【doc】Vogt-小柳原田综合征患者外周血和脑脊液淋巴细胞共刺激分子的表达

【doc】Vogt-小柳原田综合征患者外周血和脑脊液淋巴细胞共刺激分子的表达 Vogt-小柳原田综合征患者外周血和脑脊液 淋巴细胞共刺激分子的表达 ? 170?中国实用眼科杂志2004年3月第22卷第3期ChinJPractOohthalmol,March2004,Vol22.No,3 Vogt一小柳原田综合征患者外周血和脑 脊液淋巴细胞共刺激分子的表达 王红杨培增黄祥坤周红颜 【摘要】目的探讨Vogt一小柳原田综合征(VKH)患者外周血及脑脊液淋巴细胞上B7, CD28和CTLA一4分子的表达及意义.采用流式细胞三色直接免疫荧光标记法,检测了39例 VKH综合征患者外周血T,B淋巴细胞亚群上共刺激分子CD80(B7—1),CD86(B7—2),CD28和 CTLA一4的表达.VKH综合征患者分为葡萄膜炎活动期(18例)和静止期(21例)两组.对于3例 初发的VKH综合征患者,我们还检查了脑脊液中T淋巴细胞上共刺激分子的表达.结果VKH综 合征活动期患者外周血CD4T细胞表面CD28分子的表达有所增高(97.0%?3.71%,正常人为 95.3%?3.19%),而静止期患者有所下降(93.7%?7.56%),但三组比较无显着差异.静止期患者 CD4T细胞表面CTLA一4分子的表达(2.72%?1.42%)显着高于正常人(1.73%?0.66%)(P< 0.05).另外,VKH综合征活动期患者外周血CD4和CD8T细胞表面CD86分子的表达显着低于静 止期患者和正常人(P<0.05).与自身外周血淋巴细胞比较,3例初发VKH综合征患者脑脊液 CD4T细胞显着增多(t=3.325,P<0.05),CD4/CD8比值显着升高(t=3.276,P<0.05),CD28 分子的表达也显着增高(t:4.242,P<0.05).结论VKH病患者外周血及脑脊液淋巴细胞上B7, CD28和CTLA一4分子的表达与葡萄膜炎的发生,持续,静止以及其他局部病变的发生密切相关. 【关键词】Vogt一小柳原田综合征;共刺激分子;流式细胞分析技术 Expressionoflymphocytecostimulatorymoleculesinperipheralbloodandc erebralspinalfluidonpatients withVogt—Koyanagi—HaradasyndromeWANGHong,y4rG蹦一zeng,HUANGXiang-kun, ZHOUHong-yan,DepartmentofOphthalmology,TongrenHospital,Capita lUniversityofMedical Sciences,Betting100730.China.OphthalmicCenter,ZhongshanUniversity ,Guangzhou510060, China 【Abstract】 ObjectiveToinvestigatetheexpressionoflymphocytecostimulatorymolecules(B7, CD28andCTLA一4)onpatientswithVogt—Koyana~一 Harada(VKH)syndrome,anddeterminethe roleofcostimulatorymoleculesinVKHsyndrome.MethodsThirty—ninepa tientswithVKHsyndrome wereanalyzedbydirectthree—colorimmunofluorescenceflowcytometryf orexpressionofCD80(B7—1). CD86(B7—2),CD28andCTLA一 4onTandBcellsofperipherialblood.Patientsweredividedintoactive (18cases)andstablegroups(21cases).Expressionoflymphocytecostimulatorysignalsincerebralspinal fluidwerealsoexaminedon3incipientpatients.ResultsExpressionofCD28onCD4TceUswasupregu一 1atedinactivepatientswithVKHdisease(97.0%?3.71%)comparedtocontrols(95.3%?3.19%),de— creasedinstablepatients(93.7%?7.56%),buttherewerenosignificantdifferencesamongthesegroups. SignificantincreasedexpressionofCTLA一 4onCD4subsetswasseeninpatientswithstabledisease (2.72%?1.42%)comparedtocontrols(1.73%?0.66%)(P<0.05).TheexpressionofCD86on CD4andCD8subsetsinactivepatientsweresignificantlydecreasedcomparedtocontrolsandpatientswithstable disease(P<0.05).Comparedtoperipheralbloodlymphocytes,CD4Tw21s(t=3.325,P<0.05)and CD4/Caratio(t=3.276,P<0.05)incerebralspinalfluidweresignificantlyupregmlatedin3incipientpa— tientswith? (Hdisease,andexpressionofCD28onlymphocytesincerebralspinalfluidwasalsoupregulated.(t= 4.242,P<0.05).ConclusionsThesedataindicatescostimulatorysignalscontributetotheonset,persistence andconvalescenceofuveitisandotherpathologicchangesinpatientswithVKHsyndrome. 【Keywords】 Vogt—Koyanagi—Haradadisease;Costimulatorymolecules;Fluoresceinactivated cellsorter ? 论着? 基金项目:国家杰出青年基金资助项目(39925034);跨世纪优秀人才基金资助项目(教技函[199912号);广东省卫生厅基金(A2001211) 作者单位:100730首都医科大学附属北京同仁医院眼科(王红);中山大学中山眼科中心(杨培增黄祥坤周红颜) 通讯作者:王红 中国实用眼科杂志2004年3月第22卷第3期ChinJPractOphthalmol,March2004.Vol22.No.3 Vogt一/J,杉口原田(Vogt—Koyanagi—Harada, VKH)综合征是一种累及全身多个系统的炎症性疾 病,是自身免疫性疾病,自身反应性T细胞的激活 是其发病的基础[,.近年来的研究表明,T淋巴细 胞的活化除了必须具有TCR—CD3复合物信号外, 还必须具有共刺激信号,后者决定着受到抗原刺激的 T细胞是分化,增殖为效应细胞还是进入无反应状 态L3.4J.B7:CD28/CTIA一4是最为关键的共刺激途 径,有关其在VKH综合征患者发病中的作用,迄今 国内外尚未见报道.我们应用流式细胞技术检测了 VKH综合征患者外周血及脑脊液淋巴细胞中CD80 (B7—1),CD86(B7—2),CD28和CTIA一4分子 表达的情况,并分炎症活动期和炎症静止期对其意义 进行了探讨. 材料与方法 一 ,病例资料 VKH综合征患者39例,选自中山眼科中心葡萄 膜炎专科门诊,根据1978年美国葡萄膜炎研究学会 制定的标准确诊[,其中男21例,女18例,年龄为 16,55岁,平均32岁.取血时l8例患者处于葡萄 膜炎活动期,未接受糖皮质激素和其他免疫抑制剂治 疗;21例患者经我们给予系统的糖皮质激素和免疫 抑制剂治疗1年后处于葡萄膜炎静止期.对于3例初 发的VKH综合征患者,我们还进行了腰椎穿刺,检 查了脑脊液中T淋巴细胞上共刺激分子的表达.另 取身体健康者20例作对照,其中男10例,女10例, 年龄为25,42岁,平均为31岁.两组年龄经统计学 处理无明显差异. 二,单克隆抗体,主要试剂和仪器 单克隆抗体为藻红蛋白(phycoerythrin,PE)标 记的鼠抗人CD28和CD80;荧光异硫氰酸荧光素 (fluoreythrinisothiocyanale,FITC)标记的鼠抗人 CTIA一4和CD86;PE—Cy5标记的鼠抗人CD4, CD8,CD19;PE—Cy5,FITC和PE标记的isotype: 鼠IgG,1kappa和鼠IgG2a.以上均购自美国Exal— phaBiologicals,Boston.红细胞裂解液购自DAKO, USA.流式细胞仪为COUITEREPICSElITE型. 三,实验方法 1.外周血淋巴细胞荧光抗体标记:采用三色直 接免疫荧光标记法.抽取患者外周血500ul,EDTA 抗凝,分装于5个试管,按以下5种组合加入3种荧 光抗体各10l混合进行三标记:?PE—Cy5一 CI)4mAb+PE—CD28mAb+FITC—CTIA一4mAb: ?PE—Cy5一CD8mAb+PE—CD28mAb+FITC— CTIA一4mAb;?PE—Cy5一CD4mAb+PE— CD80mAb+FITC—CD86mAb;?PE—Cy5一 CD8mAb+PE—CD80mAb+FITC—CD86mAb;? PE—Cy5一CD19mAb+PE—CD80mAb+FITC— CD86mAb.室温下孵育20rain,用红细胞裂解液裂 解红细胞之后,离心获取有核细胞,加入200UlPBS 上机检测.用鼠IgG一1kappa和IgG2aisotype代替抗 体作为阴性对照. 2.脑脊液淋巴细胞荧光抗体标记:无菌进行腰 穿,抽取患者脑脊液6—7ml,离心浓缩有核细胞, 弃上清液,由于淋巴细胞较少,仅进行了CD28和 CTLA一4的检测.将浓缩的脑脊液分装于2个试管, 按以下2种组合加入3种荧光抗体各10l混合进行 三标记:?PE—Cy5一CD4mAb+PE—CD28mAb+ FITC—CTLA一4mAb;?PE—Cy5一CD8mAb+PE — CD28mAb+FITC—CTLA一4mAb;室温下孵育 20min,加入200/1lPBS上机检测. 3.流式细胞仪测试分析:用流式细胞仪和软件 LYSYS1I进行三色荧光参数获取及分析.在前散射 和侧散射的二维Dot—plot图中,划出淋巴细胞门, 然后对淋巴细胞进行三色荧光强度检测,PE—Cy5 的滤光片为675nm带通,PE的滤光片为575nm带 通,FITC的滤光片为525nm带通.数据分析时,在 确定每次检测阳性细胞百分率之前,根据isotype的 非特异性荧光强度设定界线,以确定双阴性区,双阳 性区和单阳性区. 4.统计方法:数据X一?S表示,用SPSS软件进 行统计分析,二组间比较用独立样本T检验,三组 间比较用单因素方差分析. 结果 一 ,VKH综合征患者与正常人外周血淋巴细胞 表型分析 VKH综合征炎症活动期患者外周血CD19细胞 和CD4/CD8比值有所升高,但与静止期患者,正常 对照组比较无显着差异(P>0.05)(表1). 表lVKH病患者与正常A~,I-周血淋巴细胞表型分析(%) 二,VKH综合征活动期,静止期患者与正常人 外周血淋巴细胞亚群共刺激分子表达的比较 中国实用眼科杂志2004年3月第22卷第3期 ChinjPractOphthalmol.March2004.Vol22,No.3 与正常人(95.3%?3.19%)相比,VKH综合 征活动期患者外周血CD4T细胞中,CD28分子的 表达有所增高,占97.0%?3.71%,而静止期患者 有所下降,占93.7%?7.56%,但三组比较无显着 差异(P>0.05).VKH综合征活动期患者外周血 CD4T中,表达CTIA一4分子的占2.10%? 1.11%,静止期患者占2.72%?1.42%,均高于正 常人(1.73%?0.66%),但只有葡萄膜炎静止期患 者与正常人比较有显着差异(P<0.05).另外,本 研究发现VKH综合征活动期患者外周血CD4T细 胞表面CD86分子的表达(0.68%?0.27%)显着低 于静止期患者(1.66%?1.17%)和正常人(1.78% ?0.80%)(P<0.05),CD8+T细胞表面CD86分 子的表达(1.39%?1.10%)也显着低于静止期患者 (2.59%?1.27%)和正常人(2.77%?1.10%)(P <0.05)(表2). 表2VKH综合征活动期,静止期患者与正常人 外周血淋巴细胞亚群共刺激分子表达的比较(%) 注:aVKH静止期和正常人有显着差异;bVKH活动期和VKH 静止期有显着差异;CVKH活动期和正常人有显着差异;P<0.05 三,3例初发VKH综合征患者脑脊液中共刺激 分子的表达 3例初发VKH综合征患者脑脊液中淋巴细胞显着 增多,均有CTY28和CTI~A一4分子的表达(表3).与 患者自身外周血淋巴细胞比较(表4),脑脊液CINT 细胞显着增多(t=3.325,P<0.05),cD4/C【)8比值 显着升高(t=3.276,P<0.05),CTY28分子的表达也 显着增高(t=4.242,P<0.05). 表33例初发VKH综合征患者脑脊液淋巴 细胞表型及共刺激分子的表达(%) 表-I3例初发VKH综合征患者外周血淋巴 细胞表型及共刺激分子的表达(%) 讨论 Vogt一小柳原田综合征眼部主要表现为肉芽肿 性全葡萄膜炎,此炎症具有慢性化,反复发作,治疗 困难和易致盲等特点.其发病机理并不完全清楚,具 有多种免疫功能和免疫反应的异常,而T淋巴细胞 的激活起重要作用.本文主要从研究VKH综合征葡 萄膜炎活动期患者外周血和脑脊液淋巴细胞共刺激分 子的表达入手,以期探讨共刺激分子在T淋巴细胞 的活化和葡萄膜炎发生中的作用. 大量研究表明,CD28表达于静止及活化的T细 胞表面,80%的人类外周血T细胞(包括95% CD4T细胞和50%CD8T细胞)都有CD28的持 续表达,表达量相对稳定,T细胞激活后表达可有所 增强[.CD28与B7结合后,可传递共刺激信号给 T细胞.促进T细胞增殖,活化和产生大量的细胞 因子,并增强CTI的杀伤作用7.引.本研究中VKH 综合征活动期患者外周血CD4T细胞表面CD28分 子的表达有所增高,说明VKH综合征活动期患者外 周血CD4T细胞处于激活状态,促进葡萄膜炎及其 他局部病变的发生,持续;而静止期患者其表达有所 下降,说明CD4T细胞处于相对静止状态. CTLA一4只表达于活化的T细胞,静止T细胞 几乎不表达,活化后表达量成百倍地升高.但表达水 平仍较CD28低,仅及CD28的1/30,1/50[9I.CT. LA一4与B7结合后,可使T细胞的反应能力下降, 通过影响T细胞的增殖周期阻止T细胞的增殖,活 化,对T细胞的免疫应答起负性调节作用【1.本研 究显示.VKH综合征活动期,静止期患者外周血 CD4T细胞表面CTIA一4分子的表达都有增高, 但以葡萄膜炎静止期患者为显着,说明CTIA一4分 子对T细胞免疫应答的负性调节作用在疾病的不同 时期发挥作用的程度不同,在静止期患者其负性调节 作用占优势,CD4T细胞的活性被抑制,炎症消退, 疾病趋向痊愈. CD80(B7—1)和CD86(B7—2)表达于APC 表面.未受抗原刺激的APC中几乎不表达B7,经活 化后CD80和CD86的表达显着上调.激活的B细 胞,单核细胞,树突状细胞,巨噬细胞和T细胞上 中国实用眼科杂志2004年3月第22卷第3期 ChinJPraCtOphthalmo1.March2004,Vol22.No.3 均表达CD80和CD86[,l1].本研究发现VKH综合征 活动期患者外周血CD4和CD8T细胞表面CD86 分子的表达显着下降,至于原因,各文献中均未有报 道,可能与CIMCD86和CD8CD86T淋巴细胞 由周围血循环向眼,脑脊液和皮肤等病变处迁移有 关,这有待进一步证实. 与自身外周血淋巴细胞比较,3例初发VKH综 合征患者脑脊液CD4T细胞显着增多,CD4/CD8比 值显着升高,CD28分子的表达也显着增高,说明共 刺激分子的表达对T细胞的活化起重要作用,在 VKH发病过程中,大量CD4T细胞被激活后,进 入脑脊液,参与了炎症的发生,使患者出现神经系统 的改变如头痛,颈部强直等症状. 总之,VKH综合征患者外周血及脑脊液淋巴细 胞上B7,CD28和CTIA一4分子的表达与葡萄膜炎 的发生,持续,静止以及其他局部病变的发生密切相 关,阻断共刺激通路可能为今后VKH综合征患者的 临床治疗提供一种新途径. 参考文献 lOkadaT.SakamotoT,IshibashiT,eta1.VitiligoinVogt—Koy- anagi—Haradadisedse:immunologicalanalysisofinflammatorysite. ? 173? GrafesSArchClinExpOphthalmol,1996,34:359,363 2饧培增,挛绍珍,主编.葡萄膜炎.北京:人民卫生出版社. 1998.3ll,334 3LinsleyPS,LedbetterJA.TheroleoftheCD28receptorduringT cellresponsestoantigen.AnnualReviewofImmunol,1993.11: l9l,2l2 4ChambersCA,AllisonjP.CostimulationinTcellresponse.Curr OpinImmunol,l997,9:396,404 Haradasyndrome.AmJ 5SnyderDA,TesslerHA.Vogt—Koyanagi— Ophthalmol,1980,90:69,75 6TurkaLA,LedbetterJA,LeeK.eta1.CD28isaninducibleTcell surfaceantigenthattransducesaproliferationsignalinCD3mature thymocytes.JImmunol,1990,144;1646,1653 7JuneCH,BluestoneJA,NadlerLM,eta1.TheB7andCD28re. ceptorfamilies.ImmunolToday,1994,15:321,33l 8LanierLL,OFallonS,SomozaC,eta1.CD80(B7)andCD86 (B70)providesimilarcostimulatorysignalsforTcellproliferation. cytokineproduction,andgenerationofCTL.Jimmunol,1995. 154:97,105 9LindstenT,LeeKP.HarrisES.eta1.CharacterizationofCTLA 一 4structureandexpressiononhumanTcells.JImmunol,1993, l5l:3489,3499 10JenkinsMK.Theupsanddownsofcostimulation.Immunity, l994.1:443,446 llLenschow,DJ,SperlingAI,CookeMP,eta1.Differentialup— regulationoftheB7一landB7—2costimulatorymoleculesafterIgre. ceptorengagementbyantigen.JImmunol,1994,153:1990, l997 (收稿日期:2003.06) 先天性无虹膜症晶状体脱入玻璃体1例 栾秀丽 徐×男51岁住院号66168患自幼双眼视物不清, 10岁时出现双眼疼痛.曾诊断为双眼先天性无虹膜,青光眼. 25岁时因白内障双眼视力减退.1993年行左眼白内障囊外摘 除术.继之,右眼视力逐渐下降,2002年2月已降至光感. 因右眼无诱因突然视物较前清楚,于2003年5月20日入院. 右眼矫正视力0.12,左眼矫正视力0.08,双眼角膜直径约 9mm.周边角膜血管翳,角膜轻度水肿,无虹膜.右眼棕黄 色混浊的晶状体脱入玻璃体腔并附于视网膜后极部,头低位 时晶体浮起,玻璃体液化.左眼晶状体已摘除.双眼视乳头 边界清,色淡,杯盘比约0.9.视网膜血管正常,视网膜无出 血及渗出.房角镜检查因角膜周边血管翳视不清房角结构. 眼压右眼32.97mmHg,左眼24.38mmHg.A超检查右眼 24.75mm.左眼25.26mm.诊断为双眼先天性无虹膜,小角 膜,角膜血管翳,青光眼,右眼白内障并混浊晶状体自发脱 入玻璃体腔,左眼无晶体眼.入院后经药物降低眼压,于 2003年5月22日在局麻下行右眼玻璃体切割,晶体超声粉碎 作者单位:100076北京,北京市丰台区南苑医院眼科 通讯作者:栾秀丽 ? 临床报告? 术.术后矫正视力为0.12,右眼眼压17.30mmHg.左眼矫正 视力0.08,左眼眼压20.55mmHg.追问家族史.患者母亲, 两个弟弟,一个妹妹及一子一女均患有该病. 讨论:先天性无虹膜患者多数是常染色体显性遗传.该 患有明显的家族聚集现象.无虹膜有4种类型,本例为伴有 眼球振颤,小角膜,角膜血管翳,青光眼,视力减退型.白 内障自发性脱入玻璃体腔.晶状体悬韧带发生变性和营养不 良是自然晶体脱位最常见的原因.本例为白内障过熟期.晶 状体的变性改变也累及晶状体悬韧带,悬韧带变性,晶状体 可由于本身的重量或轻微外伤甚至用力和咳嗽,随之自发脱 位.本例无任何诱因,晶状体自发脱入玻璃体腔.有些患有 本病的人多年不发生任何不良反应,可进行观察.但该患眼 部多种先天异常,在原有青光眼基础上晶状体脱位于玻璃体 腔使眼压更难控制.脱入玻璃体腔的晶状体漂浮,不断改变 位置,刺激睫状体,使房水分泌增多,眼压增高.同时也可 导致视网膜脱离.脱位的晶状体为过熟期白内障.易产生过 敏性葡萄膜炎,也可继发青光眼.因此,遇此种情况应早行 手术.取出脱位的晶状体. (收稿日期:2003—08)