1712例高危型hpv感染與宮頸病變

1712例高危型hpv感染與宮頸病變 不同HPV高危亚型与宫颈病变发生的相关性研究 上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科 楼微华 洪祖蓓 狄文(通讯作者) 上海市教委重点学科，上海市妇科肿瘤重点实验室 摘要: 目的:分析1712例HPV高危亚型在宫颈癌、癌前病变和正常人群中的分布差异，探讨HPV亚型检测对宫颈病变诊治的临床价值。方法:收集2007年7月至2012年8月间于上海交通大学医学院附属仁济医院妇科门诊行机会性宫颈癌筛查人群的宫颈脱落细胞标本，完成HPV分型检测和液基细胞学检查。对HPV高危亚型阳性或液基细胞学检查结果大于等于ASCUS者，进一步行阴道镜检查并取宫颈组织活检。结果:机会性宫颈癌筛查完成HPV分型检测10838例，高危亚型阳性1712例，占筛查总数的15.9%。最常见的6种高危亚型分别为16, 58, 52, 33,18,31。经病理确诊宫颈癌及宫颈上皮内瘤变患者348例，以病理诊断CIN II+作为临界终点，不同HPV高危亚型感染导致CIN II+的比例存在差异，p<0.05,差异有统计学意义。最易引起宫颈CINII+的HPV亚型是HPV16和HPV18。HPV16/18单一亚型感染者中，最终病理诊断为CIN的比例存在差异，HPV16单一亚型感染的致病风险远高于HPV18和其他亚型。HPV18多重感染者较HPV18单一感染者，发生高级别CIN及以上病变的风险显著提高。结论:本地区HPV高危亚型感染的常见亚型依次为16,58,52,33,18,31，不同HPV高危亚型的致病风险存在差异，利用HPV亚型检测进行宫颈癌筛查和随访可能更有临床指导意义。 关键词:人乳头瘤病毒 高危亚型 宫颈病变 致病风险 The relationship of HPV high-risk genotypes and cervical lesions Lou Weihua,Hongzubei,Di wen Renji Hospital affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200001,China 【OBJECTIVE】 To analyze the distributional difference of HPV high-risk genotypes in different cervical cancer, cervical precancerous lesion and the normal population, explore the pathogenicity difference of several common HPV high-risk genotypes in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia so as to study the value of HPV genotypes test in the diagnosis and treatment of cervical lesion.【METHODS】We collected the cervical exfoliative cells in the cervical cancer screening people at the Affiliated Renji Hospital of Shanghai Jiaotong University School of Medicine from 2007 July to 2012 August, they were all completed HPV typing and liquid based cytology. The HPV high-risk genotype positive or liquid based cytology results greater than or equal to ASCUS, into a colposcopy and cervical biopsy. 【RESULTS】In the screening of 10838 cases, positive high-risk genotypes appeared in 1712 cases, accounting for 15.9% . The six most common high-risk genotypes were 16 ( 6.48%, 702/10838 ), 58 ( 3.15%, 341/10838 ), 52 ( 2.39%, 259/10838 ), 33 ( 1.74%, 188/10838 ), 18 ( 1.45%, 157/10838 ), 31 ( 1.18%, 128/10838 ). Eventually there were 32 carcinoma cases,214 high-grade cervical intraepithelial neoplasia cases,102 low- grade cervical intraepithelial neoplasia cases and 1364 chronic cervicitis cases confirmed by pathology. According to the pathological diagnosis of CIN II+ as critical endpoint, we analyzed the relationship between HPV genotypes and cervical lesions, which found that different HPV high-risk genotype infection leads to different CIN II+ incidents, p<0.05. The most common genotype leading to CIN II+ is HPV16 and HPV18. In one type infection,HPV16 has a higher pathogenic risk than HPV18 and other genotypes.Multiple HPV18 infection has a higher pathogenics risk than single HPV18 infection(p<0.01).【CONCLUSIONS】The distribution difference of HPV genotype varies in regions, the most common HPV high-risk genotypes in Shanghai area were 16, 58, 52,33,18,31.Different HPV genotypes means different pathogenic risk. HPV genotype tests is recommended in cervical screening and follow up. KEY WORDS: Human papillomavirus, High risk genotype,Cervical lesions,Pathogenic risk 宫颈癌的发病率位居全球女性恶性肿瘤第二位,其发生发展过程具有可逆转 [1]的癌前期病变期 。研究显示，人乳头瘤病毒(HPV)，尤其是高危型HPV的生 [2]殖道持续感染是引发子宫颈癌及子宫颈上皮内瘤变的重要病原学因素。根据全 [3]球流行病学调查，HPV感染存在地区差异和种族差异。在我国文献报道中各个 地区HPV型别的感染情况不尽相同。上海作为一个2000多万居住人口的大城市， 人口密度高，外来人口多;近年来随着宫颈癌的年轻化趋势，HPV感染越来越 被引起广大医生和患者的重视。本研究收集了2007年7月至2012年8月仁济医 院接受HPV DNA检测的10838例门诊患者，观察HPV的各类型分布，并进行细胞 学和阴道镜下病理检查，探讨本地区人群HPV感染的型别分布、各亚型感染在不 同级别宫颈病变中的分布差异，分析各HPV亚型感染对临床结局判断的指导作 用，为HPV检测尤其是高危HPV亚型检测引入宫颈癌筛查提供理论依据。 材料和方法 一、研究对象 1.1研究对来源:2007年7月至2012年8月，上海交通大学医学院附属仁济医院妇科门诊行机会性宫颈癌筛查人群10838例，均完成HPV分型检测和液基细胞学检查。对HPV高危亚型阳性或液基细胞学检查结果ASCUS及以上者(含ASCUS)，进行阴道镜检查并取宫颈组织活检。 1.2 研究对象入选及排除标准 纳入标准:无子宫切除和宫颈手术史、无骨盆放射治疗史、无免疫缺陷疾病史。排除标准:生殖道急性炎症、2周内有阴道用药、生殖道畸形、严重的内外科疾病无法耐受检查、器官移植后须抗免疫治疗。 二、研究方法 1、人乳头瘤病毒(HPV)分型检测 采集的宫颈上皮脱落细胞，样本4?保存不超过48小时。DNA抽提试剂盒(QIA Mini试剂盒)购自德国QIAGEN公司。HPV基因分型检测试剂盒购自中国凯普生物科技有限公司，可检测21种HPV亚型, 、5种低包括13种高危亚型(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68型)危亚型(6,11,42,43和44型)和3种中国人群常见亚型(53,66和CP8304型)。PCR扩增仪型号:凯普hybribioPCR KP-TC48。DNA提取纯化:取1ml样本，以12000rpm，离心5分钟，弃上清液，沉淀用200μl生理盐水重悬,利用DNA提取试剂盒提取DNA并进行DNA纯化。PCR扩增:将扩增混合液，Taq酶按比例配置PCR反应体系100ul,设置扩增条件:50? 2min, 94? 4min;94? 30sec, 48? 45sec, 72? 20sec, 28 cycles;94? 30sec, 65? 45sec, 72? 20sec, 25 ? hold。导流杂交:将扩增后的PCR产物加热变性后冰浴,同时将固cycles;4 定有核酸探针的膜固定在杂交仪上,进行预杂交。把PCR产物加到薄膜上,让样品流入膜内进行导流杂交,清洗除去未结合的DNA,整个杂交过程保持在45 ?。芯片显色及结果判读用封阻液封闭膜,孵育5 min,重复2次。排出封阻液后加入酶标液,25 ?温育3.5 min。用冲洗缓冲液彻底冲洗膜,除去未结合的酶标液,后加入NBT/BCIP底物显色3-5 min。在显色后1 h内分析结果。 2.宫颈脱落细胞学检测(液基细胞学TCT) TCT标本采集后，放入ThinPrep2000全自动处理仪中，具体程序按照ThinPrep2000的标准操作程序进行。TCT制片后，由两名细胞病理学医师进行独立阅片，对于结果不能确定者由另一位高年资病理科主治以上医师再次阅片。 3、阴道镜检查 实验室检查结果出来后，通知所有调查对象(本人)检查结果。根据宫颈病变“三阶梯”诊断原则，对HPV高危亚型感染者或细胞学检查提示ASC-US及更高级病变的调查对象，通知其进行阴道镜检查。凡阴道镜下怀疑宫颈、阴道有异常时，均应在阴道镜下行活组织检查，根据病理学结果明确诊断，填写病理检查结果。 4、病理诊断标准 以组织病理学诊断为金标准，按组织学标准将宫颈病变分为宫颈炎症;低级别病变(CIN?);高级别病变(CIN?、?或原位癌);宫颈浸润癌。348例宫颈上皮内瘤变及宫颈癌患者的组织切片均由2名病理科主治医师复片进行质量控制，以确定诊断的准确性。 三、统计分析 应用SPSS 16.0软件进行统计分析，统计方法采用卡方检验、t检验，P<0.05提示差异有统计学意义。 结 果 1、13种HPV高危亚型检测结果及常见亚型分布 机会性宫颈癌筛查完成HPV分型检测10838例，高危亚型阳性1712例，占筛查总数的15.9%，其中HPV单一亚型感染1252例(73.1%，1252/1712)，HPV亚型多重感染460例(26.9%，460/1712)。13种HPV高危亚型的感染例数和检出率见表1，最常见的6种高危亚型分别为16(6.48%，702/10838), 58(3.15%，341/10838), 52(2.39%，259/10838), 33(1.74%，188/10838),18(1.45%，157/10838),31(1.18%，128/10838)。 表1、13种HPV高危亚型的感染例数和检出率 HPV亚型 例数(N) 检出率(N/10838,%) HPV16* 702 6.48 * HPV18* 157 1.45 * HPV31* 128 1.18 * HPV33* 188 1.74 * HPV35 11 0.10 HPV39 54 0.50 HPV45 16 0.15 HPV51 23 0.21 HPV52* 259 2.39 * HPV56 28 0.26 HPV58* 341 3.15 * HPV59 40 0.37 HPV68 101 0.93 *最常见的6中HPV亚型 2、最终经病理确诊发现宫颈侵润癌32例，高级别宫颈上皮内瘤变例214例，低级别宫颈上皮内瘤变例102例，慢性宫颈炎1364例。32例宫颈癌患者中，检出4种HPV高危亚型，检出频次由高到底分别为16、18、52、33;高级别CIN患者中常见的HPV高危亚型由高到底依次为16、58、18、33、52、31;低级别CIN患者中常见的HPV高危亚型由高到底依次为16、58、52、18、33、31;慢性宫颈炎患者中常见的HPV高危亚型由高到底依次为16、58、52、33、18、31。不同程度宫颈病变患者中，HPV亚型检出频次存在差异，P<0.01，差异有统计学意义(见表2)。 表2. 不同程度宫颈病变患者中6种常见HPV高危亚型检出频次 宫颈病变HPV16 HPV18 HPV58 HPV52 HPV33 HPV31 /HPV亚型 慢性宫颈炎 546 126 299 235 168 117 低级别CIN 27 11 14 13 4 4 高级别CIN 107 18 28 10 15 7 宫颈侵润癌 22 2 0 1 1 0 合计 702 157 341 259 188 128 P<0.01 3、以病理诊断CINII+作为临界终点，分析不同HPV高危亚型与高级别CIN及 其以上病变的关系，发现不同HPV高危亚型感染导致CINII+的比例存在差 异，p<0.05,差异有统计学意义(表3)。最易引起CINII+的HPV亚型是HPV16 和HPV18，比例分别为18.4%(129/702)和12.7%(20/157)。其余四种常见 亚型中，HPV33、58导致CINII_的比例较HPV31、HPV52高(分别为8.5%、 8.2%和5.5%、4.2%)，但差异无统计学意义。 表3. 不同HPV高危亚型与高级别CIN及其以上病变的关系 HPV亚型 正常或低级别CIN 高级别CIN+ 合计 129(18.4%) 702 HPV16*@ 573(81.6%) 20(12.7%) 157 HPV18*@ 137(87.3%) 7(5.5%) 128 HPV31*# 121(94.5%) 16(8.5%) 188 HPV33*# 172(91.5%) 11(4.2%) 259 HPV52*# 248(95.8%) 28(8.2%) 341 HPV58*# 313(91.8%) * HPV16/18/31/33/52/58，组间比较p<0.01 # HPV31/33/52/58，组间比较，P>0.05 @HPV16/18，组间比较，P>0.05 4、以病理诊断CINII+作为临界终点，进一步分析6种常见HPV单一或多重感染与高级别CIN发病风险的关系，见表4。包含HPV18的多重感染者较HPV18单一感染者，发生CINII+的风险提高到11.9倍，p<0.01。其他HPV常见亚型包括16、33、31、52、58单一/多重感染引起CINII+ 的风险无显著差异。单一亚 型感染人群中，HPV亚型与高级别CIN发病风险密切相关，p<0.01。HPV16单一亚型感染的致病风险远高于其他亚型。 表4. 6种HPV亚型单一/多重感染与高级别CIN发病风险的关系 HPV 正常或CIN I CIN II+ P OR 95%CL 单一 多重 单一 多重 16 434 139 93 36 0.387 1.2 0.79-1.86 18* 78 59 2 18 0.00 11.9* 2.70-53.3 31 70 51 4 3 0.97 1.0 0.8-1.9 33 96 76 9 7 0.97 1.0 0.35-2.88 52 142 106 4 7 0.06 2.3 0.67-8.22 58 203 110 19 9 0.75 0.87 0.35-1.99 表5 HPV单一亚型感染与高级别CIN发病风险的关系 HPV亚型 正常或低级别CIN 高级别CIN+ 合计 93(17.7%) 527 HPV16*@ 434(82.3%) 2(2.5%) 80 HPV18*@ 78(97.5%) 547 非HPV 16/18 511(93.4%) 36(6.6%) P<0.01 讨论 宫颈癌(cervical cancer，cc)在全球女性中是第二位常见的恶性肿瘤，83, [1]发生在发展中国家，且发病率有逐年上升趋势。我国每年新发病例大约在13 4万以上，约2-3万妇女死于宫颈癌。1974年Zur Hausen等首次提出人乳头瘤病毒(human paillomavirus，HPV)感染可导致子宫颈癌发生，此后人们几乎在100, [4]的宫颈癌组织中检测到HPV DNA的存在。近30年来的流行病学及实验室研究 [4]资料表明，特定的HPV高危亚型持续感染是引起宫颈癌的必要原因，宫颈癌成为病因明确的恶性肿瘤。 本研究利用杂交导流技术，对10838例机会性宫颈癌筛查对象进行宫颈脱落细胞HPV分型检测，检出13种HPV高危亚型共计1712例，占筛查总数的15.9%，最常见的6种高危亚型分别为16(6.48%，702/10838), 58(3.15%，341/10838), 52(2.39%，259/10838), 33(1.74%，188/10838),18(1.45%，157/10838),31(1.18%， 5128/10838)。与以往报道亚洲国家常见HPV基因型别基本一致，但常见亚型检出频次构成比略有差异，这可能是人群中HPV亚型地域分布的差异。 HPV感染亚型存在多样性和地区差异，国际癌症研究协会(IARC)的研究显 [6]示，最常见的亚型为HPVl6、18。Clifford等研究发现，HPVl6占51,，其次是HPVl8，占12(6,--25(7,，其他亚型在地区分布上存在明显差异，如HPV45在非洲相对较多，而HPV33则主要集中在欧洲;亚洲国家以HPV52、58常见。IARC与中国医学科学院肿瘤医院(CICAM)合作的多中心研究提示中国最常见的5种 [7]HPV亚型为16、18、52、58和39。 本研究中，常见HPV高危亚型的感染率由高到低依次是，16、58、52、33、18、31。HPV16亚型始终是全世界感染率最高、致癌能力最强的HPV亚型，其他常见HPV高危亚型检出率的差异可能原因是:1、中国疆土辽阔、地域差异、人种差异导致国内不同地区的HPV常见亚型分布不同;2、研究对象的入选标准参次，本研究为普通妇科门诊机会性宫颈癌筛查人群，致使HPV检出亚型更趋向于引起宫颈病变的基因型。3、人口流动性较大，尤其在沿海大城市，导致HPV常见亚型分布逐渐改变。 不同级别的宫颈病变中HPV型别分布也有所差异:De Sanjose等[3]全球范围的流行病学分析显示，HPVl6、18、45型是宫颈癌患者的常见亚型;而中国女性 8宫颈癌常见亚型[]为HPVl6、18、58、52、31、33、59和45型;宫颈癌前病变中常见亚型为HPVl6、58、52、18、33、31、51和68型;北方女性宫颈癌常见亚型为HPVl8、58、68、31、33、52和51型。我们的研究结果显示:非CIN人群中常见的HPV高危亚型由高到低依次为16、58、52、33、18、31;低级别CIN患者中常见的HPV高危亚型由高到低依次为16、58、52、18、33、31;高级别CIN患者中常见的HPV高危亚型由高到低依次为16、58、18、33、52、31; 宫 颈癌患者中，仅检出4种HPV高危亚型，检出频次由高到低分别为16、18、52、 933，与亚洲国家的相关报道相近。由此可见:世界范围内HPV16、18始终是引起宫颈癌变的最重要的基因型。HPV16在感染率和致病率上均占有绝对优势，被认为具有完全的细胞转化功能和致瘤性，在宫颈癌组织和高级别宫颈上皮内瘤变中检出率最高 。HPV18在国内的检出率不高，我们的研究中HPV18检出率仅1.45%，但HPV18感染者发生宫颈高级别病变的比例高达12.73%，仅次于HPV16(18.4%)。HPV16、18单一亚型感染者中，最终病理诊断为高级别CIN的比例存在显著差异，HPV16单一亚型感染的致病风险远高于HPV18及其他单一亚型。 随着对HPV分型的研究，发现有单一亚型感染和多个亚型混合感染。多重感染是否增加宫颈癌的发生率，目前说法不一。大多数研究认为，多重感染并不增加宫颈癌的发生率。有研究表明HPV多重感染与宫颈病变成正相关性，随着宫颈病变级别增加，多重感染率呈增加趋势，但宫颈癌除外。我们的研究中，HPV18亚型感染例数共计157例，其中单一亚型感染80例，多重感染77例，包含HPV18的多重感染者较HPV18单一感染者，发生高级别CIN及以上病变的风险提高到11.9倍。有理论提出HPV18亚型在CIN I,?感染阶段比较短暂且进展比较快。 E7表达HPV18相关的宫颈癌通常以整合的形式存在于宿主细胞中，具有高E6,性，而其他HPV亚型则以整合和游离两种形式存在。Ding等提出HPVI8主要感染鳞柱状交界处的柱状上皮，很少发展为CIN ，但具有发展为宫颈腺癌和鳞癌的双向潜能。 宫颈病变的严重程度和宫颈病变预后转归，不仅与HPV高危亚型感染有关，还涉及诸多因素，如遗传基因、免疫状态、孕产史、婚育情况、年龄因素、生活行为习惯、烟酒嗜好等等。我们的研究对象大部分来源于上海地区，其结果可能只反映上海地区情况，可进一步行大规模、多中心流行病学调查和多因素分析验证HPV高危亚型在宫颈癌前病变和宫颈癌发生发展中的作用。但引入HPV亚型检测进行宫颈癌筛查和手术后随访监测必然具有强大的临床优势和应用价值。 参考文献: 1 J Ferlay, HR Shin, F Bray, D Forman, C Mathers, DM Parkin.GLOBOCAN 2008, cancer incidence and mortality worldwide: IARC CancerBase number 10International Agency for Research on Cancer, Lyon, France (2010) 2 N Munoz, FX Bosch, S de Sanjose et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer.N Engl J Med, 348 (2003), pp. 518–527 3 De Sanjose S, Quint WG, Alemany L, Geraets DT, Klaustermeier JE, Lloveras B, et al. 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