双龙接骨丸对成骨细胞增殖和细胞周期的影响

双龙接骨丸对成骨细胞增殖和细胞周期的影响 双龙接骨丸对成骨细胞增殖和细胞周期的 影响 中国临床康复第8卷第23期2004.08.15出版 48O0ChineseJournalofClinicalRehabilitation,August152004Vo1.8No.23 双龙接骨丸对成骨细胞增殖和细胞周期的影响 严亚峰,王煜,马建 ? 中医康复研究? 严亚峰,王煜,成都体育学院运动医学系,四川省成都市640041 马建,四川成都体育医院,四川省成都市640041 严亚峰?,男,1972年生,山东省鱼台县人,汉族,成都体育学院在读硕 士.主要从事运动创伤的康复与治疗的研究. yanyafeng597@sohu.corn 电话:+86.27.83660915 四川省2002年重点科技项目(O2SGO11.O71) 中圈分类号:R289文献标识码:A文章鳙号:1671—5926(2004)23—4800—02 收稿日期:2003—11—25fI回日期:2004—02—20(12/NX) Effectofshuanglongfieguwallonproliferationandcellcycleof osteoblastsYa—FengYan,YuWang,JianMo Ya—FengYon,YuWang,DepartmentofSportMedicine,ChengduPhysical EducationInstitute.Chengdu640041.SichuanProvince.Cla JianMa,ChengduPhysicalEducationInstitute,Chengdu640041,Sichuan Province,China Ya.FengYah?.Male,HanNationality,Botnin1972inYutaiCounty. ShandongProvince,China,StudyinginChengduPhysicalEducationInstitute formasterdegree.Researchdirection:rehabilirationandtreatmentofsports trauma.yanyafeng597@sohu.com Telephone:+86.27.83660915 Supportedby:KeyScientificandTechnologicalProgramofSichuan Provincein2002.No.02SGol1-071? Received:2003?-11.-25A~pted:2004.-02—-20 Abstract A珊:ToexploretheinfluenceoftraditionalChinesecompoundshuanglong jgt'roanontheproliferationandcellcycleofosteoblasts. METHODS:RatsweretreatedwitlIshuanglongg1正a,lbygastricperfu— sion,onceadayfor7days,andthentheratswerekiHed2hoursafterthelast gastricpeffusionforpreparationofseru/llcontainingshuanglong御 lan.Theprimarilyculturedosteoblastsofratswerestimulatedwiththeserulll containingshuanglong如口,lofdifferentconcentration.11lecellprolif- erationratewasassayedbyusingthemethylthiazolytetrazolium(MTr) method.andthenthecellcyclewasdeterminedwitlItheflowcytometry technique. RESULI:?Thecellproliferatingrateinthe8erumcontainingshuanglong 洳roanof30mL/Lgroupwasnotsignificantdifferentfromthatintheblank controlgroup(t=1.06,P>0.05),whilethoseinthe~l'ulllcontaining shuanglong仲roanof50,100,250,500,750and1000mL/Lgroupswere obviouslyaccelerated,andsignificantlydifferentfromthatinthecontrolgroup (t:2.53,P<0.05;t=3.09,3.32,3.54,3.87and4.12,P<0.O1).( Theanalysisonthecomposingofcellcycleshowedthatthe8erumcontaining shuanglongjiegulanof10mL/LcouldincreasethecellratioatSphageand promotethecellsintothesplittingproliferatingpha8e. CoNCLUSIoN:TheseruIncontainingshuangl~mgjiegutt,口caneffectively promotetheproliferationofosteoblasts. YanYF.WangY.MaJErredofjJIl'如waltonproliferationandcellcycleof osteoblasts.踟厶?,I2004;8123l:4800—1IChina} 严亚峰.王煜,马建.双龙接骨丸对成骨细咆增殖和细咆周期的影响lJl中国临 床康复,2004,8123l:4800—1 ;23zy/4800.pdf 摘要 目的:探讨中药复方制剂双龙接骨丸对成骨细胞增殖和细胞周期的影 响. :双龙接骨丸生药给大鼠灌胃,1次/d,共7d.于最后1次灌胃后2h 处死,制备含药血清.以原代培养的大鼠成骨细胞为实验对象,采用不 同浓度的含药血清刺激成骨细胞,四氮唑蓝法(MTT)细胞的增殖 情况,流式细胞仪分析细胞周期的构成. 结果:?双龙接骨丸30mL/L含药血清组细胞增殖率与空白对照组 相比,差异无显着性意义(t=1.06,P>0.05);50,100,250,500, 750,1000mL/L含药血清组均可明显促进细胞增殖,与对照组相比. 差异有显着性意义(统计学数值分别为t=2.53,P<0.05;t=3.09, 3.32,3.54,3.87,4.12,P<0.O1).?细胞周期构成分析发现, 100mL/L双龙接骨丸含药血清增加S期细胞比率,促进细胞进入分裂 增殖期. 结论:双龙接骨丸含药血清能有效促进成骨细胞的增殖. 主词:中成药;成骨细胞;细胞周期 0引言 双龙接骨丸是我国着名骨伤科专家郑怀贤教授所独创,具 有调血气,通经络,安神定志,促进骨质生长的作用.临床上常 用于骨折后骨痂不易形成及废用性脱钙的防治,具有显着疗 效,但其作用机制尚不明确.本实验采用血清药理学的研究方 法,即将复方双龙接骨丸经口给动物灌服一定时间后采集动物 血液,分离血清,用此含药血清进行体外实验的方法"】,探讨双 龙接骨丸对成骨细胞增殖的作用. 1材料和方法 :非随机对照的实验研究. 地点和材料:实验在华中科技大学同济医学院附属同济医 院中心实验室完成.DMEM/FI2,胎牛血清(feudbovines咖, FBS),美国Gibco公司产品;四氮唑蓝(MTY),二甲基亚砜 (DMSO),胰酶等,均为美国Sigma公司产品,碱性磷酸酶染色所 需试剂均购买于北京中山生物技术有限公司.双龙接骨丸原药 购于成都同仁堂大药房.普通级SD大鼠共20只,雌雄各半,质 量250,300g,12,15个月龄(由华中科技大学同济医学院动 物实验中心提供). 参与者:研究设计者为严亚峰,王煜,马建;资料收集者及 干预实施者均为严亚峰. 干预措施:双龙接骨丸含药血清的制备:取双龙接骨丸成药 300g,主要成分有:脆蛇,广土鳖,当归,血竭,白地龙,续断,苏木, 茯苓,熟大黄,广木香,朱砂,龙骨,白芍,牛膝,乳香,没药,自然铜 等[21,加水2000mL浸泡48h后,武火熬开,温火再熬60min, 将药液滤出,再加水2000mL,武火熬开,温火再熬60mill,将药 液滤出.将两次所得药液混合后,用5层纱布过滤,并浓缩至 300mL(1倍量),即每1mL药液含生药1g,一20?冰箱冻存备 用. 普通级SD大鼠分为给药组10只,对照组10只.给药组按 照人与动物间药物剂量的换算方法…,计算出每只大鼠每天给 药液1.5mL(含生药1.5g),1次/d,共7d;对照组灌服生理盐 水1.5mL,1次/d,共7d.末次灌胃2h后右心室取血,将各组 血液于低温条件下(4?)下放置6h,3000r/rain离心10rain 后取血清.再将血清过滤除菌后4?冷藏备用"1. 成骨细胞的制备及鉴定:采用分离细胞培养法进行原代大 鼠成骨细胞的培养,并进行形态学和生化指标的鉴定.原代细 胞生长至基本汇合时,传代培养,将第3代细胞用于实验I5-". 成骨细胞的鉴定包括形态学观察和碱性磷酸酶(alkaZ/nephos. phatase,AI)染色.在倒置显微镜下观察,成骨细胞呈三角形, 多角形,纺锤形和菱形,胞浆丰富,有时可见突起.胞核大而清 592CN21-1470/ l R COrn3385083@COrn严亚峰,等双龙接骨丸对成骨细胞增殖和细胞周期的影响 "lm广业悻,寺)c)【嫩臂湘溅宵到删踏娼利到删周期彰 晰.呈圆形或卵圆形.ALP染色后,直接油镜观片,酶活动处呈 亮蓝色颗粒. 同浓度含药血清培养液的配制:各实验组所用培养液中 的血清浓度均为100mL/L,分别用对照组大鼠的血清和给药 组大鼠的血清将总血清中的含药血清浓度为30,50,100, 250.500.750,1000mL/L的DI~IEM/FI2培养液】. MTr法检测不同浓度含药血清对成骨细胞增殖的影响: MTT实验的分组:空白对照组,正常对照组和不同浓度的含药 血清组(30,50,100,250,500,750,1000mL/L),每组8复孔,相 同实验重复3次,并以3次实验结果的均数做统计学处理.成骨 细胞按5×10'L密度接种于96孔板,在100mL/L胎牛血清 DME1VI/FI2中培养24h,用D.Hanks液冲洗2次;换成无血清 培养液24h后,按照分组分别加入预先配制的培养基,继续培 养24h和48h.每孔加20LMTr溶液(5g/L),50mL/LCO:, 37?培养箱中孵育4h.然后取出培养板,每孔加入100L的 二甲基亚砜(DMSO).在微量混合器震荡5—10mln.在全自动 96孑L酶标仪上检测吸光度(A)值,检测波长630舢.9】. 细胞周期的测定:传3代成骨细胞按1×10.L密度接种 于6孑L板.在100mL/L胎牛血清DMEM/FI2中培养至细胞基 本长满.换成无血清培养液培养24h,再根据MTr测定的结果 选择适宜浓度的含药血清(100mL/L)处理细胞.每个药物浓度 3复孔.48h后,吸取培养液,2.5g/L胰酶消化,D.Hanks冲洗2 次,细胞计数后,细胞调整为2X10L的细胞悬液,离心,加入 700mL/L的冻乙醇2mL固定30min.1000r/rain离心.弃上 清,加入5g/L的Rnase50L,再加入450碘化丙啶(PI), 置于2,8oc避光处30min,上机检测. 主要结局观察指标:?不同浓度双龙接骨丸含药血清对成 骨细胞增殖的影响.?双龙接骨丸含药血清对成骨细胞细胞周 期的影响. 统计学分析:实验数据用SPSS11.0软件由作者本人进行 分析,各项参数均以?s表示.各组间比较采用t检验.P< 0.05为统计检验的显着性界值. 2结果 2.1不同浓度双龙接骨丸含药血清对成骨细胞增殖的影响 30mL/L含药血清组无明显的细胞增殖,与正常对照组相比, 差异无显着性意义(t=1.06,p>0.05);50mL/L含药血清组 对成骨细胞的增殖有明显的促进作用,与正常对照组相比,差 异有显着性意义(t=2.53,P<0.05);100mL/L含药血清组 明显的促进成骨细胞增殖,与正常对照组相比,差异有极显着性 意义(t=3.09,P<0.01).高于100mL/L含药血清组,即250, 500,750,1000mL/L含药血清组,均能明显的促进成骨细胞 增殖(t=3.32,3.54,3.87,4.12,P<0.01).对不同浓度含药 血清组进行两两比较发现,100mL/L与250mL/L含药血清 组之间相比,差异无显着性意义(t=1.98,P>0.05);500, 750,1000mL/L含药血清组组间比较,差异无显着性意义(t= 1.49,1.97,1.73,P>0.05).100mL/L与500mL/L含药血清 组比较,500mL/L组促进成骨细胞增殖的作用更显着(t= 2.46,P<0.05).见表1. 2.2双龙接骨丸含药血清对成骨细胞细胞周期的影响双 龙接骨丸含药血清组Go/Gt期细胞明显低于正常血清对照组 (t=3.36,P<0.05),而s期细胞比率又明显高于对照组(t= 4.71,P<0.01).100mL/L双龙接骨丸含药血清可促进成骨 细胞的活跃增殖.见表2. 表1不同浓度的双龙接骨丸含药血清对成骨细胞增殖的影响(A值) ?) 组别堡亘堕旦 24h48h 3讨论 20世纪80年代中期,日本学者1wa眦H采用动物血清进 行汉方制剂的药理研究,提出"血清药理学"的概念.这一方法 实现了体外与体内实验的结合,其实验结果与体内实验结果有 较好的一致性,其不仅反映药物中可吸收成分的直接作用,而 且能反映药物成分在机体作用下形成的代谢产物和药物诱生 的机体内源性物质的间接效应.该方法是目前中医药理研究的 热点. 双龙接骨丸主要成分中当归为君药,取其补血活血,和营 生新;自然铜可散瘀血,续筋骨,补充微量元素;续断,牛膝能温 补肝肾,添精养髓,温煦阳气而推动血脉流行;特别是没药和乳 香,前者专攻散瘀,取其推陈,后者调气活血,取其致新,两药合 用可宣通脏腑.疏通经络,在伤科治疗中具有非常重要的作用; 诸药合用能达到祛瘀,生新,合骨的目的.已知,成骨细胞是骨 形成,骨骼发育与生长的重要细胞,可合成和分泌20余种胶原 与非胶原蛋白质和一些骨代谢的局部调节因子,在骨重建中生 成类骨质和促进类骨质的矿化,形成的新骨质修补破骨细胞骨 吸收形成的陷窝.成骨细胞的增殖及其成骨功能对骨折的愈合 具有极其重要的意义.本研究发现,双龙接骨丸含药血清可促 进成骨细胞的增殖,并且随着含药血清浓度的增加,其促增殖 的作用增强;流式细胞仪分析的结果显示,双龙接骨丸含药血 清使成骨细胞DNA的合成增多,推动细胞由Go/G.期进入s 期,促进细胞增殖分裂. 结论:本研究采用血清药理学方法探讨双龙接骨丸对成骨 细胞增殖及细胞周期的作用,结果表明双龙接骨丸能有效促进 成骨细胞的增殖,这不仅为进一步证明该方疗效的确切性提供 更直接,更科学的证据,并为研究中药复方的作用途径和机制 开拓了新的实验方法. 4参考文献 1程珠炉,洪浩.中药血清药理学研究方法几点思考fJ】.安徽中医学院学 报,2001,20(2):53—5 2张希彬,张世明.中国骨伤科学【M】.成都:四川科学技术出版社,1991:829 3施新酋.现代医学实验动物学IM】.北京:人民军医出版社,1999:332 4师少军,陈汇,曾繁典中药复方药物代谢动力学研究方法及展望【J】.中 国临床药理学杂志,2001,17(3):235—8 5李靖,黄鲁豫,张颖,等,肿瘤坏死因子一"诱导成骨细胞凋亡时Bcl-2和 B"蛋白表达变【J】.中国临床康复,2003,7(23):3210 6殷晓雪,陈仲强,党耕町,等.人端粒酶反转录酶基因诱导人永生化成骨细 胞的生物学特征【J】.中国临床康复,20133,7(26):3550 7金小岚,袁成良,侯建红,等.骨髓基质细胞核结合因子.基因及成骨细 胞生成的影响【J】.中国临床康复,2003,7(11):1626—7 8陈弈,赵永芳,詹红生,等.昆山接骨片对体外培养大鼠成骨细胞的影响 【J】.中医正骨,2001,13(1):5—6 9王洪复,金蔚芳,高建军.骨质疏松症防治药物的体外细胞药效【JJ. 中国骨质疏松杂志.1999,5(2):58—62