的问题是国外试剂盒价格昂贵，使用成本较高，不 易在国内大范围推广使用。为了解决上述问题， 本研究立足国内生产需求，开展国内分离毒株 gp85的高效表达和纯化研究，并以其为抗原，建 立了用于检测 ALv—J的血清学 ELISA诊断方 法。 3．2 本研究建立的ELISA诊断方法，经交叉试验 证实，具有良好的特异性，与其他禽类常见疫病的 阳性血清无交叉反应，特异性好；批内和批间重复 试验证实，抗体水平不同的各种血清样品、在不同 时间进行检测的 OD值变异程度不大，重复性和 稳定性较好。 3．3 敏感性实验的结果表明，SPF鸡攻毒后 10 d 即可检测到ELISA抗体，直到实验进行到的第 85 天仍然可检测到抗体。检测敏感性与国外试剂盒 一 致。 3．4 经对现地 480份血清样品测定结果表明， ELISA诊断方法与国外商品化试剂盒在不同鸡群 中的符合率最低可达86．4％，最高达到95．5％， 符合率较好。 3．5 目前已有的研究结果及现地应用效果表明， 本研究建立的间接 ELISA抗体检测方法，具有特 异、敏感、适用、成本合理等特点和优势。随着技 术手段的进一步完善、试剂盒组装技术的开发和 利用，J亚群禽白血病 ELISA诊断方法将为国内 各养鸡厂有效开展J亚群禽白血病血清学调查提 供有效的技术手段。同时，结合相应的病原学诊 断方法，该方法也必将在 J亚群禽白血病的净化 中发挥巨大的作用。 参考文献： ll J Payne L N，Brown S R，Bumstead N，et o1．A novel&Ibl卿 of exogenous avian leulosis vinls in chickens【J J．Journal 0f C-metal Virology，1990，72，801—807．． [2] 杜岩，崔治中，秦爱建，等．从市场商品肉鸡检出J亚群禽白 血病病毒[J]．中国家禽，1999，3(1)，91-95． [3] 宋素泉，付朝阳，高宏雷，等．J-亚群禽白血病JL2株的分离 鉴定[J]．中国预防兽医学报，2003，25(5)：345—349． [4] 付朝阳，宋素泉，高宏雷，等．J亚群禽白血病 H_d~1分离株 eFiv基因克隆及目】85杆状病毒表达载体的构建[J]．中国预 防兽医学报，2004，26(2)：81—86． [5] 付朝阳，王笑梅，高宏雷，等．J亚群禽白血病研究进展[J]． 中国预防兽医学报 ，2002，24(增刊)286-288． [6] 宋素泉，付朝阳，高宏雷，等．J亚群禽白血病JL-2株印85基 因的克隆与表达[J]．中国预防兽医学报，2004，已接受． [7] J萨姆布鲁克，D w拉塞尔 ．黄培堂等译[M]．分子克隆试 验指南[M]．第3版，黄培堂，译 ．北京：科学出版社． [8] 马世东．非洲猪瘟的间接 ELISA诊断试剂盒的研究[D]．新 疆农业大学硕士论文 ． 维普资讯 http://www.cqvip.com