引物合成常见问题分析

引物合成常见问分析 1(需要合成多少OD的oligo, 一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ulPCR反应，以及 2000—2500 次的测序反应。因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。 如何测定引物的OD值: DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。 例如:您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。 2. 如何Oligo DNA的纯度, 实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp的引物使用12% 的凝胶。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95?2mins)。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。 3. 使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带, 由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行 Agarose 电泳时，容易出现多条泳带(更不能用 Agarose 电泳来进行定量了)。Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳，Agarose电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。而且，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。 4. 琼脂糖电泳后进行EB染色发现条带很弱，是Oligo DNA的量不够么, EB是通过嵌合到核酸的双螺旋结构中而使其显色的，而合成DNA是单链的，只有通过形成局部发夹结构或其它双螺旋结构的时候才能被染色。不同的引物由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异。比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的来定量，而用紫外分光光度计检测，或用上面说的PAGE凝胶电泳用荧光TLC板在紫外灯下观察，也可以用银染的方法。 5. 进行PAGE 电泳时，长度完全一样的 Oligo DNA 为什么泳带不在同一位置 ? ?A 、G 、C 、T 的组份不同，电泳速度不同; ? DNA 的立体结构不同，电泳速度不同; 这种情况在 Oligo DNA 越短时越容易发生，长链 Oligo DNA 之间差别较小。 6. 合成的引物PCR后无目的条带是什么原因 PCR 反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。 ? 引物和模板是否匹配 ; ? 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高级结构; ? PCR 反应用试剂是否正常; ? PCR 仪是否工作正常 ; ? PCR 反应条件是否合适 ; ?引物是否有问题; 如果一切正常，还无法解决问题时，可能是引物合成的问题，我们可以免费重新合成引物，再次合成还不成功就有可能不是引物的问题啦(合成两次都不成功的要收一次费用)。 7. 测定了Oligo DNA的OD值后发现A260/A280