重组腺病毒人体恶性肿瘤内注射体内外播散性研究

重组腺病毒人体恶性肿瘤内注射体内外播散性研究 重组腺病毒人体恶性肿瘤内注射体内外播 散性研究 现代预防医学2007年第34卷第3期ModernPreventiveMedicine,2007,V01.34,NO.3?403? 文章编号:1003—8507(2007)03—0403—03中圉分类号:R73—362文献标识码:A【论着】 重组腺病毒人体恶性肿瘤内注射体内外播散性研究 陆巍,陆维祺,朱隽,郑树 摘要:[目的]Elb缺失的重组腺病毒因其能在肿瘤细胞中特异复制,是目前较有希望的生物治疗方法之一,但 是其体内应用仍需慎重.本研究主要通过观察重组腺病毒人体体表恶性肿瘤内注射后体内外播散状况并推测其在试验期 内的环境安全性.[方法]收集参加Elb缺失的重组腺病毒H101临床试验病人的外周血,尿,粪,咽拭子,注射部 位皮肤拭子和肿瘤组织活检标本进行相应检测.[结果]聚合酶链反应检测,外周血H101DNA,d1,5,22阳性率 分别为:32.4%,40.6%,5.3%,尿,粪,咽拭子,注射部位皮肤拭子阳性率均为0;治疗前后抗人5型腺病毒抗体阳性 率分别是27.5%和61.1%;肿瘤组织腺病毒免疫组织化学检查,阳性6/9例.[结论]发现重组腺病毒H101在肿瘤内 复制和体内播散证据,未发现其体外播散证据,重组腺病毒体表肿瘤 注射,治疗期内环境安全. 关键词:播散;重组腺病毒;环境安全性 RESEARCHONDISSEMDATIONOFRECOM口 TUMORDEC. EIDTADENOvIRISDTRA— TIONINHUMANBODYWei,Wei—qi,ZHJuan,eta1.(DepartmentofGene ralSurgery, ZhongshanHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200032,China) Abstract:[Objective]Elbdeletedadenovimsisapmmlsingcanceroncolyticvirustherapywhichhasbeendeveloped recently,however,greatcautionshouldbepaidtoinvivo印 pKcationofreplicationcompetentvirus.Thestudyaimedtoobserve thedisseminationofrecombinantadenouvrusandevaluateitsenvironmentsafetyduringexperimentsession.[Methods]Clinical specimensofpatientstreatedwitllH101intra—tumormjectionwerecollecte dforH101detection.includingblood,urine,stool, pharynxswab,swabofinjectionplaceandtumorbiopsy.[Results]TheclinicalspecimensweredetectedforH101contamlna- tionbyPCRatdayof1,5and22,thepositiveratesofDNAinperipheralbloodwere32.4%,40.6%and5.3%respectively. Serumantibodylevelofadenovirustype5Was27.5%and61.1%beforeandaftertreatment.Adenoviruscapsulewasfoundin6/ 9patients.[Conclusions]H101candisseminateinhumanbodybutnotenviro nmentbyintra—tumorinjection.Itissafetothe environmentduringtreatment. Keywords:Dissemination;Recombinantadenovirus;Environmentsafety 病毒治疗是近年来发展起来治疗恶性肿瘤的新方法,目前 仍在试验性研究阶段,重组腺病毒治疗肿瘤是其中的一种,目 前有携人P53重组腺病毒治疗已通过临床试验[】圳,并获准上 市.但是病毒进入人体后的复制,体内,体外播散情况,人体 和环境安全性,需要相关实验室检查进行观察. H101是删除了E1B一55kD区基因片段的重组人5型腺病 毒,野生型腺病毒感染细胞依赖于E1B一55kD蛋白使P53功能 丧失,缺陷性病毒H101则不能在正常细胞中复制,但能在 p53基因突变的肿瘤细胞中复制,裂解肿瘤细胞.体外和动物 实验发现H101具有明显的抑瘤效应.被批准在人体进行临床 试验[4].我们通过对重组腺病毒制品H101临床试验中获得的 人体标本进行系列检查.观察其在体内外的播散情况.推测治 疗对环境安全的影响. 1与方法 基金项目:国家”863”高科技项目(2002AA2Z3304) 作者简介:陆巍(1975一),男,博士,主治医师 通讯作者:郑树.zhengshu@zju.edu.cn 作者单位:1.复旦大学附属中山医院普外科,上海,200032;2.浙江 大学肿瘤研究所 1.1材料 所有试验标本包括人体血,尿,粪,咽拭子,注射部位皮 肤拭子,肿瘤组织活检标本均取自参加重组腺病毒H101临床 试验病人.H101由上海三维生物技术有限公司提供.保存于一 20.C.经国家生物制品检定所检查.每西林瓶中0.5l11l病毒溶 液含5x10VP,比活为:<1:60TCID50. 1.2方法 1.2.1H101治疗方法用生理盐水将H101稀释成目标肿瘤 体积的30%,采用肿瘤内注射(IntraTumor,IT),每天1次, 每次1支,连续5d,观察16d为1周期.病人根据情况采用 1—3周期治疗. 1.2.2血,尿,粪,咽拭子,注射部位皮肤拭子中H101病毒 DNA特异性聚合酶链反应(PCR)检测: 收集试验d1,5,22之血,尿,粪,咽拭子,注射部位 皮肤拭子标本,经初步处理后,在一20?保存,最后统一采用 跨删除区特异性引物.上游引物:5一CTGGCGCAGAAG TATYCCAT一3.下游引物:5一GTCACATCCAGCATCACAGG一 3.扩增条件:预变性94?.10min;变性94?,60S,退火 55?,45S,延伸72?,90S,35个循环;补延伸:72?,10 min.产物经过1%琼脂糖凝胶电泳.该方法经美国FDA (GuidanceforIndustryonBioanalyticalMethodValidation)的检 现代预防医学2007年第34卷第3期ModemPreventiveMedicine,2007.”Co1.34.NO.3 验标准[6进行评价,灵敏度为小于103VP/ml.检测下线和可 信浓度均为105VP/ml[. 1.2.3血腺病毒中和抗体测定(ELISA)收集试验前及试验 d22之血浆标本,采用酶联免疫试剂盒(t-海晶美公司)检测 中和抗体方法如下:取病人血浆5按说明书操作,酶标仪 读取各孔0D值. 结果判断:临界值=0.10+阴性对照平均OD值(不足0.05 者按O.o5计算),标本测定值<临界值,结果为阴性.标本测 定值?临界值.结果为阳性. 1.2.4肿瘤活检组织标本重组腺病毒检测(免疫组织化学法) 完成试验后,9例病人采用细针穿刺活检获得活检肿瘤组织. 常规用福尔马林固定,石蜡包埋,切片,一抗为NeoMarker公 司抗人5型腺病毒单抗,DPX(BDH化工)封片.在光学显傲 镜下观察,着色区每高倍镜视野大于3O个染色颗粒定为阳性. 2结果 由于采用的是d1,5每天肿瘤局部注射重组腺病毒,22d 为1周期的治疗,收集到的d1,d5注射后6h内和d22 任意时间采血,PCR检测重组腺病毒结果见表1.d1和d5 阳性率分别为:32.4%和40.6%,d22阳性率为:5.3%,注射 d5较d1阳性率有所升高,差异不明显,但与d22比较差异 有统计学意义,分别为P<0.05和P<0.005.人体尿,粪,咽 拭子,注射部位皮肤拭子腺病毒检测:均为阴性. 表1血腺病毒PCR检测结果 采集治疗前1d和治疗后d22采血,ELISA法检测人5型 腺病毒抗体水平,结果见表2,可见治疗前抗体阳性率27_5%, 治疗后上升为61.1%,两者差异有统计学意义(P<0.001). 表2人5型腺病毒抗体水平 在治疗完成后总共取得9例病人肿瘤组织的穿刺活检组织 标本,发现有腺病毒存在的依据,其中阳性6例见图1A.阴 性3例见图1B. 3讨论 通过微生物治疗恶性肿瘤是一种新的生物治疗方法.但其 应用必须慎重.特别是病毒和病毒载体.虽然人5型腺病毒因 其广泛存在且不整合到宿主DNA,被认为有较高的安全性, 而用于基因治疗[.但是目前用于人体治疗的均为经人为改构 过的病毒或病毒载体,结构变异的病毒在人体的复制,播散, 清除情况需要通过有效的检测手段进行观察. 由于重组腺病毒肿瘤局部注射人体安全性已在临床试验中 【注)图A箭头所指显示为深棕色染色颗粒提示细胞中存在腺病毒感 染,而图B为阴性结果,图中无着色颗粒 图1注射H101肿瘤病灶细针穿刺活检标本 免疫组织化学检测5型腺病毒外壳蛋白 初步得到证实[3.6】,本试验主要目的为观察其体内,外播散情 况和环境安全性.我们发现,在局部肿瘤内注射腺病毒后,病 毒能在短时间(<6h)内随血流进入体循环,并在注射局部 进入肿瘤细胞内进行复制,复制可持续达22d之久,此时亦 可有复制的病毒释放入血.但与注射后相比,复制产生的病毒 释放人血导致病毒在体内播散的机率显着减少(P<0.05).同 时比较注射d1和d5的结果,可见d5在体循环中病毒播散 的阳性率高于dl.但差异无统计学意义(P>0.25),据此我 们推测,d1在体内播散的病毒主要为注射后引起的,而d5 入血播散的病毒包括当天肿瘤内注射后人血的病毒和在肿瘤中 复制产生的病毒释放入血两部分,两者叠加致使阳性率升高. 同期的尿,粪,咽拭子,注射部位皮肤拭子PCR检测结果均 为阴性,本试验未发现重组腺病毒向体外播散的证据,该结果 提示重组腺病毒体表肿瘤内注射,向体外播散的机会较小,具 有治疗期内的环境安全性.病人排泌物勿需特殊处理.对于是 否存在病毒变异传播等长期环境安全性而言,需要在较长的一 段时间内通过严密观察和流行病学调查,应密切关注. 虽然通过EUSA法检测血液中抗人5型腺病毒抗体的方 法并非特异性的检测抗H101重组腺病毒抗体.但是由于 H101是人5型腺病毒基因改造产物,删除Elb-55kD编码区 只是减少了一种早期转录因子.并不改变其包装后产生的病毒 (下转第415页) 现代预防医学2007年第34卷第3期ModemPreventiveMedicine,2007,Vo1.34,NO.3?4l5? 感染率最高,其次是单采血浆.这可能是因为混合献血人群献 血年限比较长.暴露机会相对较多.需要指出的是这次所调查 的既往献血人群HIV感染率为6.8%.这个数字并不能代表安 徽省示范区既往献血员的真实感染率,因为这次调查不包括调 查前已经确诊的因献血引起的感染者. 既往献血员对艾滋病的传播途径知晓率较高,这可能是因 为这些人群来自安徽省示范区.近年来对示范区开展了很多宣 传教育工作,另一方面既往献血员可能认识到自己是高危人 群,对相关知识的关注程度较高.尽管如此,他们对艾滋病的 预防知识的掌握还是不够的,尤其表现在女性,这可能与居于 农村的女性知识文化水平总体不高[41.HIV的”知信行”模式 认为欲改变行为,必须有知识和信息作为基础,转变行为的前 提是转变知识和信念,因此今后的健康教育中应该注意这些 现象. 既往献血员的安全套的使用率很低,尤其是女性.即使是 HIV阳性者也有近一半的人从不使用安全套.不同年龄分组比 较显示,年龄越高安全套使用率越低.这可能与他们(尤其是 年龄较大者)对通过性途径被感染和感染他人的风险认识不 足,安全套难以得到,受传统的性行为观念和方式约束等有 关.众所周知,安全套的使用在阻断艾滋病的性传播过程中起 着重要的作用【6.,而艾滋病高发区的献血人员(包括HIV阳 性者)安全套使用率如此之低,这种现状势必.不利于示范区艾 滋病疫情的控制.这提示今后的干预工作应致力于促进其对知 识的单纯了解到行为的转变. 参考文献: [1]全国艾滋病信息资源网络(www.chain.net.cn). [2]杨慧,黎少映,杨敏等.高校女生生殖健康及性传播疾病知识的 调查[J].现代预防医学,2004,31(3):403-405. [3]程华,钱序,曹广华,等.血站经营类型和献血方式对有偿献血 员感染HIV的影响[J].中国公共卫生,2004,20(9):1061— 1O63 [4]张明非,周莉,姜长友,等.珠海市农村居民艾滋病干预效果评 估[J].中国现代医学,2005,15(6):1671—1673. [5]林鹏,孙宝山,梁立环,等.社区女性工作者性病艾滋病知识与 性行为特征分析[J].疾病控制杂志,2004,8(2):118—120. [6]邵月琴,姜庆五,戴依群.艾滋病行为干预研究现状[J].现代预 防医学,2004,31(2):208—210. [7]程怡民.箍孕套的使用与艾滋病的预防[J].现代预防医学, 1999,26(4):479-480. I收稿日期:2oo6_o3—14) (上接第4O4页) 外壳和鞭毛结构,不影响其抗原特性,因此H101和野生型人 5型腺病毒抗原性类似.一般认为野生型腺病毒的存在范围较 广,具有较高的人群阳性率,在重组人P=53腺病毒注射液治疗 喉癌的I期临床试验中所有试验者血清中抗腺病毒抗体均为阳 性[3],但是本试验中入选病人群中注射前血液中抗人5型腺病 毒抗体阳性率仅为27.5%,可能与本试验选用抗人5型腺病毒 单抗有关,注射后22d血液中抗人5型腺病毒抗体阳性率显 着增加到61.1%(P<0.001),但仍有阴性者,原因尚不清楚, 晚期肿瘤患者免疫力低下可能是其原因之一. 本试验虽未能获得重组腺病毒在肿瘤细胞内复制的直接证 据,但是免疫组织化学结果表明注射后d22肿瘤细胞中存在 腺病毒,同时亦有腺病毒释放人血.一般来说.进人体循环的 病毒会通过抗原抗体反应或红细胞等非特异性吸附.富集于肝 脾部位而被肌体迅速清除,因此d22在血液中发现之腺病毒 应为在肿瘤内存在的病毒复制并释放人血所致. 溶瘤病毒及携带治疗基因的病毒载体治疗肿瘤是新兴的生 物治疗方法,在实验甚至临床应用中取得较好成绩,我国已有 携P53基因腺病毒治疗肿瘤药物上市.虽然被证实为人体安全 的,但是对于病毒类生物治疗药物临床应用的观察仍不应该松 懈,而且观察将是长期进行的.本研究为病毒类生物治疗药物 临床应用体内外播散及环境安全性提供了初步经验. 参考文献: [1]ZhangSW,XiaoSW,LiuCQ,eta1.Treatmentofheadandneck squamouscellcarcinomabyrecombinantadenovirus-p53combined withradiotherapy:aphaseIIclinicaltrialof42cases[J].NailMed JChina,2oo3,83(23):2023-2o28. 【2]ChenCB,PanJJ,XuLY.Recombinantadenovirusp53agentin- jectioncombinedwithradiotherapyintreatmentof叫Is0pIl|Ir)mgeal carcinoma:aphaseIIclinicaltrial[J].NailMedJChina, 2oo3,83(23):2033—2o35. 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