病毒滴度的测定

病毒滴度的测定  病毒感染的测量方法 – 直接计数法  将病毒与乳胶颗粒混合,电子显微镜观测  缺点是无法判断病毒的感染性 – 间接计数法  空斑形成单位(plaque forming units,PFUs)  50%终点法  血凝试验  干扰滴定 第一节 空斑形成单位法 一、基本原理  原理 – 空斑形成单位(plaque forming units,PFUs)试验：  将不同稀释倍数的病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒 感染时会造成宿主细胞溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗 粒引起，计数空斑数目再乘稀释倍数，得病毒感染的浓度 – 病毒空斑—蚀斑  将病毒稀释后移入单细胞培养瓶中，吸附1h后，覆盖营养琼脂  病毒在琼脂中只感染临近的细胞，形成空斑的退化细胞区  中性红染色：活细胞染红色；死细胞无色  产生CPU的病毒均可用此方法 二、方法与步骤  测定病毒空斑的试验方法 – 病毒杀死感染细胞的检测：产生细胞病变效应  中型红：活细胞染红色  台盼兰：死细胞染蓝色  MTT：溴化二苯基四氮唑，将活细胞染成深蓝色，易于计数，易 分离病毒转化或有抵抗力的细胞 – 未能杀死细胞可产生血凝素  因能吸附红细胞，空斑用血吸附显出  用显微镜计数吸附红细胞的空斑 – 细胞融合：  病毒感染细胞与临近的未感染细胞融合形成多核细胞，用显微镜观 查合胞体空斑 – 空斑中含有病毒的抗原  免疫荧光分析 – 免疫组化技术  生物素-抗生物素-过氧化物酶染色技术  间接免疫过氧化物酶染色 三、空斑形成单位法测定病毒滴度的计算  空斑形成单位试验技术 – 传代细胞平皿法  单层细胞浓度为2×106，培养液为RPMI1640，Eagle，MEM  病毒液稀释在冰浴盘作10倍稀释，每个稀释度培养2瓶，每加一次 样时要新吸管，来回吸三次，加至培养瓶无细胞层的瓶壁底角再倾 斜来回摇动，使病毒均匀  CO2孵箱吸附90min后，再用营养琼脂覆盖  培养5~8d后，加入0.01%的中性红染色，计数空斑  病毒滴度的计数 – 按以下公式计算 空斑形成单位(PFUs/ml) = d vn n    21 X1、X2、Xn：表示同一稀释度在不同培养孔板（实验单位）中数得到的空斑数；n 表示计 数空斑的培养板孔数；v 表示病毒量（ml）；d 表示稀释倍数 例：以稀释成 10-4 的病毒悬液感染细胞，四个培养板孔中的空斑数分别为 1，1，3 及 5 个， 接种量为 0.2 ml 空斑形成单位(PFUs/ml) = 410 0.24 5311    = 1.25×105PFUs/ml  空斑形成单位（PFUs）与重复感染数（M.O.I） – 重复感染数（Mutiplicity of Infection，M.O.I）是指感染一个 细胞的病毒颗粒的平均数 – 一般来说， M.O.I值越大，则实验细胞被感染的比例越大 – 若某病毒的PFUs 已经测得，要按一定量的M.0.I进行感染细 胞时则所需的病毒量可按公式1和2计算 公式1：实验细胞数×所需的M.O.I值=所需的PFUs 公式2：所需的PFUs/实际病毒的PFUs=需要加的病毒量 例：已知某病毒的滴度为1.3×1011 PFUs/ml，试验细胞数为每孔1.8 ×106，M.O.I值为200。 解答按公式1得到所需的PFUs= 1.8×106 ×200=3.6 ×108； 按公式2得到所需的病毒量= 3.6 ×108/1.3 ×1011=2.8μl 四、注意事项  对细胞的要求 – 严格，单层细胞一定要均匀，形态和状态良好  对病毒的要求 – 对热敏感的病毒在冰浴中进行稀释 – 每一稀释度换一只吸管  对培养基的要求 – 避光培养防止中性红见光分解对细胞有毒作用  对观察计数的要求 – 当空斑数目达到稳定 – 中性红时间应在空斑出现前在暗处培养 – 生长较慢的病毒，中性红应加在培养几天后的最后一层覆盖 第二节 50%终点法测定病毒滴度 一、基本原理  原理 – 50%终点（50% endpoint）法 将病毒液稀释后接种至动物、鸡胚或细胞层，将每个稀释度造成的动 物、鸡胚致死量或细胞病变做成曲线，找出造成50%动物或鸡胚 死亡或细胞病变的终点稀释度 LD50（50% Lethal dose）—50%动物或鸡胚致死的病毒含量 ID50（50% Infectious dose）—50%动物或鸡胚感染剂量 CCID50（50% cell culture infectious dose）—50%细胞培养产生病 变效应的剂量 二、方法与步骤  细胞病变效应的情况 – 细胞形态完全发生改变  胞核及整个细胞发生肿胀，胞浆颗粒样变化  细胞发生皱缩、变圆、脱落  多见于很多病毒如肠道病毒、痘病毒、呼肠病毒等 – 细胞聚合：如腺病毒 – 细胞融合成合胞体：有多核，如疱疹病毒 – 产生轻微病变：如正粘病毒、狂犬病毒、逆转录病毒  方法与步骤 – 制备细胞  细胞的浓度约为20万~30万/ml,置微量细胞培养板 – 孵育细胞  5%CO2孵箱 – 接种病毒  病毒用含Eagle’s液作10倍递增稀释  每稀释度加4孔,每孔100μl  设立细胞对照孔  结果观察: – 细胞病变程度表示法  -：表示无细胞病变；+：表示1%~25%的细胞病变；++：表示 26%~50%的细胞病变；+++：表示51%~75%的细胞病变；++++： 表示76%~100%的细胞病变； – 结果  CCID50（半数细胞培养感染剂量）-凡能使50%细胞出现病变的最 高稀释度  TCID50—半数组织培养感染剂量 三、50%终点法的计算  CCID50的计算 – Reed-Muench法 – 据该病毒的CCID50介于10-4（3/4）和10-5（2/4） 距离比例 = ㏒稀释倍数 数低于50％的感染百分—数高于50％的感染百分 50％—数高于50％的感染百分  = 767.0㏒10 4083 5083  — — lgCCID50=高于50%的感染百分数的低稀释度的对数+距离比例 =-4+（-0.767）=-4.767 即此病毒按1：63000按0.1ml接种细胞后，可使50%的细胞病变 – Karber法 – 公式： lgCCID50=L+d（S-0.5）  L-病毒的最低稀释倍数的对数  d-稀释系数；  s-细胞病变比值的和（不包括最低比值） – CCID50与PFUs的换算  预计的PFUs等于0.7乘以CCID50 第三节 血凝试验和感染滴定 一、血凝试验的基本原理  血凝原理 – 血凝现象  血凝抑制试验  干扰滴定原理 – 干扰现象  两种病毒同时感染同一细胞发，发生一种病毒抑制另一病毒增殖  先进的感染后进的；死的干扰活的 – 方法：是将不产生CPE的病毒（感染病毒）先感染细胞，培养 一定时间后再用相应的能产生CPE的病毒感染同一细胞，如果 抑制能产生CPE的病毒的增殖即为阳性孔，计数再用Karber 法测定 病毒溶液的滴度的描述方法 滴度测定方法包括 2 类：物理方法（VP） 1． VP（病毒颗粒）或 OPV（光学颗粒单位）：测定 VP 的方法是测定病毒颗粒在 260nm 处的吸光度（病毒 DNA 和蛋白的总吸光度中主要为 DNA），1 个 OD 值相当于 1.1×1012个病 毒颗粒。用这种方法进行测定在各个实验室中都较为稳定，但它不能区分感染性和缺陷性病毒 颗粒。因此这种方法只能提供病毒的量，至于质，比如是否含有缺陷性颗粒则没有考虑在内。 生物学方法（GTU、PFU、TCID50） 2． GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU 即蓝点形成单位，与 GTU 类似）： GTU 则测定感染后能表达基因的细胞数量。这个过程中，病毒将 DNA 转入细胞，在一个 感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如 GFP 或 LacZ 等则可以用这种方法进行测定，病毒保存液通常不用这种方法来进行描述。 3． PFU（空斑形成单位） ：PFU 是测定腺病毒滴度最早的方法，主要测定单层细 胞培养中病毒裂解空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星 期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复，即使在同一实验室内，不同技 术员操作也很少能得到相同的结果。 4． TCID50（50%组织培养感染剂量）： TCID50 已被用于测定许多种病毒的滴度，但 以前并不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞在 96 孔板进行培养，然后监测每孔是否 CPE。TCID50 方法相对 PFU 方法而言有几个优点，如速度是 PFU 的 2 倍，结果更具预料性，在不同操作个 体间也更稳定。 所有生物学方法所得到的结果在不同实验室之间往往有所差异，它主要与病毒感染方法有 关。许多因素如加入的病毒储存液的量、管子的类型、培养的时间、细胞和培养液的量等都会 影响结果。最近，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一种是用更小体积的病毒液进行感染 并在感染过程中不断晃动培养板（Mittereoler 等，1996）；另一种方法则在感染时将培养板进 行离心（1000 RCF90 分钟）（Nyberg-Hoffman 等，1997）。这两个实验室所得到的结果更为 稳定，并证实以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数量。 对于同一管病毒保存液，不同的方法所得到的结果往往相差 100 倍以上，典型的数据见表 -6。所有结果都只是大概的，目前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到 1 个感染性颗 粒/2 个颗粒。选择滴定方法要考虑的关键因素包括可重复性、稳定性、敏感性、易用性和耗时。 一般来说，用 TCID50 方法得到的病毒保存液的滴度应为： 10 6 ~10 7 第一代细胞经冻融后 10 8 ~10 9 100 倍数量的细胞经过冻融后 10 10 ~10 11 用氯化铯方法纯化后 表 6：各滴度测定方法特性 方法 类型 时间 可重复性 滴度* 评注 VP 物理学方法 2 小时 好 5×10 12 GTU 生物学方法 2 天 可变 2×10 11 PFU 生物学方法 21 天 变化很大 5×10 10 传统方法 TCID50 生物学方法 10 天 可变 2.5×10 11 昆腾公司标准方法 以 VP 法测得的 5×1012 的病毒保存液为标准： O.D.260 nm（VP/ml）法 这种方法只是通过 DNA 量来表示病毒滴度。相关系数为 1.1×1012/ OD260 单位。由于大多 数分光光度计在 OD 值小于 0.1 时不够精确，而样品准备过程中又至少要稀释 10 倍，因此如 果 OD 值大于 0.1，我们可以估计病毒量大于 1012。这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于 缓冲液中的病毒，因含血清培养基会干扰吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，并且不含 缺陷性颗粒。 1． 4℃融化病毒保存液。 2． 在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB）（0.1%SDS，10mMTris PH7.4， 1mMEDTH）准备二个病毒稀释度。 最小需要量为： s 病毒裂解液 病毒 稀释度 52ul 52ul 1：2（稀释液 1） 168ul 42ul 1：5（稀释液 2） 注意：病毒滴度高时（1013/ml）用 1：10 和 1：20 稀释度，滴度低时用低稀释度，保证 OD 值在 0.1~1.0 之间。 3． 56℃震荡培养 10 分钟。 0 uf'gbjf 4． 准备 1ml 含有 VLB 和透析缓冲液的空白对照溶液，比例同上，以缓冲液代替 病毒裂解液。 5． 测定 260nm 处吸光值： 稀释液 1 再稀释 1：5，为稀释液 3。 稀释液 2 再稀释 1：5 和 1：10，分别为稀释液 4 和稀释液 5。 测定稀释液 5（2 次）、4、3 的 OD260，取此 4 值的平均值作为最终结果。 例如： 1． 将 450ulVLB 和 50ul 稀释液即透析缓冲液加入比色杯中。 2． 记下空白管读数后弃去，不要冲洗。 3． 加入 450ulVLB 和 50ul 1：5 稀释样本（稀释液 2），组成稀释液 5。 4． 记下读数后弃去。 5． 清洗比色杯，加入样本重复测一次。 6． 清洗比色杯，加入 400ul VLB 和 100ul 1：5 稀释空白液。 7． 记下空白管读数后弃去，不要清洗。 8． 加入 400ul VLB 和 100ul 1：5 稀释样本，组成稀释液 4。 9． 记下读数后弃去。 10． 清洗比色杯，加入 400ul VLB 和 100ul 1：2 稀释空白液。 11． 记下空白读数后弃去，不要清洗。 12． 加入 400ul VLB 和 100ul 1：2 稀释样本，组成稀释液 3。 13． 记下读数后弃去。 将吸光值与稀释度相关系数相乘即可得出病毒滴度： OD260×病毒稀释度×测定稀释度×1.1×10 12 = OPU/ml 空斑测定法 空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染 QBI-293A 细胞后，通过一个感染周期便可再感染 邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。 由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到 的结果往往最不稳定。 1． 5×105细胞/60mm 培养皿用 5ml DMEM5%培养，3-4 小时后等细胞贴壁即可进行病毒感 染。或者在病毒感染前一天加入 3×105细胞/60mm 培养皿。 2． 在 12 孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。第 1 个稀释孔将病毒保存液稀释至 1ml， 其它孔稀释至 3ml，大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化 的），调节稀释度至 10-100 个病毒/孔，一般为 10-12，这样稀释比大约为 10-7~10-12。 稀释：将 100ul 病毒保存液加入 900ul DMEM5%。用移液器上下吸打 5 次，此时稀释度 为 10-1。换用新枪头将 300ul 10-1稀释液加入 2.7ml DMEM5%吸打 5 次，稀释度为 10-2。然后 分别取 300ul 前一稀释液加入 2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后 4 个稀释度用于感 染细胞。 注意：每次稀释时都必须换用新枪头。 3． 吸去细胞培养液，每个培养皿中加入 1ml 病毒稀释液和 1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动 混匀，37℃培养 90 分钟。 4． 吸去培养液，加入 1.25%琼脂糖培养基。 5． 37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。21 天后应该可以看到空 斑形成的白色小斑点。 结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位 (PFU/ml)。 50%组织培养感染剂量法 此方法基于最高稀释度下在 QBI-293A 细胞中 CPE 的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标 准方法。 细胞准备： 1． 收集一瓶 QBI-293A 细胞，计数。 2． 用 DMEM 2%准备 20ml 105/ml 细胞。 3． 用 12 道排枪在 2 块 96 孔板中每孔加入 100ul 细胞悬液。 准备稀释病毒液 1． 第 1 管中加入 0.9ml DMEM 2%，其余加入 1.8ml。第 1 管中再加入 0.1ml 病毒保存液。 2． 上下吸打 5 次混匀。 3． 换用新枪头。 4． 从第 1 管中吸取 0.2ml 加入第 2 管中。 5． 反复稀释至最高稀释度。 6． 用同一管病毒保存液进行第 2 轮稀释。 7． 最后 8 个稀释液加入 96 孔板，每孔 0.1ml，每个稀释度 10 孔，2 孔为阴性对照。阴性对 照孔中加入 0.1ml DMEM 2%监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。 8． 37℃培养 10 天。 9． 10 天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现 CPE 的孔数。只要有一小点或是一些细胞 出现 CPE 即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。 10． 计算每一排中出现阳性的孔数。 如果阴性对照中无任何 CPE 且细胞生长良好，最低稀释度 100%阳性而最高稀释度 100% 阴性，则本测试即为有效。 稀释度孔 对 照 稀释度 比率 10 -10 0/10=0 10 -9 0/10=0 10 -8 2/10=0.2 10 -7 6/10=0.6 10 -6 10/10=1 10 -5 10/10=1 10 -4 10/10=1 10 -3 10/10=1 在这一例子中，当稀释度为 10-6时出现 100%阳性，当稀释为 10-9时出现 0%阳性。因此， 滴度可以用 KARBER 统计法精确算出：对于 100ul 的稀释液， 滴度为 T=101+d·（s-0.5） d=log10 稀释度=1（对于 10 倍的稀释度而言） s=阳性比率之和（从第 1 个 10 倍稀释度开始）=1+1+1+1+1+1+0.6+0.2+0+0=6.8。 注：虽然一些低稀释度在测定中省略了（如 10-1和 10-2），但在计算时仍应以阳性比率为 1 来算。 滴度：T=101+1·（6.8-0.5）=107.3（100ul 病毒保存液中） T=100.3≈2×108 TCID50/ml 说明：我们已经证实，TCID50 法测到的滴度 d=log10 值比标准空斑法高 0.7。 将 TCID50/ml 转换为 PFU/ml： T=1×108.3 TCID50/ml=1×108.3-0.7 PFU/ml=1×107.6 PFU/ml≈4×107 PFU/ml 两次重复试验得到的滴度值应相差≤0.7个 log10 值（100.7）。 慢病毒滴度测定 1 此时即可用病毒上清测病毒滴度（悬浮感染）： ① .在 24 孔板中测定病毒滴度，先用明胶包被 24 孔板 10min 以上（每孔加入 200ul 明胶，移 液管两滴左右）。 ② .消化 293T 细胞，24 孔板每孔 15 万细胞。可将细胞做 mix，体积扩大到 15 万细胞/500ul， 加入 1/1000 polybrene，混匀，每孔加入 500ul 15 万细胞即可。 ③ .将病毒上清 4000rpm 离心 5min，将细胞碎片离至管底。取 5ul 病毒上清至上述步骤中传入 15 万每孔的 24 孔板一孔中，摇匀；48h 后即可在荧光显微镜下观察其滴度。 2 病毒滴度确定： ① .15 万 293T 细胞 48h 即可刚好长至 90-100％满，此时即可固定细胞，计数确定病毒滴度。 ② .将培养基用真空泵吸去部分，务必不要将其吸净，由于 293T 细胞易飘，固定及 DAPI 染色 整个过程请务必保持 293T 细胞处于液面之下。用 PBS 涮 3 次。加入 4％ PFA 室温固定 30min, 24 孔板每孔 200ul。 ③ .用 PBT 洗 2 次，每次 3 分钟。 ④ .PBS 将 DAPI 1000 倍稀释，每孔加入 200ul，避光室温静置 5min。 ⑤ .PBS 洗 2 次，每次 5 分钟，即可在荧光显微镜下计数，取 2-3 处取平均值。 ⑥ .病毒滴度（IU/mL）= 35 10101.55 百分比荧光细胞占总细胞数的  腺病毒滴度测定 病毒滴度滴定（组织培养半数感染量 TCID 50）：将分装好的病毒液接种一长满单层 Hep-2 细胞的 96 孔板，第一列每孔加 25μl 病毒液，作 1/lO 稀释，此后依次作倍比稀释，每稀释度接种 8 孔，最后一列做阴性 对照.对照孔和感染病毒孔均加入 100μl维持液，置 37℃ 、5%CO2 培养箱中培养。每天观察并记录出现 CP E 的孔数及具体时间，待细胞病变不再发展后，观察记录结果，用 Reed-Muench 法计算病毒滴度 TCID 50。 滴度结果： TCID 50 = 的百分数 50%<的百分数一 50%> ）50%的百分数一50%>（+病毒稀释50%>CPE 度 × lg10