汉源产红花椒叶中麻味物质特征的研究

汉源产红花椒叶中麻味物质特征的研究 谢王俊，陈槐萱，李霄洁，祝瑞雪，钟凯，高鸿 (四川大学轻纺与食品学院，成都 610065) 5摘要:研究汉源产红花椒叶和果皮中酰胺类物质成分组成。通过高效液相色谱(HPLC)和 液相色谱-质谱联用(LC-MS)进行定性、定量分析。实验测得花椒叶中的酰胺类物质有: 羟基-ε-山椒素(0.001%)、羟基-α-山椒素(0.034 %)、羟基-β-山椒素(0.003 %)和羟基-γ- 山椒素(0.003 %);花椒果皮中的酰胺类物质有:羟基-ε-山椒素(0.036%)、羟基-α-山椒 素(2.2 %)、羟基-β-山椒素(0.01 %)、羟基-γ-山椒素(0.514 %)和花椒素(0.043 %)。 以上结果明，花椒叶中含有与果皮中类似的麻味物质成分，可以作为新型食品资源和调味 10 料。 关键词:花椒叶;花椒果皮;酰胺类物质;山椒素 中图分类号:TS201.2 15 Characterization of the pungent principles of Zanthoxylum bungeanum leaves from Han-Yuan region in China XIE Wangjun, CHEN Huaixuan, LI Xiaojie, ZHU Ruixue, ZHONG Kai, GAO Hong (College of Light Industry, Textile and Food Engineering, Sichuan University, ChengDu 610065) Abstract: The objective of this study was to investigate the pungent principles in Zanthoxylum bungeanum leaves and Zanthoxylum bungeanum pericarps from Han-Yuan region in China. The 20 qualitative and quantitative analysis of the main alkylamides were performed by HPLC and LC-MS. Hydroxy-ε-sanshool, hydroxy-α-sanshool, hydroxy-β-sanshool and hydroxyl-γ-sanshool were identified from the extracts of Zanthoxylum bungeanum leaves, and their contents were 0.001%, 0.034%, 0.003% and 0.003%, respectively. Also, five main alkylamides were identified in the extracts of Zanthoxylum bungeanum pericarps including hydroxy-ε-sanshool, hydroxyl-α- 25 sanshool, hydroxyl-β-sanshool, hydroxyl-γ-sanshool and bungeanool, and their contents were 0.036%, 2.2 %, 0.01%, 0.514% and 0.043%, respectively. The above result suggests that Zanthoxylum bungeanum leaves can be used as a new source of food and food flavouring. Keywords: Zanthoxylum bungeanum leaf; Zanthoxylum bungeanum pericarp; Alkylamides; Sanshool 30 0 引言 花椒(Zanthoxylum bungeanum)系芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxy lumLinn)植物。我 万公顷，主要分布于陕西、甘肃、山东、四川等地，其中四川汉源县 国花椒种植面积约 21 清溪花椒最为著名[1]。花椒成熟干燥果皮是人们常用的食品香味料，因其具有独特的―麻味‖ 35 而深受人们喜爱，被誉为―八大味‖之一[2]。花椒果皮中主要含有挥发油、生物碱、酰胺、木 脂素和香豆素等物质[3]。其中，以山椒素和花椒素为代表的不饱和脂肪酸酰胺是花椒的呈麻 味成分[4]。 除果皮外，花椒的另一副产物花椒叶，同样具有麻味，是我国的传统蔬菜和香料，可做 调料食用或制作椒茶[5]。《本草纲目》中记载:花椒叶性味辛、热、无毒，能够治寒积、霍 40 乱转筋、脚气、漆疮、疥疮。也有研究报道花椒叶具有一定的抗菌作用，还有活血、消炎、 止痛等药用价值[6]。花椒叶每年产量巨大，在花椒果实成熟后采集椒叶一般不影响来年的结 果和生产，但是目前仅有少部分花椒叶被加工利用，大部分都散落田间[7]。 基金项目:四川省科技支撑(2012NZ0023) 作者简介:谢王俊，(1990-)，男，硕士，食品生物化学。 通信联系人:高鸿，(1973-)，男，教授，食品生物化学。 E-mail: gao523@hotmail.com -1- 花椒叶含有芳香油、糖苷、纤维素、脂肪、维生素、矿质元素和氨基酸等。目前，国内 [8]，而对花椒叶 外对花椒叶挥发成分的研究较多，挥发油主要成分为萜烯化合物及其衍生物45 中麻味物质成分的研究较少[9-12]。本研究以四川汉源产红花椒叶为原料，研究其麻味物质， 并进行定性定量分析，同时与花椒果皮比较。为花椒叶作为新型食品资源和调味料提供理论 依据，以期对丰富的花椒叶资源进行综合利用。 1 材料与 50 1.1 原料 花椒果皮和叶于 2012 年 8 月采自四川汉源，阴干，经四川大学华西药学院鉴定后存放 于四川大学华西公共卫生学院备用。 1.2 试验方法 麻味物质的提取 1.2.1 55 将干燥花椒叶和果皮分别粉碎，过 40 目筛，各取 1 g，按料液比 1?10 加入氯仿(分析 级)，室温搅拌提取 12 h。减压抽滤后，向滤渣中加入 10 mL 氯仿，搅拌 30 min 后抽滤，合 并两次滤液。滤液经旋转蒸发仪(50 ?C)蒸干后，加入 2 mL甲醇(HPLC 级)，超声波处理 5min。 离心(2500 rpm, 10 min)后，取上清液过中性三氧化二铝(层析级)层析柱，所得提取液经旋 转蒸发仪蒸干。分别得花椒叶和果皮提取物 5.2 mg、43.2 mg，提取率分别为 0.52 %和 4.32 %。 60 1.2.2 HPLC 检测条件 色谱柱:MN Nucleodur 1100 - 5 C18 柱(4×125 mm, 5 µm);柱温:25 ?C;流动相 A: 水、流动相 B:乙腈(HPLC 级);进样量:20 μL;流速:0.5 mL/min;紫外检测波长:270 nm。 洗脱程序如表 1 所示。 表 1 HPLC 洗脱程序 Table 1 HPLC elution program 65 时间 (min) 流量 (mL/mim) A (%) B (%) 0 0.5 65 35 40 0.5 25 75 50 0.5 0 100 55 0.5 0 100 LC-MS 检测条件 1.2.3 色谱条件:MN Nucleodur 1100-5 C18 柱(4 × 125 mm，5 µm); 流速，0.5 mL/min;柱温， 25 ?C;检测波长，270 nm;进样量, 20 µL;洗脱程序如表 1 所示。 70 质谱条件:电喷雾离子源 (ESI)，正离子电离;喷雾电压 4500V;干燥气流速 10 L/min， 干燥温度 350?;雾化气压力 2. 07 × 102 kPa;毛细管出口电压 112.8 V，刮削器电压 40V。 扫描范围:m/ z 150 ~ 400。 2 结果与讨论 图 1 是花椒果皮和叶的提取物 HPLC 分析图谱，分别有 5 个和 4 个主要峰，并且 1—4 号峰保留时间一致，5 号峰为花椒果皮提取物独有。图谱中各个峰的在线光谱扫描如图 2 和 75 图 3，扫描曲线最大吸收峰均在 270 nm 左右。花椒果皮提取物的 LC–MS 检测结果和每个 峰的光谱扫描结果如表 2 所示。 -2- mAU 2 1750 (a) 1500 1250 1000 750 4 500 1 5 3 250 0 10 20 30 40 50 min (b) mAU 2 1000 800 600 400 200 3 4 1 0 50 10 20 30 40 min 图 1 (a) 花椒果皮提取物 HPLC 图谱;(b) 花椒叶提取物 HPLC 图谱 Fig. 1 HPLC chromatograms of the extracts of (a) pericarps of Zanthoxylum bungeanum and (b) leaves of 80 Zanthoxylum bungeanum; mAU mAU 30 1500 2 1 20 1000 500 10 0 0 300 400 500 600 700 300 400 600 700 λ / nm λ / nm mAU mAU 60 300 3 4 40 200 20 100 0 0 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700 λ / nm λ / nm mAU 30 520 10 0 300 400 500 600 700 λ / nm 图 2 图 1(a)中 1-5 号色谱峰的光谱扫描曲线 Fig. 2 UV spectra for peaks 1-5 in Fig.1 (a) 85 -3- mAU mAU 30 800 1 2 20 400 10 0 0 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700 λ / nm λ / nm mAU mAU 80 60 4 3 60 40 40 20 20 0 0 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700 λ / nm λ / nm 图 3 图 1(b)中 1-4 号峰的光谱扫描曲线 Fig. 3 UV spectra for peaks 1-4 in Fig.1 (b) 90 表 2 花椒果皮提取物中主要成分的保留时间，质谱和吸收峰值 Table 2 Retention times, MS and UV values of the main constituents in the extracts of pericarps of Zanthoxylum bungeanum 峰 分子量 物质名称 保留时间(min) 分子离子峰(M+Na)+ UV(nm) ，max 272 1 14.0 286 263 羟基-ε-山椒素 270 2 14.6 286 263 羟基-α-山椒素 268 3 15.3 286 263 羟基-β-山椒素 272 4 20.6 312 289 羟基-γ-山椒素 262 花椒素 5 22.9 314 291 95 花椒果皮图谱中 1、2、3、4 号峰(Rt 14.0 min，14.6 min，15.3 min，20.6 min)的光谱 扫描均显示在 270 nm 附近有三个吸收峰，此组吸收峰是脂肪族共轭双键的特征吸收峰型， 同时这与文献[13]报道的山椒素衍生物的吸收峰型相吻合。LC – MS 结果显示 1、2、3 号峰具 有相同的[M + Na]+ 阳离子形式(m/z 286，分子量 263 amu)。结合参考文献[9]可以确定 1、2 100 和 3 号峰分别为羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素。4、5 号峰可以参考文献中 对花椒中的山椒素和花椒素衍生物的报道，结合光谱扫描曲线和质谱数据，确定 4 号峰( [M + Na]+ 312，分子量 289 amu)为羟基-γ-山椒素、5 号峰( [M + Na]+ 314，分子量 291 amu) 为花椒素。图 4 给出了这几种测得的酰胺类物质结构式:羟基-ε-山椒素(1)、羟基-α-山椒 素(2)、羟基-β-山椒素(3)、羟基-γ-山椒素(4)与花椒素(5)。 -4- O ,, , , 羟基-ε-山椒素(1) O ,, , , 羟基-α-山椒素(2) O ,, , , 羟基-β-山椒素(3) O ,, , , 羟基-γ-山椒素(4) O OH ,, 花椒素(5) 105 图 4 花椒果皮提取物检出的各种酰胺类物质的结构 Fig. 4 Structures of compounds identified in the extracts of pericarps of Zanthoxylum bungeanum 花椒叶图谱中的 1、2、3、4 号峰的保留时间与花椒果皮图谱中的 1、2、3、4 号峰的保 110 留时间相同。并且对应峰的光谱扫描曲线也相同。因此可以确定花椒叶提取物图谱中 1、2、 3、4 号峰分别为羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素。汉源红花 椒叶和果皮中检测出的酰胺类物质与前期文献中报道的花椒中酰胺类物质指纹图谱相同 [14] 。花椒叶中含有与花椒果皮中类似的酰胺类物质成分。在汉源红花椒叶和果皮中羟基-α- 山椒素都是最主要的成分，其次是羟基-γ-山椒素和羟基-β-山椒素。与前期文献报道[9,11]的红 花椒(重庆大红袍)和青花椒中的酰胺类物质的相比，羟基-α-山椒素都是最基本的成分;而 115 汉源花椒叶和果皮中的羟基-γ-山椒素的相对含量较高，这可能是是汉源红花椒酰胺类物质 与其它地区花椒和青花椒的不同之处。其它研究表明, 花椒所特有的辛麻味来源于花椒中一 大类包括羟基-α-山椒素在内的被称为―山椒素‖的多烯酰胺类物质。这类物质能激活细胞表面 的一种被称为―瞬时受体电位香草酸亚型 I (transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)‖ 的非选择性的阳离子通道受体，导致钙离子内流使表达 TRPV1 的神经元去极化，从而刺激 120 神经末梢释放神经递质最终产生强烈的辛麻味[15-18]。因此，多烯酰胺类物质的含量和种类直 接决定了辛麻程度。 为了进一步对花椒叶和果皮中的各类酰胺类物质进行定量分析，我们对羟基-γ-山椒素 进行了分离纯化，制备得到羟基-γ-山椒素标准品。并且用 HPLC 法，以各浓度的羟基-γ- 山椒素在 270 nm 下吸收峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。软件拟合标准曲线 125 为:y = 300.55x，方程线性相关系数 R2 = 0.9982。经线性回归，计算得到样品中各酰胺类物 质的含量，结果于表 3。由表中可以看出，花椒叶中的各种酰胺类物质量均比果皮中少， 每克果皮中羟基-α-山椒素含量达到 2.2 mg，相应的花椒叶中仅为 0.03 mg，含量相差 73 倍。 每克果皮中测出的酰胺类物质总量 2.81 mg，每克花椒叶中仅为 0.04 mg，相差 70 倍。因此 椒叶的麻味程度要比花椒弱的多。汉源花椒果皮中的羟基-α-山椒素含量(2.2%)与比文献[9] 130 报道的重庆―大红袍‖中的羟基-α-山椒素含量(3–6%)略少，但汉源红花椒中羟基-γ-山椒素 -5- 含量(0.5%)比―大红袍‖要高。这进一步证明羟基-γ-山椒素可能是汉源花椒的特征酰胺类 物质。对汉源红花椒叶和果皮中麻味物质的定量分析对比可以发现花椒叶具有一定程度的麻 味，但麻味程度比花椒果皮要弱的多，适于部分对麻味刺激较为敏感的人群食用。同时多烯 135 [19] , 有 酰胺类物质作为新发现的 TRPV1 激动剂, 具有镇痛抗炎并有局部和表面麻醉的作用 着广泛的应用前景。而花椒叶作为含有酰胺类物质的潜在资源，也同样具有广泛开发利用前 景。 表 3 花椒叶和果皮中酰胺类物质的含量 Table 3 Contents of the main constituents in the extracts of leaves and pericarps of Zanthoxylum bungeanum 140 物质名称 果皮(mg/g 果皮) 叶(mg/g 叶) 0.036 0.001 羟基-ε-山椒素 2.207 0.034 羟基-α-山椒素 0.010 0.003 羟基-β-山椒素 0.514 0.003 羟基-γ-山椒素 0.043 0.000 花椒素 总量 2.810 0.041 3 结论 通过高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)对四川汉源产花椒叶和果 皮中的酰胺类物质进行定性、定量分析，结果显示花椒叶中含有与果皮中类似的酰胺类物质 成分;尽管花椒叶中的酰胺类物质含量比花椒果皮中少，但仍可以提供麻味物质。以上研究 145 为花椒叶作为新型调味食品的研究和花椒叶的综合利用提供理论依据和技术支撑。 [参考文献] (References) [1] 邓振义，孙丙寅，康克功，等. 花椒嫩芽主要营养成分的分析[J]. 西北林学院学报，2005，20(1): 179-180. 150 [2] 肖培根. 新编中药材志第二卷[M]. 北京:化学工业出版社，2002. [3] XIONG QB, SHI DW, MIZUO M. Flavonol glucosides in pericarps of Zanthoxylum bungeanum [J]. Phytochem, 1995, (39): 723-725. [4] BRYANT BP, MEZINE I. Alkylamides that produce tingling paresthesia activate tactile and thermal trigeminal neurons [J]. Brain Res, 1999, (842): 452-460. 155 [5] 史劲松，顾龚平，吴素玲，等. 花椒资源与开发利用现状调查[J]. 中国野生植物资源，2003，22(5): 6-8. [6] 李克坤. 花椒叶液治疗顽固性创面 27 例[J]. 中国医药学报，1991，6(12):31-32. [7] 崔俊，李孟楼. 花椒开发利用研究进展[J]. 林业科技开发，2008，22(2):9-14. [8] 李焱，秦军，黄筑艳，等. 同时蒸馏萃取 GC-MS 分析刺异叶花椒叶挥发油化学成分[J]. 理化检测(化 160 学分册)，2005，4(6):423-425. [9] ISELI. V, POTTERAT. O, HAGMANN. L, et al. Characterization of the pungent principles and the essential oil of Zanthoxylum schinifolium pericarp[J]. Pharmazie, 2007, 5(62): 396-400. [10] XIONG QB, SHI DW, HIROFUMI YAMAMOTO, et al. Characterization of the pungent principles and the essential oil of Zanthoxylum schinifolium pericarp[J]. Phytochemistry, 1997, 6(46): 1123-1126. 165 [11] YANG XG. Aroma constituents and alkylamides of red and green Huajiao (Zanthoxylum bungeanum and Zanthoxylum schinifolium) [J]. J.Agric.Food Chem, 2008, (56): 1689-1696. [12] WANG S, XIE JC, YANG W, et al. Preparative separation and purification of alkylamides from Zanthoxylum bungeanum maxim by HIGH-SPEED COUNTER-CURRENT chromatography[J]. Journal of Liquid Chromatogaraphy and Related Technologies, 2011, (34): 2640-2652. 170 [13] MIZUTANI K, FUKUNAGA Y, TANAKA O, et al. Amides from Huajiao, pericarps of Zanthoxylum bungeanum Maxim [J]. Chem Pharm Bull, 1988, 36: 2362-2365. [14] MÜLLER-JAKIC B, CLASSEN-HOUBEN D, BAUER R. Pericarpium Zanthoxyli Huajiao[M]// Wagner H, Bauer R, Peigen X. Jianming (eds) Chinese Drug Monographs and Analysis. Beijing: Chemical Industry Press, 1997/2005: 191-202. 175 [15] Koo J. Hydroxy-α-sanshool activates TRPV1 and TRPA1 in sensory neurons[J]. European Journal o f Neuroscience, 2007, 26(5): 1139-1147. [16] LENNERTZ R, TSUNOZAKI M, BAUTISTA D, et al. Physiological Basis of Tingling Paresthesia Evoked -6- by Hydroxy- {alpha}- Sanshool[J]. Journal of Neuroscience, 2010, 30(12): 4353-4353. [17] OKUMURA Y. Activation o f TRPV1 and TRPA1 by Black Pepper Components[J]. Bioscience, 180 Biotechnology, and Biochemistry, 2010, 74(5): 1068-1072. [18] RIERA C. Compounds from Sichuan and Melegueta peppers activate, covalently and non- covalently, TRPA1 and TRPV1 channels[J]. British Journal of Pharmacology, 2009, 157(8): 1398-1409. [19] SUGA, et al. Pungent qualities of sanshool- related compounds evaluated by a sensory test and activation o f rat TRPV1[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2005, 69(10): 1951-1757. 185 -7-