氯乙基亚硝基脲导致DNA股间交联的实验研究

氯乙基亚硝基脲导致DNA股间交联的实验研究 北京工业大学 硕士学位论文 氯乙基亚硝基脲导致DNA股间交联的实验研究 姓名:唐巍 申请学位级别:硕士 专业:生物物理学 指导教师:钟儒刚 20090501摘要 摘 要 氯乙基亚硝基脲是临床上重要的烷化剂类抗癌药物,但同时也具 有致癌副作用,能够引起二次肿瘤的产生。一系列的研究表明无论是亚硝基 脲的 抗癌作用还是致癌副作用都与股间交联的形成有关。因此,研究药物导致 的交联对揭示亚硝基脲的抗癌机理及其抗癌作用与致癌作用之间的差异有 着重要的意义。本课就是以此为出发点主要通过生物化学、分子生物学方 法研 究亚硝基脲导致交联的作用程度和交联率的变化趋势。 分别用琼脂糖凝胶电泳和荧光对氯乙基亚硝基脲导致的股问交联 进行了定性和定量分析。首先,通过琼脂糖凝胶电泳分别检测了司莫司汀 ?和卡莫司汀对质粒、扩增的交联 作用。结果表明,.导致的交联率随着反应时间的增长而逐渐增 加,个小时左右达到最大值。而与反应时发生断链,并且断链 的数量随着反应时间的增长而增多,链的长度也逐渐变短。其次,利用荧光染 料 与双链结合后激发荧光的性质来检测.和对小牛胸腺 的交联。先测定了 荧光染料的激发和发射波长以及与荧光强度对 应的浓度的线性范围,并实时检测了的淬火过程,从而确定了实验 条件。对、、的.和导致的小牛胸腺交联 进行荧光检测,同时紫外扫描.和在水中的分解情况,结果表 明,氯乙基亚硝基脲的浓度对其导致的交联率有显著影响,浓度越大交联 率越高,但不同亚硝基脲对交联率随时间的变化趋势存在明显的差异。 .在反应初始阶段存在一段交联率较低的“诱导期”,而后交联率经历快 速上升阶段最终在小时左右达到稳定的最大值。导致的交联率则没有 “诱导期”,由于分解较快使得的单碱基烷化产物迅速增多从而推动了交 联反应的进行,其经过快速上升后达到最大值,对的交联率在反应 后期有明显的下降趋势说明可能导致了断链。 在荧光分光光度法基础上建立了基于实时荧光定量仪的交联检测 方法,并分别检测了.、和导致的随反应时间变化 的交联率。得到了相比荧光分光光度法有更小误差更稳定趋势的交联率曲线, 进 一步验证了氯乙基亚硝基脲类药物导致的交联率随反应时间变化趋势,同 时表明此方法是一种更加简便、高效、稳定的检测交联的方法。 关键词氯乙基亚硝基脲;交联:凝胶电泳;荧光;,.?., ? . . ? . 助 ? ? . ? .;,.. . . .. . ? . ,, . ., ?, 曲?. .“ ” . .. . ?. “” . . , . , .. .. ...摘要 蔓曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼一一一一一;???????曼??一一一.鼍 ?. .. ,? ?. . ,衔 .. ?, : ,独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其 他 人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得北京工业大学或其它教育 机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名:编日期:五暂军么笪 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权 保留送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部 或部 分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密的论文在解密后应遵守此规定 雄月 签名:雄导师签名么剿日期:第章绪论 第章绪论 .研究背景 癌症是危害人类健康的重大疾病。年月日世界卫生组织发 表报告显示,癌症是导致人类死亡的最主要原因之一,年,癌症死亡人数达 万,约占所有死亡人数的%,而至年,癌症将超越心脏病成为全球头 号杀手。全球的癌症患者一直在稳步提高,根据世界卫生组织的报告,预计今 年 达到万人,全球死于癌症的人数预计达万人。全世界癌症导致的死亡人 数将继续增加,到了年,世界上可能会有万名新患癌者,其中万人 死于癌症【,。在中国,肿瘤引起的死亡率在所有病因中居第位,占.%,且 发病率呈上升趋势。据有关部门统计,我国每年癌症发病人数为万,死亡人 数为万,平均每分钟有人死于癌症,其中肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直 肠癌、乳腺癌、宫颈癌及鼻咽癌等种癌症占癌症死因构成的%以上。 从一个正常细胞转变为一个肿瘤细胞要经过一个多阶段过程,通常从癌前病 变发展为恶性肿瘤。这些变化是多个因素作用的结果,这些因素包括:年龄因素、 心理因素、生活方式因素、遗传因素和环境因素。指出人类%%癌症 与环境因素有关,例如烟草、酒精、辐射、感染、环境污染、化学制品、饮食和 药物等等,它是导致人类癌症的最主要原因之一。而在环境因素中,由化学物质 引起的癌症占%引。在世纪后半叶,人类开始对大量化学物质致癌进行了筛 选、鉴定、评价,并对其作用机理进行了广泛和逐步深入的研究。现有证据肯定 与人类癌症发生有因果关系的共达种,其中与环境污染有关的如砷,铬,镍,铍,镉 及它们的某些化合物等,同时在实验动物中能诱发癌症而缺乏流行病学调查证实 的化学物质约有数百种。化学致癌物中主要是遗传毒性致癌物,它的化学活性高, 可与细胞内大分子和靶作用,并将单个烷基或复合的烷基基团转移到 碱基的特殊位置上【.,同时还可以引起.蛋白质交联、.交联、单 链断裂、双链断裂和碱基改变等多种损伤。已确定的化学致癌物主要有:多环芳 烃化合物、氨基偶氮染料、芳香胺类、亚硝胺类、某些真菌毒素以及砷、镉等金 属及其化合物。 目前,恶性肿瘤的治疗方法主要有外科手术、化学治疗和放射治疗。化学治 疗作为癌症治疗的主要手段之一,近年来进展迅速。随着化疗药物种类的逐渐增 多,用药方法的不断改进,临床经验的不断积累,临床疗效日益提高,化疗己从 以前的姑息性治疗向根治性治疗过渡。根据抗肿瘤药物化学结构和作用机理不同 化疗药物可分为多种类型,包括烷化剂类、抗代谢类、抗生素类、植物类、激素 类及其它类药物。烷化剂作为一种细胞遗传毒性类药物是最早用于治疗恶性肿瘤北京工业大学理学硕士学位论文 的化疗药物,也是应用最为广泛的一类抗癌药物【。烷化剂与双链的共价连 接可以通过多种途径导致细胞死亡。烷化碱基可以导致异常碱基配对,使 ./.的正常互补配对关系改变,在复制时引进错误的碱基,导致原来正常的 遗传信息发生改变;鸟嘌呤烷化后不仅可以导致链的断裂而且能引起碱基 与核糖间的断裂,发生脱嘌呤作用,使核酸序列中产生一缺口,出现框移现象, 导致整个遗传信息密码子的读码错误【。此外,双官能烷化剂的细胞毒性较单官 能烷化剂要强。当双官能烷化剂产生分子间交联后,可以阻止互补双链在 复制时分开,因而阻碍的正常复制过程,导致有丝分裂不能进行,此外也 导致双链发生断裂【,】。目前,细胞遗传毒性类药物仍然是肿瘤药物治疗的 主体,也是世界抗肿瘤药物研发的重点领域。 .氯乙基亚硝基脲研究概况 ..亚硝基脲的基本结构 随着癌症逐渐成为威胁人类生命的头号杀手,如何攻克这一病魔已成为医学 界矢志努力的目标。自世纪年代 等人【最先开展对亚硝基脲类化 合物其基本结构如图.所示,其中与可以是相同或不同的烷基或酰基等 的研究以来,对这类化合物的研究就在不断深入,亚硝基脲特别是.氯乙基亚 硝 基脲中的一些化合物已经成为活性显著的抗癌药物。 厂霄?一 图.亚硝基脲类化合物基本结构 . ..氯乙基亚硝基脲的基本结构和性质 年,研究者发现.甲基.’.硝基.亚硝基胍对白血病 有效】,后来在这种全新的化学结构的基础上,.甲基.亚硝基脲 被证 明具有更好的抗癌活性。而的.位点的甲基被氯乙基取代后,其活性明 显加强,它就是氯乙基亚硝基脲类衍生物,基本结构如图所示。氯 乙基亚硝基脲易分解,如水解反应、见光或受热分解,一般都难溶于水,易溶 \/\/\, ~ /\/土认. 于乙醇、丙酮和等。位点的氯乙基取代是这一系列化合物的共同特征, 它使得亚硝基脲具有较高的活性,是药物发挥抗癌活性的主要基团。而位点取 代物的不同,可以使得分子的物理特性有所差异,比如:通过提高这一取代基团 的疏水性,可以提高整个分子的脂溶性,这对于亚硝基脲抗癌活性来说是非常重 要的,是这种高脂溶性使亚硝基脲可以穿越血脑屏障,治疗脑部肿瘤,这使得氯 乙基亚硝基脲成为少数能够通过血脑屏障的抗癌药物之一【毛。 ..氯乙基亚硝基脲类药物 氯乙基亚硝基脲是一类有效的双功能烷化剂【引,目前临床用亚硝基脲类药物 均为氯乙基亚硝基脲。具有代表性的临床药物主要包括二十世纪六十年代中期进 入临床使用的卡莫司汀,,七十年代上市的洛莫司汀 ,、司莫司汀,.,以及年推向 市场的尼莫司汀,、哌啶亚硝基脲和雷莫司汀 ,等拶】,其结构如图.所示。它们的抗瘤谱比较广, 对白血病、各种实体肿瘤脑瘤、霍奇金氏病、骨髓瘤、恶性黑色素瘤、恶性淋 巴瘤以及多种人类癌症如肺癌、乳癌、胃癌、直肠癌、结肠癌、睾丸癌等, 有良好的疗效【 ,’。目前,人们又合成出各种不同结构的亚硝基脲来改造其 特性, 更好的提高其疗效。其中,.氯乙基..肌氨酸酰胺..亚硝脲是一种 位被甲基化的,已被国际癌症协会确认在治疗恶性神经胶质瘤方面具有广 阔的应用前景引。另外,年月美国食品药品管理局新批准上市 的苯达莫司汀可用于治疗何杰金病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性 淋巴 细胞性白血病和乳腺癌等多种恶性肿瘤【,其对何杰金病和非何杰金淋巴瘤 治疗 的有效率分别为%%和%~%。 入/\/\/\ /\?\‖\/\ ~\嚣/ 卡莫司汀 洛莫司汀北京工业大学理学硕士学位论文 . /\/\/ /\/\/ “ 尼莫司汀 司莫司汀. \/\ . 、 \刀叫 /\/\//田哌啶亚硝基脲 雷莫司汀 图.临床常用的亚硝基脲类抗癌药物.??卡莫司汀 卡莫司汀又名卡氮芥,是人工合成的小分子双官能团烷化剂【制。由于其在小 鼠和早期临床试验中发现对中枢神经系统肿瘤有良好的疗效而受到关注。它一般 为无色、微黄色或微黄绿色结晶或结晶性粉末,无臭;溶于乙醇、聚乙二醇和甲 醇,不溶于水;熔点为?熔融时分解。主要特点是具有较高的脂溶性, 口服经胃肠道吸收,并易通过血脑屏障,给药后即可在脑脊液中检测得到。 此外在高剂量和常用剂量下未发现的药物动学参数有显著差异,而不同 途径给药也影响不大,比如动脉内推注给药与静脉推注相比仅在药物分 布的初期显示有所不同。主要经肾脏排泄,速度很慢,且大部分为其代谢 产物。临床上主要用于脑瘤、恶性淋巴瘤、骨髓瘤等的治疗,近来也用 于高剂量化疗联合对原发性及继发性脑瘤均有效,是目前联合化疗中不可缺少的 药物,可单独使用明显使症状缓解,也可与长春新碱、甲基苯肼联合应用提高疗 效。 ?司莫司汀. 司莫司汀是甲基环己亚硝基脲,为微黄带淡红色结晶粉末,对光敏感,几乎 不溶于水,易溶于无水乙醇、丙酮等有机溶剂,熔点为一。在化学结构 上,与相比的不同之处是其位上被甲基环己烷环取代。?的 脂溶性更高,为抗瘤谱较广亚硝脲类药物,其作用机制与相似。动物实 验疗效优于,且毒性为的/钆/。.进入血液后很快被 代谢,故.的半衰期很短【。同时,.又为双功能烷化剂,能 丑芒陋。第章绪论 导致股间交联。.易穿过血脑屏障,因此其在脑脊液中的水平和 血浆中相等。.主要用于脑瘤、大肠癌、胃癌及恶性黑色素瘤的治疗, 且?对脑瘤和恶性黑色素瘤的疗效与相似,与一般烷化剂无交 叉耐药性。 ?尼莫司汀 尼莫司汀是一种水溶性亚硝基脲类烷化剂,为白色或黄白色结晶状粉末,易 溶于水,遇光易分解。其主要抗肿瘤作用的机制与其他亚硝基脲类化合物相 似, 在生理条件下经过‘离子的作用形成氯乙基重氮氢氧化物和异氰酸酯,异氰 酸 酯可以通过耗尽谷胱甘肽从而抑制修复 。优于上述亚硝脲类抗癌 药之处为:为盐酸盐,具有良好的水溶性,同时又具有高度脂溶性。它可 通过血脑屏障,动物实验表明,静注后有%~%进入脑脊液,最高可达%。 具有较好的抗癌活性,对小鼠白血病、粒细胞白血病.、腹 水型乳癌、欧利希氏实体瘤等都有较好疗效。 .氯乙基亚硝基脲类药物的作用机理 ..氯乙基亚硝基脲的分解机制 与其它抗癌药物不同,氯乙基亚硝基脲在生理条件下能够通过水解反应产生 多种活性中间体进攻,,产生多种烷基化产物,如一氯乙基脱氧鸟 苷酸、.氯乙基脱氧鸟苷酸、.羟乙基脱氧鸟苷酸等】,其中. 氯乙基脱氧鸟苷酸被认为与横向交联有着重要关系】。由于.键的不 稳定性,其代访过程非常复杂。等人提出了氯乙基亚硝基脲可能的几种主 , 要水解机制【 一系列研究表明其中的途径如图.是其在生理条件下 分解的主要途径。在生理条件下,亚硝基脲分子很快被降解,分子在氨甲酰胺 处 分裂为异氰酸酯和重氮氢氧化物中间体,异氰酸酯能够导致胞内大分子中的 氨基 基团甲氨酰化从而使细胞受到损伤,而重氮氢氧化物则是与作用发挥抗癌 活性的主要物质。 等,用氘标记经.分析推断被碱基或核苷酸 催化分解生成氯乙基重氮氢氧化物是反应的限速步骤。课题组对标记 的,和.在水溶液中分解产物研究时发现大量的羟氯乙基 和乙醛出现在亚硝基脲的水解产物中,并提出了氯乙基正离子是一种重要的 烷化剂【引。北京工业大学理学硕士学位论文 卜’ ?, 黛?譬啦芬 卜?卜 ::“:: 阽?伽一峨?窿啦? 蠊陆旦 ? ?一 厂紫五 ?旦一驴陋?吣带一 厂?五 啦:兰吼&磐喝一‰ 图氯乙基亚硝基脲的主要分解机制 ...氯乙基亚硝基脲的烷化和交联作用 所导致的烷化加合物是由氯乙基或羟乙基在核苷酸位点的亲电取代 而形成的。在各种烷化产物中,鸟嘌呤和 位点的损伤作用已经成为研 究的热点,其中 位点具有较强的亲电性,该位点烷化产物的稳定性大大低于 非 烷基化碱基,并可通过咪唑环开环和脱嘌呤作用发生分解。等人研究了 .氯乙基亚硝基脲与小牛胸腺作用后的烷化产物,其中主要包括 ..羟 乙基脱氧鸟嘌呤, ..氯乙基脱氧鸟嘌呤,..羟乙基脱氧鸟嘌呤, ..羟乙基脱氧鸟嘌呤,..氯乙基脱氧鸟嘌呤,,.二鸟嘌呤 ,蹦。 乙基,和鸟嘌呤胞嘧啶乙基.交联产物 除了能够引起碱基的烷化损伤外,还能够导致股间横向交联。实 验表明氯乙基亚硝基脲导致股间交联的反应主要包括两个步骤图.:第 一步为氯乙基碳正离子中间体与一条单链上鸟嘌呤位点发生反应,形成 ..氯乙基鸟嘌呤,随后生成环化的中间体;第二步为中间体开环与另一 条互补单链上胞嘧啶位点发生反应形成.二元股间加合交联产物圳。生 成单烷基化产物的反应发生较快,而由单烷基化产物转化为交联产物则需要 较长 的时间,是限速步骤。值得注意的是,烷基转移酶可以除去第一步反应 中鸟嘌呤上的烷基,从而防止交联的生成。缺少的细胞称为细胞,对 亚硝脲类烷化剂敏感,而丰富的细胞则对亚硝基脲具有耐药性,因此检测肿 瘤细胞的可以作为选择性化疗的依据一?。 等证明了与合成的寡核苷酸反应的序列特异性及股间交联 所导致损伤的共价结构【,,确定了鸟嘌呤的位和胞嘧啶的位形成股间交 第章绪论 联,交联的效率与单加合物形成的效率成正比,且交联多发生在.富集的部 位, 尤其是含有连续鸟苷酸的位点,但交联并没有明显的序列特异性。 宫厂?一 一?? ? 图. 导致股间交联的机制 . 虽然氯乙基亚硝基脲具有较高的抗癌活性,但同时也有致癌副作用,能够引 起二次肿瘤的产生【。国际癌症研究所年公布了临床用亚硝基脲 药物中的三种具有致癌性,它们分别是:、和.,它们作 为药物可在应用相当长时间以后诱发病人的白血病等二次肿瘤产生。所以, 优化 这些抗肿瘤药物,在提高它们抗癌活性的同时降低其致癌性,具有非常重要的意 义。到目前为止无论是亚硝基脲的抗癌机制还是致癌机制都没有完全阐明,但一 系列研究表明二者均与导致形成股间交联有关副。本课题就是以此为出 发点通过对股间交联的研究来探讨亚硝基脲所导致交联的机理阐明 交联反应的动力学规律,从而为揭示亚硝基脲抗癌与致癌作用之间的差异提供依 据。 . 交联的检测方法概况 近年来,人们越来越多地认识到交联在抗癌药物研究中的重要性,并 由此建立了一系列检测交联的方法【。根据检测过程中交联剂作用对象 北京工业大学理学硕士学位论文 的不同:一类是交联剂直接作用于片段,通常是用质粒经过酶切的 线性片段或者人工合成的寡聚核苷酸进行实验,包括电泳、荧光染料法和高效液 相色谱.质谱联用.等方法;另一类是交联剂作用于细胞,然后检测 细胞内的交联水平,包括碱洗脱法、细胞荧光染料法和彗星电泳等。 荧光法:等人建立了中性值条件下荧光测定交联实 验【】。它是根据交联的“拉链效应即在高温加热变性后双螺旋打 开而互补配对完全丧失,迅速在冰浴中冷却时的交联部位将类似于一个拉 链使其余部分立即互补配对形成原来的双螺旋结构,同时利用分子荧光探针 能够特异识别并结合双链的特性来探讨交联率随反应时间的 变化规律以及各种交联剂的作用机制【。 琼脂糖凝胶电泳:本方法是也基于交联的“拉链效应”,根据在 电泳过程中单链和双链的迁移速度不同将交联的和未交联的 用此方法成功地对福莫司 分离,从而定性地检测的交联。等【 汀的致交联作用进行了研究。 高效液相色谱.质谱联用法:它能够分析交联的分子结构,进而 可以判断交联的形式和位点。交联剂作用于得到的产物可以直接进行液质 分析】,也可以对交联产物进行水解,使碱基和磷酸骨架分离,对脱落的 碱基进行分析,以降低质谱分析的难度。另外,根据与交联剂作用的在反 相液相色谱中变性后的单双链量的变化情况,并以质谱辅助检验,也能定量 】利用反相高效液相色谱和质谱成功地测定了交联剂 的交联率。等【 对的交联率及其序列选择性。 毗咯开苯并吖庚三烯二聚体. 彗星电泳:它是一种在单细胞水平上对交联进行可视性检测的 方法【】,近十年来发展十分迅速。它所需实验器材较少,实验耗材皆为常规 试剂, 避免了同位素的使用,因此这种方法适合在医院等需要高效快速结果的机构 使 用。 .本课题研究内容 氯乙基亚硝基脲是临床上重要的抗癌药物,其导致股间交联 是重要的抗癌机制,但目前关于该交联的作用机理尚未有明确的解释。本课 题以 此为出发点,采用琼脂糖凝胶电泳和荧光方法对股间交联进行检测和分析, 探讨不同在不同条件下的交联反应动力学规律,为阐明亚硝基脲与 的作用机理、揭示亚硝基脲抗癌与致癌作用的差异提供依据。 本课题通过琼脂糖凝胶电泳分别检测亚硝基脲导致的质粒、扩增 的股间交联,并比较卡莫司汀和司莫司汀作用的的交联时间与交联程 度之间的关系;根据荧光染料与双链结合后激发荧光的性质,研究小牛胸第 章绪论 腺在不同浓度的亚硝基脲药物诱导下交联率的变化趋势,同时结合对药物 水解性质和交联变性淬火过程的分析,对交联反应规律作出合理解释。在 此基础上,利用荧光实时定量仪和荧光染料建立了一套新的检测 交联率的方法。 第章电泳检测氯乙基哑硝基脲所导致的交联 第章电泳检测氯乙基亚硝基脲导致的交联 .前言 目前已经发展了多种检测股间交联的实验方法。早期是使用氯化铯梯 度离心法,该方法可测定生物大分子的分子量,当存在交联产物时,其分 子量与变性解链的单股不同,因而可用此法分离。后来又发展了若干简单 易行的研究股间交联的代替方法,其中电泳法因为其简便性得到了广泛的 应用。根据所利用的介质不同,电泳包括琼脂糖凝胶电泳、碱变性琼脂糖凝 胶 电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳【 。 本实验采用琼脂糖凝胶电泳检测亚硝基脲药物所导致的股间交联。琼 脂糖凝胶电泳利用了对热变性和迅速低温冷却的处理步骤。含有横向交联 位点的双股在加热?,以后将发生变性,双螺旋解开,彼此的 相互配对完全丧失,这时迅速放入冰浴中淬火冰浴中,交联的位点将类 似于一个拉链起点而使互补碱基立即配对,从而使复性形成原来的 双螺旋结构,这种“拉链效应”的复性速度非常快,每秒可有 ~个碱基对发 生配对【。而不存在横向交联的在同样条件下加热变性以后再使之迅速冷 却,由于不能发生上述“拉链效应”,碱基对难以恢复,仍是以杂乱无章的 单链形态存在。这时进行电泳,由于双链相对于单链具有较大的分 子量,迁移速度较慢,从而将二者分离开来。 .实验试剂和仪器 ..实验试剂 ?质粒:宝生物工程大连有限公司 :宝生物工程大连有限公司 ?限制性内切酶 北京天根生化科技有限公司 ?分子量 : ?核酸染料: 北京赛百盛公司 ?核酸染料: 美国公司 ?司莫司汀.、卡莫司汀: 公司 ?琼脂糖、三羟甲基氨基甲烷,分析纯、乙二胺四乙酸 ,分析纯、十二烷基磺酸钠,分析纯、硼酸分析纯: 北京鼎国生物技术有限公司 ?无水乙醇分析纯: 北京嘉仕腾试剂公司北京工业大学理学硕士学位论文 皇皇苎鼍皇曼蔓毫曼曼皇曼曼曼曼皇. 一一.鼍曼曼寰曼曼蔓皇罡 ?扩增引物和缓冲液: 上海生工生物工程有限公司 ?实验室用水为去离子水 ?溶液的配置 . 缓冲液:/ .., .,高 压灭菌后储存于 冰箱中。 . 电泳缓冲液: .,硼酸,调至., , 加水到,。保存。实验中将贮存液用蒸馏水稀释倍即为工作 液。 .%/丙烯酰胺:丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,加水至 装于棕色瓶内,可保存二个月。 .%过硫酸铵:过硫酸铵,加水至,保存可用周,.保 存可用个月。 .上样缓冲液: ,%?甘油,.% ,.%?溴酚兰 ?二甲苯青,.,?保存。实验中以×上样缓冲液/ 溶液/,上样电泳。 ,.%甲苯青,。保存。 .变性液:%?, , .退火缓冲液: ,..., ..实验仪器 ?电泳装置:型电脑三恒多用电泳仪北京市六一仪器厂; . 型琼脂糖水平电泳槽北京市六一仪器厂 ?高速离心机: 德国公司 ?凝胶成像系统:美国安莱公司 删// ?超纯水装置: 美国公司 ?恒温混匀装置: 德国公司 ?恒温水浴装置:.电热恒温水槽上海森信实验仪器有限公司 ?计:型台式酸度计美国公司 ?高压灭菌装置:.型座式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安 医疗器械厂 江苏海门市麒麟医用仪器厂 ?.型旋涡混合器: 吉尔森公司 ?微量移液枪: ?电子天平: 上海森信实验仪器有限公司 ?. 仪: 英国?公司 第章电泳检测氯乙基哑硝基睬所导致的交联 .实验方法与步骤 ..酶切质粒电泳 ...酶切反应 、酶切反应体系 将清洁干燥并经灭菌的 管编号,用微量移液枪分别加入 、限制性内切酶反应缓冲液和灭菌水,将管内溶液混匀后再加入酶液,用 手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。质 粒 酶切反应体系如下质粒终浓度:./: “. ./“ “ “ 总体积 、酶切反应条件 混匀反应体系后,将管置于?水浴保温?小时,使酶切反 应完全。 、终止酶切反应 反应结束后,直接将反应体系置于.?冰箱中冷冻,终止反应。 、酶切结果检测 将酶切后的分为管,每管.,加入.变性液和“上样缓冲 液,电泳检测酶切是否完全。 ...变性条件的确定 样品分别加入倍、倍、倍和倍变性 将酶切后的的两份 液后在一水浴中变性,随后迅速放入冰水混合物中淬火以上, 加入上样缓冲液进行电泳。 ...酶切质粒与药物反应 将管酶切后的质粒体系混合为管,各管总体积为“,北京工业大学理学硕士学 位论文 加入其中,上下轻轻 浓度为.“‖“。分别称取 ?、. 翻转,尽量使药物溶解。然后将其置于匣温震荡混匀器中,?进行反应。分别 在反应进行至、、、、时取样.至.薄壁管中,分别编号 、 、 、 为、、、、和 、 所取样品均放入.?保存。 ...变性淬火 向取出的样品及未与药物作用的对照组中各加入变性液, 。变性,然后迅速放入冰水浴中,冷却以上。 ...琼脂糖凝胶电泳检测交联 、加样 首先制备%的琼脂糖凝胶。然后在经过变性淬火的中每管加入. 的×上样缓冲液,用移液枪混匀,取.加入到上样孔中。作为对照组的分别 为:未与药物反应并且未经变性淬火的酶切质粒,每孔上样“; 未与药物反应但经过变性淬火的酶切质粒。 、电泳条件设定 电压,电流,电泳小时。使用凝胶成像系统电泳结果。 .. 扩增电泳 ... 扩增 在冰浴中,按次序将各成分加入一无菌. 管中,随后将其立即置 仪上,调整好反应程序执行扩增。结束反应后,产物放置于。待电泳 检测或.?长期保存。以下是扩增的条件和体系。 ?条件:热启动?,分钟 变性?,秒 退火.?,秒 延伸?,分钟 循环次 保存? ?体系.模板质粒,.. 引物、引物各 第章电冰检测氯乙基亚硝基脲所导致的交联 × 】 加补至“ 引物序列: . 扩增与药物反应后电泳检测交联 将扩增稀释倍后与药物进行反应,然后电泳检测其交联。操作 步骤与上述质粒的相同。 .结果与讨论 .质粒的酶切 限制性内切酶分为类、类和类,它们能特异地结合于一段被称 为限制性酶识别序列的序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链 。 限制性内切酶属于类限制酶.绝大多数类限制酶识别长度为 至个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列, 识别六个核昔酸序列: .?’,切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。纯度、缓冲液、 温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。质粒是环 状坝链载体,经限制性内切酶 切割识别位点,形成线性双链。 通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果,其在电泳图像中表现为共价闭环的泳 动速率大于线性双链。如图一,环状质粒经酶切后变为线性,在琼脂糖中 迁移的速率减慢,电泳图谱条带均~,无杂带,表明酶切完全。 :::质粒对照::酶切质粒 圈一 酶切的质粒的电泳图 兰至三奎茎圣耋堡耋兰堡篓耋 . 线性的变性条件 变性只是使双螺旋结构松解为无规则线性结构而不涉及到其一级结构 的改变。儿能破坏双螺旋稳定性的困桑都可以成为变性的条件,如加热、浓酸或 浓碱、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可破坏烈螺旋结构引起核酸分 子变性”?。因温度爿高引起的变性称为热变性,其机理为双链或天然 两条链之间的氢键断裂,两条链分离,形成无规则线团,但加热有时也会使磷酸 二酯键断裂,使链的完整性受到破坏,所以变性温度不能过高。变性液的成分中 含有和,它们能够使的变性更加完全。如图..样品中加 入三倍变性液经?变性冰浴淬火后已经基本变性完全并且条带相对较清晰。 :酶切质粒对【.:束加变性液.变性;:分别为加、、、倍体积变性液 变性::加倍变性液,变性:加倍变性液,变性 图酶切质粒的变性 . ?和导致质粒交联的电泳检测 天然经过热变性后两条链被打开,而与作片生成股间交 联的其双螺旋之间被共价连接.经过热变性不能完全打开。共价连接的碱 基对类似于拉链的接口,当从热变性状态迅速淬火时发生“拉链效应”而复 生成 为高度有序的双链。但是,不存在横向交联的取螺旋在同样条件 下变性淬火却不能发生上述“拉链效应”,使得碱基配对难以恢复,因而未交 联 的变性后取螺旋完全打开.在淬火后仍阻单链形式存在。反应体系中含有 的交联和未交联的,根据其变性淬火后分子量的不同,经过琼脂糖凝胶电 泳可将其分离。图和图为分别与.和反应的质粒 的琼脂糖凝胶电泳图。分别 和对染色后进行电泳图 。可以看出,用染色的电泳条带不够亮,并且染料的荧 光基团在紫外灯照射下会发生淬灭,丑;验证明经染色的电泳凝胶在紫 外灯下照射~条带基本消失。而染色的条带清晰.在紫外灯 下不容易淬灭,有利于保证实验结果的稳定性,因此奉蕈;验都选用染料:耋 墼丝塑墨二董垩垄茎星垦星蝥彗型耋璧 进行染色。图中泳道为对照,泳道为变性对照,泳道~ 为与?分别反应、、、、小时的,图中泳道~为 :::酶切质立;:酶切质粒变性对照: ~:与酶觇质粒分别反应、、、、小时 固和分别染色的司莫司汀作用后的的琼脂糖凝胶电泳晰 :::;:酶切质粒::酶切质粒变性对照 ~;与酶切质粒分别反应、、、、、、、小时 图经卡莫司汀作用的的电泳图 北京工业大学理学硕士学何论文 与分别反应、、、、、、、小时的。从图.可以看出, 双链条带在泳道中非常模糊,而在泳道中逐渐清晰起来,到泳道和 泳道已经变得十分明显,这说明当与.反应进行到时交联率还很 低,随着反应时间的增加交联率逐渐升高,在后交联的数量基本达 到稳定。而图。中~泳道中的条带都很宽很模糊,并且无双链 条带出现,同时条带的亮度随着反应时间的增加而减小,条带的位置也随着 反应 时间的增加而前移。这表明,与反应时发生断链,并且断链的数量 随着反应时间的增加而增多,链的长度也逐渐变短。据报道,亚硝基脲类药物 烷 化鸟嘌呤 位产生脱嘌呤作用能导致断链【, ,水解后生成的. 氯乙基异氰酸酯进一步分解得到的单臂氮芥对鸟嘌呤位的烷化是断链 的主要原因之一【啦】。断链数随着反应时间增加,经变性淬火后复性 所需的交联数也随之增多,当断链数超过交联数时,经变性淬火的主要以 短的单链形式存在。 .. ?和导致扩增交联的电泳检测 ... 扩增 本次实验扩增的是质粒上的一段长度为的 片段,具体的序列如下: ’’’ 气 上 ., 和 。在标准反应中采 它包含了质粒的两个酶切位点 用三温度点法,双链在?变性,再迅速冷却至?,引物退 聚合酶的作用下, 火并结合到靶序列上,然后快速升温至?,在 使引物链沿模板延伸。变性时若不能使靶基因模板或产物完全变性,就会 导致失败。但变性的温度不能过高时间不能过长,因为这会对酶的活性有 影响而降低扩增质量。图.分别是扩增条件改进前后的扩增电泳情 况对比。本次实验中首先选用的初始变性条件为?、,循环中?变性 ,但实际效果不理想出现拖尾和扩增不完全的情况,后来改用初始变性?、第 章电淋检测氯乙基亚硝基脲所导致的空联 ,循环中?变性,得到了比较好的扩增效果。退火温度是影响 特异性的重要因素。变性后温度快速冷却至~,可使引物和模板发生 结合。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序 列 的长度。在允许的范围内选择较高的复性温度可太大减少引物和模板间的非 特异 性结合, 提高反应的特异性。复性时间一般为~,足以使引物与模 板之间完全结合。本实验中,退火条件由?、改为.?、后扩增效 果有了明显的改善。反应的延伸温度一般选择在~之间,常用温度 为,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应的时间过长 会导致非特异性扩增带的出现,所咀在本实验中将延伸反应的时间由调整 为后取得相对较好的效果。另外,循环次数也是影响扩增效果的主要 因素之一,次数过少,得到的目的量不足,但次数过多会使错配几率增大 从而出现明显的非特异性扩增。所:本实验中,在扩增循环数为出现电泳条 带拖尾的情况后采用次循环得到理想的扩增效果。 :;:质粒;.:改进条件前的扩增;:改进条件后的扩增 图 扩增条件改进前后的质粒电泳图 培 .扩增与药物反应后电泳检测交联 扩增的与药物反应后电泳检测交联的原理与上述质粒的相同, 也是根据交联和未交联在变性淬火后分别以双链和单链形式存在,在电泳 过程中分离开来。由于扩增后目标的浓度大大增加,所以与药物反应 前应将扩增进行稀释。以扩增效率%计算,扩增后得到浓度大约为 /.,将其稀释倍后使与上述质粒与药物反应的浓度相同。图 和图分别为扩增与和反应后的电泳情况。根据琼脂 %的琼脂糖凝 糖凝胶的有效分离范围,扩增的使用 胶进行分离。可以看到,用扩增的片段与酶切质粒进行交联检 测相比较,趋势和规律基本相同,在反应“小时后交联比较明显,交联数基本 至三些奎兰圣耋坚:;兰堡尘圣 稳定,而与反应的的电泳条带模糊并且跨度大,也可以推断其出现 叫娃的断链。:盯 : :酶切质 对照;:酶切质粒变性对照 ~:与酶切质粒分别反应、、、小时 图经司莫司汀作刚的般链的琼脂糖凝胶电泳.盯 : ;:妇::酶切质粒;:酶切质粒变性对照 ~:与酶切质粒分别反应,、、小时 图经乍莫司汀作用的双链的琼脂糖凝胶电泳 .本章小结 通过琼脂糖凝胶电泳分检测.与酶切质粒和 扩增 的交联作用,发现经变性淬火后双链条带亮度随交联反应时间 逐渐增加。这表明了交联的量是逐渐增大的,在反应进行到小时趋于 稳定,小时后交联率基本达到垃大值。而在与酶切质粒和 扩增 的琼脂糖凝胶电泳图中看到其条带宽而模糊,并且无双链 条带出现,同时条带的亮度随着反应时问的增加而减小,条带的位置也随着反应第章电泳检测氯乙基?硝基脲所导致的交联 ?时间的增加而前移。推测可能是与反应时发生了断链,并且断链的 数量随着反应时间增多,链的长度也逐渐变短。 第章荧光法检测亚硝基脲所导致的交联 曼鼍曼曼曼曼鼍曼皇曼苎曼曼 . ‘.曼曼鼍曼曼皇曼 第章荧光法检测氯乙基亚硝基脲导致的交联 .荧光分析法概述 如前文所述,目前从分子水平上研究抗癌药物的性质以及与核酸作用机理的 方法比较多,包括电泳、荧光、紫外、液相色谱.质谱联用、圆二色谱、共振光 散射、核磁共振谱等。其中荧光分析法具有较高的灵敏度和较宽的线性范围,而 且仪器简单,已在临床检验、药物分析、环境污染物分析以及在生命科学、生物 医学科学研究中得到广泛应用。本实验以荧光探针与结合通过荧光法来检 测亚硝基脲导致股间交联的程度。荧光探针技术不仅可以用来测定药物. 核酸的互作用方式,而且能够通过荧光染料与单链和双链 结合的差异,在一定激发波长下所产生的荧光光谱不同而确定 和的量。荧光法 是利用物质发射荧光的特性进行 分析的光学分析法。分子发光按激发模式分类包括:光致发光:吸收外来辐射 光 子的能量而被激发,产生的次级光发,比如荧光;化学发光:被激发的能量来源 于化学反应;生物发光:生物体内化学反应所引起;热致发光:由热活化的离子 所引起的发光现象。物质分子吸收较短波长的紫外光后,能够被激发,在极短时 间内发射出波长更大的光即为荧光。它产生的原因是分子吸收光能后,基态分子 从基态跃迁到激发态,而从第一激发态的最低振动能级返回基态时,分子将以光 的形式释放所吸收的能量。 荧光检测的类型分为直接荧光检测和间接荧光检测。一些样品如少数氨基 酸:色氨酸、酪氨酸、苯氨酸及部分蛋白质、核黄素、水杨酸钠等本身可以发荧 光,可以直接进行荧光检测,即直接荧光测定,而对于那些本身荧光很弱或不发 荧光的物质需要使其转化成荧光物质再进行检测则是间接荧光检测。典型的间接 荧光检测有化学反应引导的荧光检测和制备荧光衍生物与荧光试剂反应生成荧 光衍生物,如溴化乙啶和结合的检测。本实验以 为荧光 探针与结合来进行荧光检测,因此属于间接荧光测定。溶剂、值、温 度、淬灭剂、样品浓度等环境因素都能影响荧光测定。同一种荧光物质溶于不同 溶剂,其荧光光谱的位置和强度可能有明显不同。一般情况下,随着溶剂的极性 的增加,荧光强度将增强,荧光波长也发生红移。当荧光物质是弱酸或弱碱时, 溶液的值对荧光强度有较大的影响。这是因为弱酸或弱碱在不同酸度中,分 子和离子的电离平衡发生改变,因此荧光强度也有差异。例如苯胺在~溶 液中会发生蓝色荧光,在小于或大于的溶液中都不发生荧光。大多数 荧光物质的溶液随着温度的降低,荧光效率和荧光强度将增加,相反,温度升高 荧光效率将下降。一般荧光分析仪器的基本构造主要包括光源、激发单色器、发北京工业大学理学硕七学位论文 射单色器、样品室、检测器、放大系统六大部分。相对于紫外.可见光度法,荧 光分析法的灵敏度高,检测下限在.?./之间;并且选择性好,可同 时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 荧光染料 是一类二苯并咪唑化合物畔,能够特异性地识别 型小沟区域三个连续的碱基对,它与结合后自身的荧光量子效率 可提高倍,是一种具有高选择性的荧光探针,广泛应用于结构及药物 生物功能等方面的研究【工】。小沟结合物代表了一系列具有序列特 异性并可能产生高度选择活性的的毒性试剂。该物质已经成为许多以发展同 系物 尤其是抗癌活性方面为目标的新药研究的起点。不同构型的包括超螺 结合效率不同。它结合到单链 旋、松散、环形、线性的构造导致 基因组产生的荧光与结合到双链基因组相比非常微弱,短片断的单 链和 按一定比例时并不能产生荧光,同时小于的 与它的结合效果也不佳。小牛胸腺能为许多植物和动物提供严格的 参考,因为它是一个高度多聚化含有接近%的双链, 与结合的荧光检测 结合到后能导致荧光的改变。利用 方法比吸收方法灵敏,结合 定量灵敏度是/。 .实验试剂和仪器 ..实验试剂 : ?司莫司汀.、卡莫司汀、荧光染料 美国公司 ?小牛胸腺. 美国公司 ?三羟甲基氨基甲烷,分析纯、乙二胺四乙酸,分析纯: 北京鼎国生物技术有限公司 ?无水乙醇分析纯:北京嘉仕腾试剂公司 ?溶液配制: . ? 置于烧杯中;加入约去离子水,充 方法:称量. 分搅拌溶解;溶液冷却至温室后,加入浓盐酸调节值至;将溶液 转移至容量瓶并定容至,。保存。 .. .置于烧杯中;加入约去离 方法:称量. 子水,充分搅拌溶解;加入约 颗粒,调值为.;将溶液 定容至;室温保存。第章荧光法检测亚硝基脲所导致的交联 .× ., 组分浓度: ? 、. 方法:量取下列溶液,置于烧杯中: ;向烧杯中加入约去离子水,均匀混合;定容至,室温 保存。 .存储液.‖小牛胸腺 方法:称量小牛胸腺,置于容量瓶中,加入. × ;向烧杯中加入约去离子水,均匀混合,定容至, ?保存。 .稀释缓冲溶液 组分浓度: .,. ,值. × 方法:取 于容量瓶中加蒸馏水定容。 .荧光染料贮存液组分浓度:/ 方法:称取 固体粉末置于容量瓶中,用稀释 .,. 缓冲溶液 ,.溶解,定容,得到 的贮备液。 / .荧光稀释缓冲溶液 . 方法:取 .贮存液于容量瓶中,加蒸馏水至 瓶颈,加入荧光贮存液,.加蒸馏水定容。 得到最终浓度:. , ./ ..实验仪器 ?平行合成仪: 美国公司 ?荧光分光光度计. 日本日立公司 ?分光光度计.: 日本日立公司 ?恒温水浴装置.电热恒温水槽:上海森信实验仪器有限公司 / / :美国公司 ?超纯水装置 ?恒温混匀装置:德国公司 ?计:型台式酸度计美国公司 ?制冰机:大连三洋制冷有限公司 ?电子天平:上海森信实验仪器有限公司 .实验方法北京工业大学理学硕士学位论文 ..确定 染料激发和发射波长 取 × 荧光染 用蒸馏水稀释至,再取 料贮存液加入其中,混匀,避光保存。取上述溶液于比色管中,加 /的小牛胸腺,混匀,用荧光分光光度计分别测量最大激发波长九 和最大发射波长九。 ..测定荧光强度与浓度的关系 荧光染料贮存液加入到稀释缓冲液中,得到浓度 取 为./的荧光缓冲溶液。分别取分装支包有锡箔纸的比色管中,依 次向支比色管中加入、、、、、、、、 的配制好拘/ 溶液,得、.、.、、.、.、、.、./ 的标准系列溶液,每个浓度做三个平行。将荧光光度计的激发波长设定在 处,发射波长设定在处,测定荧光强度。 ..荧光强度随时间的变化 取小牛胸腺样品/加至含荧光染料的稀释缓冲 液中,混合均匀。立即通过荧光分光光度计进行时间扫描,扫描时间为两个半 小 时,检测荧光染料与结合后激发荧光在时内的是否有较大的变化。 ..交联淬火过程的检测 取. 储存液‖加入到离心管中,加去离子水 进行稀释。将其放置于恒温混匀振荡器上,设置温度为?。取适量溶于乙醇 的.或,计时开始反应。当反应进行到小时,从离心管中取出 适量样品到装有荧光稀释缓冲液的比色管中,混匀,?变性后立即 放入荧光分光光度计样品已用循环冰水浴降温至?中扫描荧光值。 分别用不同的药物浓度和浓度重复该实验。 ..荧光分光光度法检测交联 、配置小牛胸腺试液,浓度为,通过紫外检测其纯度/ ?.~。 比值在...之间,摩尔吸光系数为 、取容量瓶一个,用锡箔纸包好;加入约的稀释缓冲液,然后加 入. 稀释倍,然后再加入缓冲液定容至 /的第章荧光法检测亚硝基脲所导致的交联 ? 皇曼曼曼曼曼曼曼鼍苎曼皇曼皇曼苎毫 皂曼曼 ,混匀,迅速用锡箔纸包好;然后将其用移液管分装至×支包有锡箔 . 纸的比色管中,每管,按顺序标好序号.、 和”.”;组管 做为对照。 、取 试液至平行合成管中,在?平行合成仪上预热。 ,将其分别溶解至乙醇 、用电子天平称取 ?或 中,然后用移液枪分别转移至预热的 中药物浓度均为,打开 搅拌并开始计时。在药物浓度为和时分别取上述溶于乙醇的药物 和.。 、当试液中加入药物开始计时后,在不同时间点取溶液.分别 加入到之前标号的比色管中,混匀。取样时间点及对应的比色管标号如下: 、待全部反应结束后从每管中取出每管中约剩余,转移至包有锡箔 纸的玻璃比色管中,在?变性分钟,迅速在冰水混合物中冷却,之后 在室温的水浴下放置分钟以上。 、以加入 的稀释缓冲液作为参比溶液,测定经变性淬火和 未变性淬火溶液的荧光值,记录数据。根据如下公式计算不同时间 交联率%: %?///】×% 其中和分别为.管在变性后和变性前的荧光值,和分别为 管对照在变性后和变性前的荧光值【引。 、用同样的方法分别检测浓度为、和的.和 对小牛胸腺的交联率。 .. .与分解的测定 、.的水解 .溶于无水乙醇,从其中取出 用电子天平称取 溶液加入到的去离子水中.,混匀,立即在?紫外扫描其在 范围中吸光度的变化,每扫描一次,共扫描两小时。 、的水解 溶于无水乙醇中,振荡均匀,从 用电子天平称取. 中取出“至去离子水中.,混匀,同样在紫外扫描其在北京工业大学理学硕十 学位论文 范围中吸光度的变化每扫描一次,共扫描两小时。 ..检测不同浓度药物导致的交联率 配置不同浓度的..、、、、、、 和.、、、、、分别与小牛胸腺 /进行反应,当反应到小时取样检测其交联率,操作步骤与上述 荧光分光光度法检测交联的步骤相同。根据各浓度药物的交联率做 出曲线图。 .实验结果与讨论 .. 染料激发和发射波长 与双链小牛胸腺结合后的最大激发波长九与最大发射波 长九,分别为硅,.如图.所示。?如 图. 与双链小牛胸腺结合后的最大激发波长和最大发射波长.? ..荧光强度与浓度的关系 荧光缓冲溶液中系列浓 图.为在浓度为./的 度与荧光强度的标准曲线。由图可知,双链在./范围内其浓度 与荧光强度成线性相关。使用统计软件进行数据分析,得到回归方程 为..,相关系数.。由于荧光染料的量是一定的, 因此只能与一定量的结合,当浓度逐渐变大时,荧光染料的结合量第章荧光 法检测亚硝基喙所导致的交联 ?? ? 苎鼍曼曼曼苎曼曼蔓曼曼曼皇曼鼍曼 曼曼曼。一? 达到饱和,所测得的荧光值不再随着浓度的增加而变大,其曲线呈平缓趋 势。因此,在测定药物对的交联实验中,所选取的最大浓度为 /./,其次分别为,/、./、./,使得荧光染料与 结合的荧光值落在线性范围内,以确保荧光染料是过量的。 浓度/ 图. 系列浓度与荧光强度的标准曲线.? ..样品荧光强度随时间的变化 这种染料对或经%冷乙醇固定的细胞可立即染色。当 荧光染料与蚓结合后,其荧光值随时间并不是一直维持恒定, 并且荧光染料本身也会发生荧光淬灭效应使得荧光值不能恒定保持在初始 值而 是随时间逐渐降低。如图.所示,在荧光染料与结合的最初的两个半小 型 嚎 簧 粼 图. 荧光强度在起始.小时内的变化 . . 北京工业大学理学硕士学位论文 时内对荧光值进行了扫描,发现荧光值随时间的延长会有所下降。在最初. 内荧光强度下降的百分比为.%。因此,我们在计算交联率时,使用公式 %肛.///】×%消除系统误差。 ..交联的淬火过程 当样品经过?、变性后,除交联的点之外双链基本上完 全打开。立即放入冰水浴中,有交联点的就在“拉链效应”下迅速复性, 双链随时间逐渐增多,当有交联点的都复性之后,样品溶液中双链 的含量趋于稳定。可见,淬火是一个动态的过程,而通过检测不同时间的 荧光值来跟踪淬火过程中的复性过程为淬火时间的确定提供了依据。分别 对不同浓度的司莫司汀和卡莫司汀、、作用的的淬火 过程进行检测。可以发现,浓度越高荧光强度越大,在淬火过程中形成双 链的量也越多图.。而在不同浓度药物作用的中,浓度高的药物作用 絮 芸 杈 时网 蓉 鬟 弑 时同 图.不同浓度的淬火过程 .第章荧光法