应用焦磷酸测序技术行HPV分型检测及HPV16甲基化状态与宫颈致癌作用研究（可编辑）

应用焦磷酸测序技术行HPV分型检测及HPV16甲基化状态与宫颈致癌作用研究（可编辑） 天津医科大学 博士学位论文 应用焦磷酸测序技术行HPV分型检测及HPV16甲基化状态与宫颈 致癌作用研究 姓名:胡元晶 申请学位级别:博士 专业:妇产科学 指导教师:薛凤霞 20100501天津医科大学博十学位论文 中文摘要 一、 焦磷酸测序技术行宫颈脱落细胞高危型分型检测 目的:评价焦磷酸测序技术在分型检测中的应用价值,分析此方法的 准确性、检出高级别宫颈病变的有效性,及应用于临床检查和大规模筛查的 可行性。同时获取以阴道镜门诊患者为研究人群的感染比例及所感染 病毒型别的分布。 内容:以名阴道镜门诊患者为研究对象,所有患者均接受宫颈液基细胞 学检查、检测、焦磷酸测序分型检查。评估焦磷酸测序 技术在宫颈检测中的应用价值;分析焦磷酸测序?检查结果与 及以 检测的一致性;评价焦磷酸测序技术检出宫颈高级别病变 上病变的价值;分析研究人群中?型别分布。 方法:应用焦磷酸测序法检测型?包括,,,,,, ,,,,和感染。自宫颈液基细胞学检查剩余细胞中提取 ,经通用型引物扩增后,行焦磷酸测序检测以上型?,其中 每四种型别测序引物至于同一反应池中,仅需分钟即可完成测序 反应。分 析此种检测技术与美国唯一认证的临床检测手段???方法检测 出感染的一致性;评价其作为富颈癌及宫颈癌前病变筛查手段的 有效 性;根据测序结果确定标本中特异型别的?感染,了解研究人群中 感染的型别分布。并将通用型引物阳性而焦磷酸测序阴性标本的 产物纯化、克隆后行传统测序分型检测,确定所感染的型别。 结果:经焦磷酸测序检测,发现例研究对象中?感染例,其中 单一感染例,双重感染例,检测出种?感染,, ,,,,,和。?感染中, 感染率为.%,占第一位;感染率为.%,占第二位。焦磷 酸测序检测出的感染率与宫颈病变呈正相关关系值为 .,.;此方法检出高级别宫颈疾患的敏感性和特异性分别为% 和.%,曲线下面积为.;焦磷酸测序检测与?方法有 高度的一致性值为.,.。 结论:焦磷酸测序检测技术应用于检测与~方法有很好地一致性, 天津医科大学博学位论文 并可以进行分型检测。其对宫颈 及以上病变具有很好的检出率。 是宫颈癌及癌前病变筛查的有效手段。 二、 应用焦磷酸测序技术对 片段’端和上位点甲基化 水平行定位、定量检测并分析与致宫颈癌作用相关性 目的:应用焦磷酸测序技术定位、定量检测位于 片段’端和 上的个甲基化位点的甲基化率,分析比较无宫颈病变携带者、患 者和 宫颈癌患者间各甲基化位点甲基化率差异,了解甲基化与其致病 性的 关系。 内容:以阳性的无宫颈病变病毒携带者、患者和宫颈癌患者各 例为研究对象,研究各组患者所感染病毒片段’端和片段甲 基化位点的甲基化状态,分析评价甲基化与其致病性日关系。 方法:选择阳性的无宫颈病变病毒携带者、患者和宫颈癌患者各 例,使用宫颈液基细胞学检查剩余细胞提取,经重亚硫酸盐处理 后, 分个片段扩增 片段’端和区域此区域包含/启动子 增强子及结合位点,应用焦磷酸检测技术经测序分析检测研究片段所涉 及的个位点甲基化状态,比较每一个甲基化位点甲基化率在三组患者 问是否存在差异,评价甲基化与其致病性间的关系。 结果:经定位、定量检测目的片段上个位点甲基化水平,发现 位于/启动子的个甲基化位点均存在随病情进展甲基化率逐渐减低趋 势,在无宫颈病变病毒携带者、患者和宫颈癌患者三组问存在显著性差 异。位于片段’端,,三个位点的甲基化率在三组间存 在显著性差异,和位点无病变携带者甲基化率最低,宫颈癌者甲 基化率最高,位点组甲基化率最高,宫颈癌组次之,无病变者最低。 结论: 片段’端及/启动子位点甲基化率在三组患者中 存在显著性差异,这种甲基化差异可促进与宿主基因整合、/癌 基因表达从而导致宫颈癌的发生。甲基化状况可能成为鉴别自 愈性或致病性感染的手段,预测宫颈癌前病变及宫颈癌的发生,并且可能能 够为进一步的治疗提供新的靶点。 关键词:人乳头状瘤病毒分型检测宫颈癌焦磷酸测序甲基化天津 医科人学博士学位论文. : ., .. . :., ? , ? ., ... : . ,.? , . . . . .,, , . : . ?. , ,,,,,, . ., ,, .%..%. . ? .,.. .%.% . ..,. ?. .天津医科人学博十学位论文 ?. :? ,.’.: : ’ ,. , ’ . :,,.. ’. ’ .: . , ,’. . / : , , , , . . ’ . , . . , . , : ’ / , . , ..: 天津医科人学博十学位论文 缩略语/符号说明人乳头状瘤病毒高危型人乳头状瘤病毒 焦磷酸测序 宫颈上皮内瘤变 侵润性宫颈癌 宫颈液基细胞学检查 印 宫颈液基细胞学杂交捕获法一 聚合酶链反应 三磷酸脱氧核苷酸 焦磷酸基团意义不明的不典型鳞状上皮细胞 低度鳞状上皮内病变 高度鳞状上皮内病变 不典型鳞状上皮细胞 不除外高度病变 一半乳糖苷酶的活性诱导物 一半乳糖苷酶底物 ? 人脐静脉内皮细胞 啪 胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸 晚基因区 早基因区 / 早基因/区 长控制区天津医科人;乏博学位论文 .‘?‘一 月吾 研究现状、成果 子宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤,全世界每年新发宫颈癌约. 万,我国约有力。子宫颈癌是唯一一种病因明确的恶性肿瘤,几乎全部的 宫颈鳞癌和绝大多数的宫颈腺癌组织中至少可以检测到一种高危型感 染,高危型持续感染是罹患宫颈癌的直接原因。在目前已经发现的 余种型别中,已确定余种与宫颈癌的发生有关,其中和 型是最为常见的型别。 在过去的近年中,宫颈细胞学涂片的广泛不展使宫颈癌的发病率和死 亡率大大下降,在发达国家,宫颈癌发病率降低了%%。然而,单一的宫 颈细胞学检查发现宫颈癌前病变及宫颈癌的敏感性并不是很令人满意的。研 究证实通过细胞学检查发现宫颈癌及癌自百病变的敏感性和特异性分别为 %一%和%一%。细胞学检查敏感性、特异性差异与制片技术及医生阅 片水平有关,与之相比,检测具有较好的客观性。宫颈细胞学检 查联合?检测可以提高宫颈癌及癌前病变筛查的敏感性。另外, ?检测不仅可筛查出已经患有高级别宫颈疾患的患者,还可识别有 潜在危险性的人群。此外,高危型检测对宫颈高级别病变具有很 高的阴性预测作用,也就是说如果高危型阴性,就没有宫颈病变。因 而检测对细胞学检查结果不明确者有很好的分流作用,可以确定更具 危险性的病例性,对这部分病例再行进一步阴道镜及宫颈活 组织检查,减少了大量不必要的阴道镜检查。在宫颈疾患治疗后随访中, 检测较细胞学检查检出持续性和复发性的敏感性更高,是宫颈 疾患治疗后随访的有效手段。目前,多数国家常规应用检测作为一线 筛查中宫颈细胞学检查的分流手段,在美国等国家,已经将?检 查与宫颈细胞学检查联合作为一线筛查手段。 目前高危型检查方法包括杂交捕获技术、型特异性检测技术、实 时荧光定量技术、以为基础的产物测序技术、产物限制性片段多态性 分析、产物的杂交分析微孔板杂交、反向杂交及基因芯片检测技术等。天津医科人学博学位论文 每种检测方法都具有不同的优势与不足之处。其中仅有杂交捕获法 ,为美国认证的可应用于临床的检测手段,然而此种 方法亦存在一些缺点,例如:不能将高危型进行分型检测、市场价格昂贵, 不能在发展中国家广泛应用于筛查。除此之外,作为杂交反应,存在交 叉杂交的问,即与不在混合探针中的其他型起交叉反应引起假阳性结 、、一、一、 果而降低特异性。例如在 阳性标本中检测出 、一、、这几种不包括在混合探针中的型别,造成假阳性结果。 由于不同型别的致病性存在很大差异;不同型别感染可能导致不同病 理类型的宫颈癌;不同地区间?感染型别存在差异;不同型另?混 合感染和不同型别?的病因学和持续感染情况还不清楚,因而?分 型检测存在非常重要的临床意义。由于目前缺乏体外培养系统和可靠的血 清反应物,的分型几乎完全依赖于其分子学特性。用于病毒分型的基因位 置的选择是严格的,这个部位需要有充分的区分能力来区分所有不同的基因 型甚至亚型和变异体。根据定义,如果开放阅读框中特定的有% 不同就属于不同的型,据此,可确定新发现的型别并可设计出 分型检测方法。目前存在的特异性检测技术、产物杂交分析技术及产 物测序技术等虽能进行分型检测,但存在特异性低或过程繁杂耗时长或造价 高等缺陷,不能为临床广泛应用。因而寻求一种新型能够进行分型,准确 性高且快速价廉的高危型检测方法是非常有意义的。 焦磷酸测序技术是近年来发明的一种新型测序技术,可以快速准 确 地检测短片段序列以内,其特点是操作简便、大通量、自动化, 适合大量样本的快速检测,序列无须荧光标记等,是一个理想的遗传分析技 术平台。此外,该技术是目前唯一能对甲基化模式进行直接、绝对定量的技 术。焦磷酸测序技术原理:焦磷酸测序技术是由种酶催化的同一反应体系 中的酶级联化学发光反应,在每一轮测序反应中,只加入一种,若该 与模板配对,聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸 基团。可最终转化为可见光信号,并由软件转化为一 个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成难比。然后加入下一 种,继续链的合成。是一项全新的测序技术, 可以快速、准确地测定一段较短的目标片段,具有很好的可重复性。 近年来,美国学者研究出最新的 分型技术,即应用焦磷酸测序进天津医科大学博士学位论文 行前哨碱基分型方法。在这个测试分型实验中,将单个的碱基比作前哨,提 示特异的型别的存在。添加一个含有很多三物的载体到已扩增的 中进行测序反应,每个测序的引物被设计同某个特定的型别进行杂交, 产生针对每个型别的特定的序列模型,在这些序列中,前哨碱基的位置和身 份提示被设计的高危型别的存在,此方法可检测种常见的高危型 包括,,,,,,,,,,和,完成整个 种型别的检测所需要的核苷添加物不超过个,整个测序反应时间少于 分钟。具体方法为运用/ 和/引物系列,以的区域为 模板,扩增出和片长的产物:使产物变成单链;单链 产物同含有多重引物的载体杂交:焦磷酸测序确定是否含有以上种 亚型感染。该实验结果证实前哨碱基分型技术是一种灵敏度和特异度较高, 快速经济的分型技术。 多数患者感染后可经自身免疫力将其清除,仅约%患者会发生 持续感染,进而可能发展为宫颈癌前病变或宫颈癌。目前存在的检测技术 及其他检测手段尚不能够区分自限性感染者和可能向肿瘤进展的患 者。因而性的检查结果使多数不会进展为宫颈癌的患者增加了不 必要的 心理负担,同时也因需密切随访增加了患者及社会的经济负担。因而我们希 望寻求到一种能够区分自限性感染和致病性感染、预测宫颈癌前病变 及宫颈癌的有效手段,从而为减少对多数性患者的重复检查,进一 步了解致宫颈癌的机理,并且可能能够为进一步的治疗提供新的靶点。 表观遗传是指非基因序列改变所致基因表达水平的变化,这种变化可通 过减数分裂或/和有丝分裂遗传。表观遗传调控分子基础有两个方面:即针对 本身的修饰和对组蛋白的修饰。研究发现基因沉默或表达在染色质结构上 有一定的规律,如甲基化总能在沉默染色质上发现:组蛋白的乙酰化促进 基因转录,而去乙酰化抑制基因转录;组蛋白特定氨基酸残基的甲基化可促 进基因转录或抑制基因转录如一、。表观遗传修饰影 响细胞生长、分化、凋亡、转化以及肿瘤发展相关基因的转录。目前研究表 明,多数约%高危型感染可以自动清除,高危型感染后.卜.% 可能发生 及以上级别的宫颈疾病,故需进一步寻求感染致宫颈癌的 其它相关因素或标记物。高危型中感染占首位且具有最强致病性。 研究证实低于/具有转录活性,推测可能由于表观遗传学的改变如甲天津医科火学博十学位论文 基化作用抑制了多数拷贝的活性。致癌作用与整合有关,整 等人研究发现 合后病毒片段功能缺失,致、基因表达失控。 位于上结合位点的甲基化状态,在病毒的生命周期中是有变化的, 从而调节的功能。年 等首次研究在不同临床标本中 的甲基化状态,发现的增强子的甲基化在宫颈涂片正常者高于宫颈上皮 内瘤变和侵润性宫颈癌。后来,又有一些学者针对甲基 化状态与其致病性关系进行了研究,然而结论尚存在争议。我们希望通过 一特定位点的定量甲基化状态的检测寻求其与致病性的相关性, 进而有可能在众多的感染者中识别可能发展为宫颈癌前疾患或宫颈癌 的患者,对这部分患者密切追踪或给以相应的治疗,这样既节约了医疗资源 又提高了宫颈癌的防治效果,因而此项研究具有非常重要的临床实用意义。 目前存在基因特异位点甲基化研究方法众多,如甲基化敏感性限制性内 切酶一/法、甲基化特异性法、甲基化敏感性单核苷酸引物 延伸法、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法、甲基化敏感性单链构象分析法、 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳、甲基化敏感性解链曲线分析、直接测序法 等许多中检测手段。检测手段种类繁多一方面说明了甲基化改变对于基因表 达的重要性,另一方面也说明了检测基因甲基化存在较大的实验难度。以上 所述的各项检测方法存在着因酶消化不全出现假阳性的问题、只能对基因甲 基化进行定性而非定量研究、不能够确定甲基化的具体位点、检测多个位点 需设计多个引物多个酶切位点、试验步骤繁琐复杂,价格昂贵等问题。 焦磷酸测序技术能够快速地检测甲基化的频率,对样品中的甲基 化位 点进行定性及定量检测。焦磷酸测序检测甲基化状态时,将引物设计为位于 位点之间的稳定的区域,并可以通过一个引物扩增序列检测多个连续的 位点甲基化率。应用焦磷酸测序技术检测.甲基化状态时,首先将待 测经重亚硫酸盐处理,使所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反映转变成 了尿嘧啶,但是一甲基胞嘧啶不发生转变;然后经扩增,尿嘧啶转换为 胸腺嘧啶,而一甲级胞嘧啶部位经扩增后仍为胞嘧啶,因此甲基化位点就成 为一个普通的单碱基多念性位点,其中等位基因的频率即为基因甲基化的程 度;焦磷酸测序,检测待测位点/比例,经软件分析计算出相应位点 的甲基化状态。等建立了针对综合征和? 综合征的基因甲基化检测平台,检测率达到%。验证了焦磷酸测序 天津医科人学博十学位论文 技术在甲基化检测中的应用价值。由于焦磷酸测序技术可对基因甲基化进行 定位定量检测,且测序技术的可靠性及精确度很高,此外操作简便、大通量、 自动化,因而在基因甲基化研究中凸显其优势。 研究目的、方法 研究目的:本研究旨在评价焦磷酸测序技术在分型检测中的应用 价值,分析此的准确性、检出高级别宫颈病变的有效性,及应用于临床 检查和大规模筛查的可行性。同时获取以阴道镜门诊患者为研究人群的 ?感染比例及所感染病毒型别的分布。应用焦磷酸测序技术定位、定量 检测位于片段’端和上的个甲基化位点的甲基化率,分析 比较无宫颈病变携带者、患者和宫颈癌患者问各甲基化位点甲基化率差 异,了解甲基化与其致病性的关系。以期获得标识感染后可能 进展为宫颈癌的标记物及阻断癌前病变进展、宫颈癌发生的新的治疗途径。 研究方法:应用焦磷酸测序法检测型?包括,,,, ,,,,,,和感染。白宫颈液基细胞学检查剩余细胞 中提取,经通用型引物扩增后,行焦磷酸测序检测以上型?, 其中每四种型别测序引物至于同一反应池中,仅需分钟即可完成测序反 应。分析此种检测技术与美国唯一认证的检测手段方法检测 出感染的一致性;评价其作为宫颈癌及宫颈癌前病变筛查手段的有效 性;根据测序结果确定标本中特异型别的感染,了解研究人群中 ?感染的型别分布。并将通用型引物阳性而焦磷酸测序阴性标本的 产物纯化、克隆后行传统测序分型检测,确定所感染的型别。 选择阳性的无宫颈病变病毒携带者、患者和宫颈癌患者各 例,使用宫颈液基细胞学检查剩余细胞提取,经重亚硫酸盐处理后,分 个片段扩增 片段’端和区域此区域包含/启动子增强 子及结合位点,应用焦磷酸检测技术经测序分析检测研究片段所涉及的 个位点甲基化状态,分析每一位点甲基化率与宫颈疾患发生进展的关 系,评价甲基化与其致病性问的关系。 技术路线:第一部分:天津医科人学博十学位论文 天津医科大学博士学位论文 第二部分: 天津医科大学博士学位论文 一、焦磷酸测序在分型检测中的应用 .对象和方法 ..仪器与试剂 一、主要仪器 . ?型紫外分析仪北京新技术应用研究所 .稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂 . 机械型微波炉格兰仕 .紫外分光光度计美国 . 上皿电子天平上海精密科学仪器有限公司 .显微镜同本 .:孵箱 .倒置显微镜日本 .血球计数盘及盖玻片 .梯度仪德国 . 冷冻离心机德国 .电热干燥箱上海申光仪器仪表有限公司 .电冰箱。,? .超低温冰箱?美国公司 .?型磁力搅拌器中外合资深圳天南海北有限公司 .数码相机同本 .型不锈钢手提压力蒸汽灭菌消毒器上海申安医疗器械厂 ./系统显微镜日本 .一高速台式离心机上海安亭科学仪器厂 .电子计重秤北京菲姆斯科技开发公司 .微量加样器法国 .凝胶成像分析系统从 .检测系统美国天津医科人学博十学位论文 .莱卡 阴道镜德国 .孝感液基细胞学制片系统孝感诺普电子科技有限公司 公司 .焦磷酸测序仪 瑞典 二、主要试剂及配制 . 细胞培养试剂 完全培养液:或培养液,加入灭活胎牛血清 ,青霉素和链霉素,?保存。以上试剂均购自 公司。 ,磁力搅拌混 胰蛋白酶消化液:胰蛋白.入一 匀,使其完全溶解,配制成.%胰蛋白酶消化液,冰箱过夜。次同取 出, 过滤除菌,分装,备用。胰蛋白酶购自中国医学科学院血液病研究 所。 . 提取试剂 、 、 、.% 细胞裂解液含 蛋白酶/,生工 饱和酚生工 醋酸钠.生工 、 缓冲液含 氯仿等。 .所用试剂聚合酶预混试剂,购自 ,:和 美国公司华生 琼脂糖华美 %异丙醇、醋酸氨、×等。 . 焦磷酸测序所用试剂 ?. ? ,, , , , , , , 天沣医科人学博十学位论文 ,%乙醇实验室配制 , . 引物 巢式扩增通用型引物 : ’ ’ 从 ’ 『: ’ :或,:或,:或,:或 : ’ ’ : ’从 ’ 焦磷酸测序引物 表焦磷酸测序检测种高危型钡/序引物 以上测序引物序列由美国学者 先生提供,由上海生工 生物技术公司合成。用灭菌去离子水溶解,储存液浓度为/, 取储存液稀释倍为工作液/。 .基因克隆所用试剂 :一半乳糖苷酶的活性诱导物质购自上海品彩生物技术有限 公司 感受态细胞由天津市农科院实验中心赠送 天津医科人学博十学位论文 :一半乳糖苷酶底物购自上海晶彩生物技术有限公司 :快速连接缓冲液购自上海晶彩生物技术 有限公司:载体购自美国公司 ..研究对象 一、天津市中心妇产科医院阴道镜门诊年月至月检查治疗的患者 例。这些患者为基层普查宫颈涂片为,,?,等异常者, 或者普通门诊检查,肉眼见宫颈异常,可疑宫颈病变者。所有患者 均未行宫 颈疾患治疗。所有患者均接受宫颈液基细胞学检查、?检测、焦 磷酸测序分型检查,阴道镜检查可疑异常或普查时宫颈细胞学检 查为 、、或普查为并于我院复查得到证实者或?检测 ?;性患者均接受宫颈或组织检查。 二、,和细胞: 细胞为已知阳性宫颈癌细胞系,细胞为已知性宫 颈癌细胞系,而细胞为阴性细胞。细胞作为通用型引物 阳性对照,细胞为阴性对照, 细胞和细胞进一步行焦磷酸 测序,检验焦磷酸测序行分型检测的准确性。 ..实验方法 一、细胞培养: .购买细胞后处理 三种细胞系,和细胞均购自南京凯基生物技术 有限公司,细胞送到后,观察细胞形态生长情况后置于。、%:的孵 箱 中过夜。 次同,在镜下观察细胞形态并倒出多余培养液继续置于孵育箱 中。 待细胞长满后,胰蛋白酶消化,传代。 .细胞传代步骤: 倒去培养瓶中培养液,加入胰酶,覆盖瓶底。天津医科大学博十学 位论文 镜下观察细胞出现分散时,倒掉胰酶。 加适量培养液吹打,镜下观察悬浮细胞。 分装:一般一瓶分装三瓶,保证新瓶中.天细胞长满。 .细胞收集步骤: 弃去培养瓶中培养液,加入适量胰酶,覆盖瓶底。 显微镜下观察细胞出现分散时,倒掉胰酶,加入适量培养液吹打, 使细胞悬浮。将重悬液倒入离心管中,,分钟低速离心。 弃上清,加入生理赫水,反复吹打,将细胞重悬、离心,反复洗 三遍,洗净胰酶及血清。 加入生理盐水重悬细胞,并将悬液移入无菌管中,离心弃上 清,一?保存备用。 .细胞计数: .细胞悬浮液与.等体积生理盐水混合均匀于.管中。 取少许混和液约.自血球计数盘上方凹槽加入,盖上盖玻片, 倍倒置显微镜下观察。 计数四个大方格之细胞总数,再除以,乘以稀释倍数,最后乘以, 即为每毫升中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线 与右线之细 胞或计下线与左线之细胞,细胞团快算一个细胞。 四大格中细胞总数×稀释倍数×/细胞数/ .冻存细胞: 胰蛋白酶消化细胞,培养液终止,吹散细胞,形成细胞悬液; 室温下离心分钟,弃上清; 加适量含%二甲基亚砜的冻存液重悬细胞; 分装到冻存管中,放入.?冰箱或液氮中保存。 二、提取步骤酚、氯仿法: .宫颈液基涂片剩余细胞的处理取材脱落细胞悬液充分混匀后取 置入.管中,,常温离心,弃上清; 和蛋白酶 ,充分混匀后?水浴 .加入? ; .培养细胞处理: 将培养细胞悬浮后,用洗涤一次。 天津医科人学博士学位论文 离心,去除上清液。 加倍体积的裂解缓冲液。 .水浴.小时。 .移上清液至新的. 管中,加入 ? 常温离心 ::,上下颠倒充分混匀; ; .取 上清液至于已装有 预冷无水乙醇的管中, ?离心:.弃上清,加入%乙醇 清洗沉淀,上下颠倒混匀 常 温离心; ,低温储藏备用。 .弃上清,室温干燥~;加入 .样品稀释至,用仪器检测样品的 /以确定其纯度,并检测浓度。 三、 巢式: .反应体系: / 为引物的总反应体系为 ..: 样品/为引物的总反应体系为 .. 样品 .反应条件: /反应条件: ? 预变性 个循环 ? 变性 天津医科大学博十学位论文 退火 .? ? 延伸 共个循环 ? 终术延伸 个循环 /反应条件: ? 预变性 个循环 ? 变性 .? 退火 ? 延伸 共个循环 ? 终术延伸 个循环 .实验步骤: 第一步扩增退火温度梯度摸索 应用 体系,以/『为引物扩增产物的退火温度梯度 范围设计为:.、.、.、.、.、.、.、.、.、 .、.、.?,根据扩增结果选择.?为试验所用退火温度。以 /为引物扩增产物的退火温度梯度范围设计为.、.、 .、.、.、.、.、.、.、.、.、.?,最坌冬 选择最佳退火温度.?为试验温度。 巢式 由于剩余细胞标本中宫颈脱落细胞含量较低,为提高检测有效性 使 用巢式方法。引物/扩增出来的目的产物长度为, 扩增后,将其 /扩增出来的目的产物长度为。首先经/产物用于第二步/扩增。 以细胞系提取为阳性对照, 细胞系提取为阴性对照。 .产物鉴定: 配制%琼脂糖凝胶,加入终浓度./,取产物加 为分子量标记, 上样缓冲液,混合,加样。以 恒压/电泳,待最前端的溴酚兰电泳至胶板的中线位置时,停止电泳, 在紫外分析仪下观察成像。 四、焦磷酸测序步骤 天津医科人学博十学位论文 基本实施步骤: 第步:个特异性的测序引物和单链模板结合,然后加入酶混合物 包括 、 、和和底物 混合物包括和。 第步:向反应体系中加入种,如果它刚好能和模板的下一 个碱基配对,则会在聚合酶的作用下,添加到测序引物的’末端,同 时释放出一个分子的焦磷酸。 第步:在硫酸化酶的作用下,生成的可以和结合形成; 在荧光素酶的催化下,生成的又可以和荧光素结合形成氧化荧光素,同 时产生可见光。通过光学系统即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低 则和相匹配的碱基数成币比。 第步:反应体系中剩余的和残留的少量在的作用下 发生降解。 第步:加入另一种,使第?步反应重复进行,根据获得的峰值 图即可读取准确的序列信息。 .样品选择 选择通用型引物巢式扩增后证实为阳性的样品扩增产物进行焦 磷酸测序。 .单链制备 和 于平底孔酶标板中,每孔加入,混匀;再于每孔中加入 产物每个 孔为同一 个样品,室温振荡混匀~。 将种测序引物分别稀释倍,备用;将种引物每个一组分 为组组为一、一、一、一;组为一、一、 、;组为一、一、一、一;将每组的 个测序引物分别取 混匀,备用分别为混,混,混。 应用美国学者 发明的四种特异性引物至于同一测序 反应池技术,提高测序的效率,示意图见图。大津医科人学博士学 位论文 雹写;蒿;;丢;高? 『 ?.一 图四种引物至于同一测序反应池进行中分型焦磷酸测序 于 反应板中,每孑入. 和. 每组不同的混合测序引物每个孑贝序一个样品,备用。 于 中,四个样品板依次加入超纯 和 水、%乙醇、 。打开 的泵,将 在超纯水中清洗至少。 将 移到已经完成振荡混匀的板中,抓取结合 有 的产物,分别按顺序在%乙醇、 和中洗一,最后将 放到 反应板上方,对准反应孔后关闭抽真空不关,将 放入 反应板摇动,释放结合 的单链产物。 单链产物放置,再取出冷却到室温。 .焦磷酸测序 设计程序,加入碱基序列为///循环,按照要求加入不同量的、、 、及酶和底物;将试剂舱和 反应板放入焦磷酸测序仪指定位置, 点击“”即可进行测序,经/软件分析得到测序结果。每次测序反 应时均加入一份以水代替样品的空白对照。 五、产物纯化对于 阳性而焦磷酸测序阴性病例行产物纯 化、克隆并进一步测序。 .纯化体系产物 乙酸钠 十分之一产物的量 异丙醇 倍产物加乙酸钠的量 天津医科大学博士学位论文 .纯化方法 将以上纯化体系轻轻混匀,离心 弃上清,加 %乙醇,离心 再弃上清,加 %乙醇,离心 弃上清,沉淀吹干,加 灭菌去离子水,备用。 .测值 将纯化的样品,每个分别取 ,通过测值。 六、纯化后克隆 .制备琼脂平板及液体培养基 以./的量,称取琼脂培养基.,溶于蒸馏水 中,共制备瓶,?高压灭菌 待培养基温度降至~时,以 /的量加入氨苄青霉 素,轻轻混匀,再以每皿一倒平板 待平板完全凝固后,每皿加入 浓度., 注:/的每皿加入量为 ,/的每皿加 入量为 ,刮铲涂匀,晾干备用。 以./的量,称取液体培养基,溶于蒸馏水中, ?高压灭菌,冷却后备用。 .连接体系 ×纯化 载体 酶 ?,过夜 .转化 将感受细胞从一取出,置于冰上融化大约,轻轻振动 离心管使其混匀。将。过夜的反应物转移到冰上.离心管中,加入 感受细胞,轻轻振动离心管,混匀,冰浴,精确。水浴中 热击,将离心管移至冰浴中,使细胞冷却,在离心管中加入平衡 至室温的液体培养基 ,?振荡培养.。 .蓝白斑筛选 上清,将沉淀 取出培养后的离心管于离心,弃去 天津医科人学博士学位论文 轻轻混匀,取 涂布于/氨苄//平板琼脂上,。过夜培 养。将筛选的白色菌株送上海生工公司测序部进行测序。测 序的基本原理是末端终止法,通过单引物测序反应,将原本是一 条序列扩增成数百条产物片断,它们是相差个碱基的‘末端为种 不同荧光染料的单链混合物。由于分子大小的不同,用电泳分离 这些片 断后,再通过测序仪将这些信号转变成峰图,形成测序序列和测 序的峰图。 ..统计学方法 使用 .软件进行统计学分析。统计量描述性分析用 分析方法;一致性检验应用一致性分析;组问阳性率比较 应用 检验和检验;等级相关分析应用法;曲线法。 .结果 ..一般情况 .名患者平均年龄岁?.岁,最小年龄岁,最大年龄 岁。 .例患者均接受细胞学检查结果见表。 表研究对象宫颈液基细胞学检查结果 例数 检查结果 正常合计 .例患者中例接受了宫颈活检及病理组织学检查,余例因 阴道镜检查未见异常且?检查阴性未进行宫颈活检。活检结果见 表。天津医科人学博学位论文 表宫颈活检病理结果 组织病理学检查结果 例数 正常 尖锐湿疣侵润性癌 合计 .?检测结果:例患者均接受检测,?阳性例, 检测值为.?。 /,中位数为./,四分位数分别为 .和./。 ..通用引物检测结果 .、、三种细胞培养,细胞生长良好,见图?。 图 细胞 图 细胞 图 细胞 .从例临床标本和、、细胞中提取的模板首先 应用/通用型引物进行进行第一步扩增,扩增后行琼脂糖电泳, 发现例患者中例可扩增出明显的的目的条带,和 细胞扩增出目的条带,.细胞未见阳性条带,部分电泳结果见图?: ;:阳性对照,细胞;:阴性对照,细胞。为 ,由上至下条带依次为,,,, 和。 天津医科人学博士学位论文 图 通用型引物/ 扩增电泳图 图 通用型引物/扩增电泳图天津医科人学博士学位论文 图 通用型引物/扩增电泳图 图 通用型引物/扩增电泳图 天津医科人学博士学位论文 .以/为引物,以第一步产物为模板行第二步扩增, 例患者扩增出的目的产物,其中例第一步弱阳性者经第二 步获得较清晰的产物,确定为阳性。电泳图见图。 图巢式扩增产物电泳结果 .. 分型结果 .测序分型结果 选择例经通用型引物巢式扩增后证实为阳性的样品扩增产 物进行焦磷酸测序。依据等人的研究结果将种高危型引物 ,,,,,,,,,, ,分为三组,每四种引物至于一个焦磷酸测序反应池中,对 阳性标本进行型分型测序。其中,,和 引物置于第一反应池,,,和引物置于第二反应池 中,,,和引物黄于第三个反应池中。细胞和 。 细胞测序结果见下图 天津医科人学博十学位论文 加 图 细胞系扩增后焦磷酸测序结果 :::::::::卜:: 蠢一? 一一一;;?一妊一嘏 图 细胞系扩增后焦磷酸测序结果 例标本中检测出型高危型感染,,, ,,,,和。焦磷酸测序结果见下 图.。??一??.。?。二二蕊? 以姒二 ?二?二:太二:二::火::爱扣图第一反应池测序结果阳性 图第三反应池测序结果阳性 天津医科人学博十学位论文 扣 一一一一;;:一 氤 董滥一膏一? :..:一;:?三三 扣图第二反应池测序结果阳性. . 。?’?’ ?卜??卜蕾? ? 。 ?,?女? ‘’‘?。?‘。‘‘ 图第二反应池测序结果阳性 图第一反应池测序结果阳性 卯 天津医科大学博士学位论文 图第一反应池测序结果阳性 三三 ::誓丑三三 一萄至 图第三反应池测序结果阳性‘ .?......?.?...?.??.?...,?..?..??.........?..........?.. ..?...?.......... 己?点二.二二二二汪二二二二父??一五 图第二反应池测序结果阳性 图第一反应池测序结果阳性 例阳性标本中检测到高危型感染病例共例。其中单一感 染例,分别为:例;:例;:例;:例; :例;:例;:例;:例;例。双重 感染例,分别为,:例;:例; 例;:例,见图。其中混合感染是于同 一检测池中检测出来的,测序结果见图,后经单一引物焦磷酸测 序进一步 证实,见图。 天津医科大学博十学位论文 奠选 “胡 “ 一 味一,‘’,:。:。一? 一?。‘ 她.翅二 羔过二处』:::: ? 图 混合感染 峥期??卸皓俏升?’~”’一一~”~~?~ ?。~ .~ 。一~篙 ?; ? 瓤豳篮墨曩圈嗣雹曩圈???????????????????????? ??????????????????????刖 登 二广????????????????????????????????????一??一一加 厂???????????????????????????????一??一? 髓圈圈墨圈蕾??????????????????????????????????????????一?? 图 混合感染 天津医科大学博士学位论文 尘盛 鬻鬻黛蹩墼攀登 『“唰群瑚糊鹅搜甓学搿氍粥黔”””“一一一~。。一~’”?一?’”””一”“一??””“?” 二一攀一一~ ?一簟图 混合感染 圈.卜蜘地。。。砌。?‰‰,;州“。抽啪沁. %带沁。。囊执%州。神 图 混合感染于同一检测池中检测结果 ? 虬。‰. .~..,~.,., 。.。.‰。?‰、‰。。蕊?崎。一?吲蜘赶。池一;:幽支止:。:二:太。。纛 蜊 、一、螺强。 州 蝴 图单一引物进一步证实混合感染 .不同?型别检出率 天津医科火学博士学位论文 包含单一及双重感染,阳性共计例,型感染例, 型感染例,型感染例,型例,型例,、、 各例,不同型别感染比例见表,图。 表 名阴道镜门诊患者应用焦磷酸测序技术检测不同型别检出率 单一感染例数 双重感染例数 检出率% 型别所占比例% . . ./. 阴性 阳性./ %/ 型别 .%/.%/.%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ .%/ 刖捌病饲分缸 ?悖 盛卜,? 。’ ?卜” 巴. 西卜/ 曩卜, 怍’ 匝: 一障“? 瞄憎, 口,’“’ ?卜“ 图检测出的不同型别?所占比例 ..焦磷酸测序检测感染与检测一致性分析 例患者经焦磷酸测序和检测检出感染情况见表。经 相关分析,值为.,值.,两者有很好的一致性,见 天津医科人学博十学位论文 表。 表焦磷酸测序与?检测结果 表焦磷酸测序与?一致性分析 ..高危型阳性与宫颈病变的关系: 例阴道镜门诊患者中名宫颈正常者经焦磷酸测序检查发现高危 型?感染者例,例 患者中高危型阳性例, 例尖锐湿疣者中例?阳性,可能为低危型及高危型混合感染,全 部 ?患者中仅例阴性,例侵润性宫颈癌中?均为阳 性。经精确检验,发现组间感染率有显著性差异,见表, 图。 统计学相关分析表明?感染率与宫颈病变呈等级相关,值 为.,尺.,见表。天津医科大学博士学位论文 表不同宫颈病变感染率 半正常组中包括例活检证实『常者和例阴道镜检查正常且一阴 性, 未取宫颈活检的患者。 阴性.:日 ?. 圈 官颈病变 图不同宫颈病变间感染率 天津医科人学博学位论文 表 感染与宫颈病变相关分析 常.尖 钰澍价. . :.。 什. ?什 蹙:~孵 . .。 ‘禽。尖铲:?;.。。? . . 爵耖扣引。’ 侵:瘀.。 . 扩性。卜一仕. . “. .. ..焦磷酸测序检测出感染对级以上宫颈病变的预测作用 分析宫颈活检的例患者中,焦磷酸测序检测感染对宫颈高 级以上宫 级别病变的预测作用。经统计学分析发现,感染预测 颈病变的敏感度为.%,特异度为.%,阳性预测值为.%,阴性预测 值为.%。曲线下面积为.,%可信区间为..,误 为.,值.,表明焦磷酸测序检测感染对于宫颈高级别病变 具有较高的预测价值。见表,图。 表焦磷酸测序检出?感染识别宫颈高级别病变的意义 术包括宫颈活检病理结果为正常, 及尖锐湿疣的患者。天津医科 人学博士学位论文, 图焦磷酸测序检测感染对 及以上病变预测 ..比较不同年龄段患者感染状况 以岁为一年龄组,发现不同年龄组问感染发生率无显著性差 异,见表,图。 表不同年龄组间?感染率比较 天津医科大学博士学位论文 图不同年龄组间感染率 印龄;【 图不同年龄组感染趋势图 .. 通用型引物阳性焦磷酸测序阴性病例测序结果: 例标本经通用型引物巢式测序阳性而焦磷酸测序阴性者经 克隆后,进行传统测序,测序结果经的比对, 发现例型感染,例 型感染,例型感染,例