产酸克雷伯氏菌耐氧产氢及其可溶性氢酶耐氧特性研究

产酸克雷伯氏菌耐氧产氢及其可溶性氢酶耐氧特性研究 参考文献 : 期 ,发酵液中开始检测到极少量高温蛋白酶活力 ; 进入生长稳 1 Zhu N. , Deng C. , Xiong Y. , et al . Performance characteristics of three 定期后酶活力迅速上升 ,至 44h 后产酶量趋于稳定 。嗜热脂肪 aeration systems in the swine manure compostingJ . Bioresource Technology , 土芽孢杆菌 CHB1 蛋白酶产量提高最快时正是芽孢大量产生 () 2004 ,95 3:319 - 326 . () 的时期 24h,44h,两者有一定相关性 。2 熊建军 ,刘淑英 ,邹国元 ,等. 高温堆肥过程中除臭保氮技术研究进 () 展J . 农业资源与环境科学 ,2008 ,24 1:444 - 448 . 3 杨国清. 固体废物处理工程M. 北京 :科学出版社 ,2000 . 4 李国学 ,张福锁. 固体废物堆肥化与有机复混肥生产 M . 北京 : 化 学工业出版社 ,1999 . 5 李秀艳 ,吴星五. 接种高温菌剂的生活垃圾好氧堆肥处理 J . 同济 () 大学学报 ,2004 ,32 3:367 - 371 . 6 任香芸 ,陈济琛 ,蔡海松 ,等. 一株耐高温细菌 CHB1 的分离和产酶 () 特性研究J . 微生物学杂志 ,2007 ,27 1:18 - 21 . 7 任香芸 ,陈济琛 ,蔡海松 ,等. 嗜热脂肪土芽孢杆菌 CHB1 生长特性 () 与培养条件研究J . 生物技术 ,2007 ,17 2:65 - 68 . 8 任香芸 ,蔡海松 ,林新坚 ,等. 嗜热脂肪土芽孢杆菌 CHB1 发酵培养 () 基的优化J . 福建农业学报 ,2007 ,22 1:54 - 57 . 9 沈萍 ,范秀容 ,李广武. 微生物学试验 M . 北京 : 高等教育出版社 , 1999 :92 - 95 . 图 2 CHB1 菌株生长与产蛋白酶曲线 10 张树政. 酶制剂工业M. 北京 :科学出版社 ,1984 :387 - 449 .Fig. 2 Curves of CHB1 growth and protease production 11 张云峰. 芽孢杆菌嗜热蛋白酶的性质研究J . 淮阴师范学院学报 :3 讨论 () 自然科学版 ,2004 ,3 3:250 - 254 . 3. 1 对固体平板上产酶特性的初步研究表明 , CHB1 具有较12 唐兵 ,周林峰 ,陈向东 , 等. 嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生 6 全的酶系且在蛋白酶选择培养基上的透明圈最大 , 因此本 () 条件及酶学性质J . 微生物学报 ,1999 40:188 - 193 . 文重点研究 CHB1 液体发酵产蛋白酶特性 。通过对 CHB1 产 13 郭勇. 酶工程M. 北京 :中国轻工业出版社 ,1997 :39 - 40 . 14 姚勇芳 ,李洪军. 弹性蛋白酶高产菌株摇瓶发酵条件优化研究 J .蛋白酶条件的优化 ,CHB1 发酵液酶产量最高可达 48UΠmL ,是 16 ,17 () 食品与机械 ,2006 ,22 1:18 - 22 .所报道多数嗜热细菌产蛋白酶量的 2,12 倍 。 15 刘军 ,陈向东 ,戴玄 , 等. 表面活性剂对嗜热脂肪芽孢杆菌产高温 3. 2 高温菌所产生的蛋白酶具有很高的热稳定性 ,并具有耐 () 蛋白酶的影响J . 微生物学杂志 ,2004 ,24 6:58 - 61 . 热变性剂 、耐有机溶剂等优点 ,在工业应用中显示出广泛和重 18 - 20 16 唐兵 ,周林峰 ,陈向东 , 等. 嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生要的应用价值。但是高温蛋白酶一般产量低 ,生产成本 () 条件及酶学性质J . 微生物学报 ,2000 ,40 2:188 - 192 .21 。本文通过 CHB1 产酶条件的优化 ,使蛋白酶产量有较 高 17 张燕新 ,赵印 , 许敬亮 , 等. 3 株高温蛋白酶产生菌的分离与鉴定 大提高 ,为增强 CHB1 在堆肥化中的应用效果具有重要意义 。 () J . 应用与环境生物学报 ,2007 ,13 4:561 - 564 . 此外 ,也为探究 CHB1 在其他方面的应用提供了理论依据 。 祝伟 ,彭谦 ,李勇 ,等. 泥土芽孢杆菌 YMTC1049 菌株高温蛋白酶产18 3. 3 前期在 CHB1 液体发酵工艺等研究中 ,对 CHB1 与嗜热脂 () 酶条件的优化J . 云南大学学报 :自然科学版 ,2003 ,25 5:463 - 468 . 肪芽孢杆菌两菌株的一些特点作了对比 ,初步确定 CHB1 与嗜 19 张云峰. 嗜热蛋白酶生产菌的筛选J . 西南师范大学学报 : 自然科 7 () 热脂肪芽孢杆菌为不同的菌株。本文对 CHB1 产酶条件研 学版 ,2006 ,31 2:157 - 161 . 20 黄光荣 ,应铁进 ,戴德慧 ,等. 嗜热芽孢杆菌蛋白酶 HS08 的分离纯 究表明 ,Tween - 80 在 0. 05 %,0. 5 %浓度范围内对 CHB1 产蛋 15 () 化研究J . 食品科学 ,2007 ,28 4:179 - 182 . 白酶具有抑制作用 , 而 刘 军 等研 究 表 明 , 在 此 浓 度 范 围 内 21 Kawarabayast Y , Sawada M , Horikawa H , et al . Complete sequence and Tween - 80 可 促 进 嗜 热 脂 肪 芽 孢 杆 菌 产 蛋 白 酶 。由 此 可 见 , gene organization of the genome of a hyper - thermophilic archaebacterium , Py2 CHB1 有别与嗜热脂肪芽孢杆菌 。CHB1 是否为新菌株 , 除了 ( ) () rococcus horikoshii OT3 supplementJ . D NA Res , 1998 , 5:55 - 76 . 上述差异外 ,还有待分子杂交试验 。 产酸克雷伯氏菌耐氧产氢及其可溶性氢酶耐氧特性研究1 1 1 1 2 1 3邬小兵,徐惠娟,丛一博,李倩一,徐方成,龙敏南 ()1. 厦门大学生命科学学院 ,厦门大学能源研究院 ,福建 厦门 361005 ;2. 厦门大学化学化工学院 ,福建 厦门 361005 ( ) 摘要 :目的 :考察产酸克雷伯氏菌 Klebsielal oxytoca HP1耐氧产氢特性及其可溶性氢酶的氧耐受特性 。方法 :研究 K. oxytoca ((() ) ) HP1 在不同气相氧浓度条件下利用葡萄糖 1 % ,mΠv、丙酮酸钠 0. 5 % ,mΠv及甲酸 0. 1 % ,vΠv等底物产氢活性的以及 K. oxyto2 () ca HP1 可溶性氢酶在空气及氧饱和溶液中催化产氢活性 。结果 : K. oxytoca HP1 在葡萄糖 1 % ,mΠv底物中具有较高耐氧产氢活 性 ,6h 内在气相氧浓度为 5 % 、10 %和 21 %条件下的氢产量分别为厌氧条件下的 20. 9 % 、13. 7 % 、8. 3 % ; K. oxytoca HP1 可溶性氢 酶在空气中孵育 12h 后 ,其活性残余 85. 4 % ,在氧饱和溶液中活性损失一半约 3h 。结论 :试验结果提示 K. oxytoca HP1 具有耐氧 产氢特性 ,其可溶性氢酶具有较高氧耐受性 ,在氢能源的开发中具有潜在的应用前景 。 关键词 :产酸克雷伯氏菌 ;氢酶 ;耐氧 ;产氢 中图分类号 :Q935 文献标识码 :A () 文章编号 :1004 - 311X200804 - 0031 - 04 Study on Hydrogen Production Activity of Klebsielal oxytoca HP1 and Sta bility of Its Sol uble Hydrogena se under Atmosphere with O 21 1 1 1 2 1WU Xiao - bing, XU Hui - juan, CONG Yi - bo, L I Qian - yi, XU Fang - cheng, LONG Min - nan (1 . School of Life Science ,Research Institute of Energy , Xiamen University , Xiamen 361005 , China ; )2 . School of Chemistry and Chemical Engineering , Xiamen University , Xiamen 361005 , China Abstract : Objective : To study the hydrogen production activity of K. oxytoca HP1 under condition with oxygen stress and the oxygen tolerance () ability of its soluble hydrogenase . Method : The hydrogen production activity of K. oxytoca HP1 incubated in glucose 1 % ,mΠv, sodium pyru2 () () vate 0. 5 % ,mΠvor formate 0. 1 % ,vΠvunder atmosphere with 0 % ,5 % ,10 % and 21 % Owere studied on , and the remain activity of its 2 soluble hydrogenase incubated in air or pure Oduring 0 - 12h were studied on. Result : The results show that K. oxytoca HP1 has high hydrogen 2 () production activity in glucose 1 % ,mΠvsubstrate under atmosphere with oxygen. Compared to in anaerobic condition , the hydrogen production of K. oxytoca HP1 under atmosphere with 5 % , 10 % and 21 % oxygen was 20. 9 % ,13. 7 % and 8. 3 % respectively in 6h. The soluble hydroge2 nase from K. oxytoca HP1 exhibits considerable oxygen toleration ability , the remain activity was 85. 4 % after the hydrogenase exposure to air 12h and its activity lost half after the hydrogenase exposed to oxygen 3h. Conclusion : These results suggest that K. oxytoca HP1 and its soluble hydrogenase have potential to be applied in hydrogen production and application. Key words : Klebsielal oxytoca HP1 ; hydrogenase ; oxygen toleration ; hydrogen production 8 生物制氢是大规模 、低成本制取燃料氢的重要途径 。生 1. 2. 2 产氢分析 物制氢包括微生物发酵有机底物产氢和光生物制氢 ,大多产 按文献 8 所描述的方法分析菌株产氢活性 。1 ,2 氢微生物和藻类产氢代谢对氧极为敏感 ,微量氧即可使其 1. 2. 3 可溶性氢酶制备 () 取1 000ml细菌培养液 ,离心收菌体 4 000g ,10min, Tris - 产氢活性消失 。大规模发酵制氢过程中要达到严格厌氧的环 () HCl 缓冲液 50mmolΠL ,p H 7. 5洗一次 ,重悬于菌体 10ml Tris - 境十分困难 ,因此开发具有耐氧特性的高产氢活性菌株可以 ( HCl 缓冲 液 , 超 声 波 破 碎 细 胞 , 离 心 去 除 菌 体 残 片 12 000g ,促进规模化生物制氢的发展 。 ) ( ) 30min,然后超速离心 160 000g ,1h去除细胞亚结构 ,取上清 氢酶是生物制氢的关键酶 ,氢酶具有催化产氢和吸氢的 ( ) 用于测试 。 双向功能 。在细胞外 ,氢酶可替代金属 铂或铂族金属作为 1. 2. 4 氢酶活性分析电解水产氢和 H- O燃料电池催化材料 ,而且具有廉价 、可 2 2 3 ,4() 采用甲基紫晶 MV作为电子载体 ,以连二亚硫酸钠作为 。但 氢 酶 对 分 子 氧 极 为 敏 再生 、低一 氧 化 碳 毒 性 等 优 点 5 - 7还原剂 ,使用 UNISENSE 氢电极检测系统检测氢酶产氢活性 。 ,普通氢酶在 1 %的氧分压下即迅速失活 , 而光解水产 感 () 反应体 系 包 括 Tris - HCl 缓 冲 液 p H 8. 0 , 30mmolΠL 、终 浓 度氢和电解水产氢的过程都伴随着氧的释放 , H- O燃料电池 2 2 也需要氧作为氧化剂 。因此 ,提高氢酶的氧耐受性对氢能源 7. 5mmolΠL的 MV 、终 浓 度 为 25mmolΠL NaSO的 反 应 体 积 为2 2 4 ( 的开 发 和 有 重 要 意 义 。产 酸 克 雷 伯 氏 菌 Klebsielal oxytoca 1ml 。使用恒温循环仪控制温度 ,在 30 ?下进行 。电极检测到 ) HP1为作者实验室自 65 ?温泉中分离的嗜热菌株 ,其在葡萄 的产氢数据用软件 ,氢酶溶液中的蛋白含量用 Bradford 法 8 - 10 ( 测定 ,样品的氢酶活性用每 g 蛋白每 h 的 产 氢 量 mmol H?g 糖底物中具有较高的产氢活性 ,作者试验研究了 K. oxy2 2 - 1 - 1 ) toca HP1 在各种底中的耐氧产氢特性及其可溶性氢酶的耐氧 prot h? 表示 。分析氢酶耐氧特性时 ,取氢酶上清液 5ml 置 特性 。 于 25ml 血清瓶中 , 置于 37 ?, 通纯氧鼓泡以使溶液中的氧饱 (和 测定空气对氢酶酶活的影响时 ,直接将氢酶溶液暴露在空 1 材料和方法 ) 气中,每隔 2h 测定其催化放氢的活性 ,并计算各时间点酶活 1. 1 材料(性残留百分数 通氧 t h 酶活残留 = 通氧 t h 酶活Π原初酶活 × 1. 1. 1 实验材料) 100 %,各样品做 2 个平行样 。 K. oxytoca HP1 由 本 实 验 室 分 离 并 保 存 , Escherichia coli2 结果与分析 α DH5由本实验室保存 。 2. 1 K. oxytoca HP1 菌株在不同底物中的耐氧产氢活性 1. 1. 2 试剂K. oxytoca HP1 能利用不同底物在不同氧浓度条件下产 () 甲基紫晶 methyl viologen ,MV购自 Sigma 公司 ,其余试剂 () 氢 表 1,前 6h K. oxytoca HP1 在 5 % 、10 %和 21 %的气相氧条 为国产分析纯 。 () 件下利用葡萄糖 1 % ,mΠv氢产分别为厌氧条件下的 20. 9 % 、 1. 1. 3 仪器() 13. 7 % 、8. 3 % ,利用丙酮酸钠 0. 5 % ,mΠv产氢分别为厌氧条 H250 氢 电 极 检 测 系 统 , 丹 麦 Unisense 公 司 产 品 ; HX -( ) 件下的 9. 3 % 、5. 8 %和 2. 9 % ,利用甲酸 0. 1 % ,vΠv产氢分别 1050 恒温循环水浴仪 , 北京德天佑科技公司产 品 ;J Y92 - IID为厌 氧 条 件 下 的 11. 5 % 、5. 9 %和 2. 9 % 。至 30h , K. oxytoca 超声 波 破 碎 仪 , 宁 波 新 芝 公 司 产 品 ; L - 100XP 超 速 离 心 机 , ( HP1 在 5 % 、10 %和 21 %的气相氧条件下利用葡萄糖 1 % ,mΠ Beckman 公司产品 。 ) v氢产分别为厌氧条件下的 29. 1 % 、16. 7 % 、12. 1 % ,利用丙酮 1. 1. 4 培养基() 酸钠 0. 5 % ,mΠv产氢量分别为厌氧条件下的 14. 4 % 、8. 1 %和 - 1 () 生长培养基 L :酵母膏 5g ,蛋白胨 10g ,氯化钠 5g ,葡萄 () 3. 3 % ,利用甲酸 0. 1 % ,vΠv产氢分别为厌氧条件下的 9. 4 % 、糖 5g 。 4. 4 %和 2. 5 % 。- 1 8 () 1 %葡 萄 糖 产 氢 缓 冲 液 L : 葡 萄 糖 10g , NaCl 3g ,表 1 K. oxytoca HP1 利用不同底物耐氧产氢 MgCl0. 10g , FeSO7?HO 0. 1g , NaHPO1?2HO 14. 33g ,2 4 2 2 4 2 Tab. 1 The hydrogen production of K. oxytoca HP1 under atmosphere with O 2 KHPO3. 63g , p H 6. 98 。2 4 - 1 () 0. 5 %丙酮酸钠产氢缓冲液 L : 丙酮酸钠 5g , NaCl 3g , Initial oxygen MgCl0. 10g , FeSO7?HO 0. 1g , NaHPO1?2HO 14. 33g , KH- 1 2 4 2 2 4 2 2 () Yield of hydrogen production mmol H ?g dw 2 concentration substrates PO3. 63g , p H 6. 85 。 4 ( )in gas phage % 6h 12h 18h 24h 30h ()0 28. 05 52. 93 69. 12 79. 81 84. 56 1 % mΠv - 1 glucose 5 5. 85 11. 67 17. 42 21. 58 24. 61 () 0. 1 %甲 酸 产 氢 缓 冲 液 L : 甲 酸 1ml , NaCl 3g , MgCl2 10 3. 85 7. 33 10. 75 12. 63 14. 26 0. 10g , FeSO7?HO 0. 1g , NaHPO1?2HO 14. 33g , KHPO 4 2 2 4 2 2 421 2. 33 4. 92 7. 89 9. 47 10. 22 3. 63g , p H 6. 28 。()0 27. 46 51. 28 69. 02 72. 82 73. 42 0. 5 % mΠv 1. 2 方法5 2. 55 4. 19 6. 96 8. 95 10. 60 sodium 1. 2. 1 生长培养10 1. 60 3. 14 4. 38 5. 27 5. 95 pyruvate α 将 K. oxytoca HP1 及 E. 21 0. 81 1. 50 1. 99 2. 35 2. 45 coli DH5接种于装有 50ml 生长 0 39. 82 50. 64 52. 84 51. 79 51. 83 ()0. 1 % vΠv 培养基的 140ml 血清瓶 ,瓶内充满氩气 ,37 ?、130rΠmin 条件下 5 4. 58 5. 42 5. 18 5. 05 4. 88 formic 厌氧培养 24h 。10 2. 34 2. 50 2. 38 2. 33 2. 30 acid 21 1. 15 1. 38 1. 30 1. 32 1. 30 收稿日期 :2008 - 04 - 23 ;修回日期 :2008 - 05 - 11 α() . coli DH5在无氧条件下能利用葡萄糖 1 % ,mΠv、丙酮 E()基金项目 :福建省青年科技人才创新项目资助 No . 12005J 003 (() ) 酸钠 0. 5 % ,mΠv和甲酸 0. 1 % ,vΠv产氢 。前 6h ,在甲酸中的() 作者简介 :邬小兵 1973 - ,男 ,博士 ,讲师 ,从事生物制氢研究 ; 3 通 - 1 产氢活性最高 ,为 7. 98mmol Hg? dw ,利用葡萄糖和丙酮酸 讯作者 : E - mail : longmn @xmu. edu. cn 。 2 - 1 现产酸克雷 伯 氏 菌 在 葡 萄 糖 底 物 中 具 有 较 高 的 耐 氧 产 氢 活 钠产氢活性较低 ,分别为 2. 18mmol Hg? dw 和 0. 94mmol H? 2 2 - 1 ,在 5 % 氧 浓 度 条 件 下 , 其 产 氢 活 性 可 达 厌 氧 条 件 下 的性 α ( ) g dw 。至 18h , E. coli DH5利 用 葡 萄 糖 1 % , mΠv产 氢 为- 1 20. 9 % ,在 21 %氧 分 压 条 件 下 产 氢 活 性 达 厌 氧 条 件 下 的 8.μ15. 58mmol Hg ? dw , 与 E. coli BW25113 菌 株 24molΠmg 2 153 % ,大规模发酵制氢环境中仅存在微量的氧 , 因此该菌株在 () 经测定 ,每 g 菌体干重含 蛋 白 0. 6g的 结 果 较 为 一 protein 发酵制氢中具有潜在的应用前景 。 α 致 。而在 5 % 、10 %和 21 %的气相氧条件下 E. coli DH5不能 () 利用任何底物产氢 表 2。 α表 2 E. coli DH5利用不同底物耐氧产氢 α Tab. 2 The hydrogen production of E. coli DH5under atmosphere with O 2 Initial oxygen - 1 ()Yield of hydrogen production mmol Hg? dw 2 substrates concentration ( ) in gas phage %6h 12h 18h 24h 30h ()0 2. 18 9. 23 15. 58 19. 82 22. 00 1 % mΠv glucose 5 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 21 0 0 0 0 0 ()0 0. 94 3. 03 8. 64 26. 28 26. 64 0. 5 % mΠv 5 0 0 0 0 0 sodium 图 1 K. oxytoca HP1 可溶性氢酶氧稳定性 10 0 0 0 0 0 pyruvate Fig. 1 Oxygen toleration ability of soluble hydrogenase from K. oxytoca HP1 21 0 0 0 0 0 一些极端环境中分离到的产氢微生物大多含有耐热 、耐()0 7. 98 19. 78 29. 91 30. 63 31. 44 0. 1 % vΠv 11 - 15 氧特性的氢酶 。 Pyrococcus f uriosus 最适产氢温度为 97 ?, 5 0 0 0 0 0 formic 15 在空 气 环 境 中 其 可 溶 性 氢 酶 活 性 损 失 一 半 的 时 间 约 6h。10 0 0 0 0 0 acid 21 0 0 0 0 0 Thermotoga maritima 为生长在 97 ?的嗜热细菌 ,其可溶性氢酶 有很强的热 稳 定 性 , 但 其 对 氧 极 端 敏 感 , 在 空 气 中 轻 微 振 荡K. oxytoca HP1 在耐氧产氢过程中对气相中的氧有一定 11 15s 其活性即损失 80 % 。 Hirof umi N. 从深海环境中筛选到 () 消耗 表 3,在前 6h 气相中氧浓度仍维持较高水 平 , 在 5 % 、 一株产氢细菌 Hydrogenov - ibrio marinus ,其膜结合态氢酶在空 ( ) 10 %和 21 %的气相氧条件下利用葡萄糖 1 % , mΠv产氢样品 气环境和 70 ?条件下孵育 50min 还剩余 90 %的活性 ,而 Alcali2气相中剩余氧浓度分别为 3. 20 、6. 93 和 18. 35 ,利用丙酮酸钠 11 genes eutrophus 氢酶 在 空 气 中 孵 育 2 h 后 只 有 23 %的 活 性 。 () 0. 5 % ,mΠv产氢样品气相中剩余氧浓度分别为 3. 25 、6. 94 和Aquifex aeolicus 分离自 85 ?环境 , 其 hyd ?具 有 很 高 的 氧 耐 受 () 18. 92 ,利用甲酸 0. 1 % ,vΠv产氢样品气相中剩余氧浓度分别 性 ,在 0 ?条件下曝氧 24h ,其活性只损失 50 % ,但其氢酶 ?对 为 2. 78 、6. 54 和19. 14 。至 30h ,在 5 % 、10 %和 21 %的气相氧条 12 氧较敏感 。 K. oxytoca HP1 是一株分离自 65 ?环境中的高 ( ) 件下利用葡萄糖 1 % ,mΠv产氢样品气相中剩余氧浓度分别 产氢嗜热菌 ,其可溶性氢酶在室温条件下暴露在空气中 12h 尚 () 为 1. 61 、4. 40 和 12. 18 ,利用丙酮酸钠 0. 5 % ,mΠv产氢样品气 能保持原初活性的 85. 4 % ,而在氧饱和环境条件下 ,其活性损 (相中剩余氧浓度分别为 1. 45 、3. 38 和 14. 12 ,利用甲酸 0. 1 % , 失一半的时间约为 3h 。可见 K. oxytoca HP1 可溶性氢酶对氧 ) vΠv产氢样品气相中剩余氧浓度分别为 3. 11 、6. 84 和 19. 05 ,此 的耐受力较已报道的同类耐氧氢酶高 ,该氢酶的高耐氧特性 结果说明 K. oxytoca HP1 在不同气相氧浓度条件下利用不同 使其在电解水制氢及燃料电池中的应用具有良好前景 。 底物所产氢不是在氧耗尽之后产生 。参考文献 : 3 K. oxytoca HP1 耐氧产氢过程氧消耗 表 1 Michael S , Paul K , Liping Z , et al . Molecular engineering of algal h pro2 2 The oxygen consumption of K. oxytoca HP1 during hydrogen produc2 Tab. 3 duction Proceedings of the 2002 U. S. Z . DOE Hydrogen Program Review , t ion 2002 , NRELΠCP - 610 - 32405 . ( )the oxygen concentration in gas phage % substrates 2 林明 ,任南琪 ,王爱杰 ,等. 高效产氢发酵细菌在不同气相条件下产 0h 6h 12h 18h 24h 30h () 氢J . 中国沼气 , 2002 , 20 2: 3 - 7 . ()1 % mΠv 5 3. 20 2 . 99 2 . 14 1 . 72 1 . 61 3 Karyakin A A , Morozov S V , Karyakina E E ,et al . Hydrogen fuel electrode 10 6. 93 6 . 47 5 . 65 4 . 98 4 . 40 glucose based on bioelectrocatalysis by the enzyme hydrogenase J . Electrochemistry 21 . 03 18 . 35 16 . 88 14. 72 13 . 38 12. 18 Communications ,2002 ,4 : 417 - 420 . () 0 . 5 % mΠv4 Morozova S V , Vignaisb P M , Cournacc L ,et al . Bioelectrocatalytic hydro 2 5 3. 25 3 . 23 2 . 73 2 . 16 1 . 45 gen production by hydrogenase electrodes J . International Journal of 10 6. 94 6 . 02 4 . 75 3 . 95 3 . 38 sodium Hydrogen Energy , 2002 , 27 : 1501 - 1505 . 21 . 03 18 . 92 17 . 05 15. 35 14 . 17 14. 12 pyruvate 2 5 Morozov S V , Voronin O G , Karyakina E E. Tolerance to oxygen of hydro (5 2. 78 2 . 65 2 . 95 3 . 07 3 . 11 )0 . 1 % vΠv gen enzyme electrodes J . Electrochemistry Communication , 2006 , 8 : 851 10 6. 54 6 . 34 6 . 53 6 . 58 6 . 84 formic - 854 . 21 . 03 19 . 14 18 . 63 18. 80 18 . 98 19. 05 acid 6 Wenk S O , Qiana D J , Wakayama T. Biomolecular device for photoinduced 2. 2 K. oxytoca HP1 可溶性氢酶氧耐受特性 hydrogen productionJ . International Journal of Hydrogen Energy , 2002 , 27 : 1489 - 1493 . 图 1 显示 K. oxytoca HP1 可溶性氢酶具有很高耐氧活性 。 7 Vincent A , Marc F. Some general principles for designing electrocatalysts 在空气中孵育 12h 后 , 其氢酶活性残余 85. 4 % 。在氧饱和溶 with hydrogenase activityJ . Coordination Chemistry Revie ws , 2005 , 249 : 液中 4h 后 K. oxytoca HP1 氢酶活性为原初活性的 43. 8 % ,8h1518 - 1535 . 后残留活性为 18. 3 % ,12h 后残余活性为 8. 8 % ,其活性损失一 8 Long M N , Huang J L , Wu X B , et al . Isolation and characterization of a 半的时间约为 3h 。 high H- producing strain Klebsiella oxytoca HP1 from a hot spring J . Re2 2 3 讨论 search in Microbiology , 2005 , 156 : 76 - 81 . 1 ,2 ,大规 大多产氢微生物和藻类产氢代谢对氧极为敏感 9 朱俊波 , 龙敏南 , 徐方成 ,等. Klebsiella oxytoca HP1 adhE 基因插入 模发酵制氢过程中要达到严格厌氧的环境十分困难 ,因此耐 () 失活法构建产氢重组菌J . 科学通报 ,2007 ,52 1:55 - 58 . 10 徐方成 , 洪华生 , 龙敏南. 通气提高 Klebsiella oxytoca HP1 发酵产氧产氢微生物在规模化发酵制氢中具有优势 。本试验研究发 () perthermophilic bacterium Aquifex aeolicus : electrocatalysis of the hydrogen pro2 氢J . 厦门大学学报 , 2006 ,45 6:832 - 835 . 11 Hirofumi N , Youji M , Katsuhiro A. Characterization of an extremely ther 2 ductionΠconsumption reactions at carbon electrodesJ . Journal of Electroana2 lytical Chemistry , 2005 , 577 : 79 - 86 . mophilic and oxygen - stable membrane - bound hydrogenase from a marine hydrogen oxidizing bacterium hydrogenovibrio marinu J . Biochemical and 14 Thorsten B , Oliver L , Norbert K , et al . Oxygen tolerance of the h - 2 () Biophysical Research Communications , 1997 ,232 3: 766 - 770 . ralstonia eutropha h16 is based on limited ac2 sensingnife hydrogenase from 12 Marianne G , Pascale T , Val érie B. Hyperthermostable and oxygen resis2 ( ) cess of oxygen to the active site J . J. Biol . Chem. , 2005 , 280 25 : tant hydrogenases from a hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus : Physico2 23791 - 23796 . chemical properties J . International Journal of Hydrogen Energy , 2006 , 15 Bryant F O , Adams , M W. Characterization of hydrogenase from the hy 2 31 : 1424 - 1431 . perthermo - philic archaebacterium , Pyrococcus f uriosus J . J. Biol . Chem. , 13 Elisabeth L . , Marie - Therese G O , Pierre B. Hydrogenases from the hy 2 1989 , 264 : 5070 - 5079 . 稀土元素对鲤鱼黏液细胞作用的时效关系研究 张贵生 ()菏泽学院生命科学系 ,山东 菏泽 274015 3 + () 摘要 :目的 :探讨镧对鲤鱼黏液细胞的作用 。方法 :利用阿新蓝过碘酸雪夫试剂 AB - PAS染色方法 ,研究了 0. 1mgΠL La暴 3 + 露 1d 、3d 、6d 、30d 、120d 时对鲤鱼黏液细胞的影响 。结果表明 :在 La暴露 1 、3 、6d 时 ,口腔 、鳃 、中肠 、后肠黏液细胞密度低于或显 著低于相应对照组 黏 液 细 胞 的 密 度 。口 腔 和 鳃 在 暴 露 3d 时 , 中 肠 在 暴 露 6d 时 , 黏 液 细 胞 密 度 最 低 , 分 别 比 对 照 组 降 低 了( 36. 12 %、48. 02 %和 21. 87 % ;当暴露 30d 和 120d 时 ,与相应对照组相比 ,黏液细胞密度均有大幅度提高 ,且显著高于对照 P < 0. 01) 或 P < 0. 05。鳃和后 肠 在 暴 露 30d 时 , 口 腔 、前 肠 、中 肠 在 暴 露 120d 时 , 黏 液 细 胞 密 度 最 高 , 分 别 比 对 照 组 提 高 了 23. 03 %、 24. 62 %、26. 53 % 、32. 07 %和 40. 84 % 。结论 :一定时间的镧暴露 ,可明显诱导黏液细胞的增殖 。 关键词 :镧 ;鲤鱼 ;黏液细胞 中图分类号 : X530 . 225 ; X530 . 2 文献标识码 :A () 文章编号 :1004 - 311X200804 - 0034 - 03 Time - effect Relationship Research on the Effect of Mucous )( Cells by Rare - Earth Elements in Cypri n us ca rpio Linnaeus C. ca rpio ZHANG Gui - sheng ()Department of Life Science , Heze College , Heze 274015 , China ) ( Abstract : Objective : The impact of rare - earth element to the mucous cells of Cyprinus carpio Linnaeus C. carpiowas studied. Method : The 3 + 3 + studies were carried out on the effect of Laexposed for 1d , 3d , 6d , 30d , 120d at the concentration of 0. 1 mgΠL Laon the mucous cells of 3 + ) ( Cyprinus carpio Linnaeus C. carpioby method of AB - PAS combined staining. Result : Laresulted in decreasing or obvious decreasing of mu2 3 + cous cells densities in comparison with control group in oral cavity , gill , middle intestine and retrial intestine of C. carpio , when Lawas ex2 posed for 1d , 3d , 6d. Densities of mucous cells in oral cavity and gill at the third day and middle intestine at sixth day were lowest and reduced 36. 12 % ,48. 02 % and 21. 87 % respectively in comparison with control group ; Mucous cells densities in different parts of alimentary tract were 3 + ( ) obviously increasing in comparison with control group P < 0. 01 or P < 0. 05,when Lawas exposed for 30d and 120d. Densities of mucous cells in gill and retrial intestine at the 30th day and in oral cavity , former intestine and middle intestines at 120th day were raised 23. 03 % ,24. 62 % ,26. 53 % ,32. 07 % and 40. 84 % respectively in comparison with control group . Conclusion : Increasing of mucous cells number was in2 3 + duced by Laexposed for a certain time . Key words :lanthanum ; Cyprinus carpio Linnaeus ; mucous cell 鱼类黏液细胞是普遍存在于鱼类的皮肤 、鳃 、口腔 、肠等 ,体长 12. 00 ?0. 30cm ,体重 20. 25 ?3. 59g。 养殖厂提供 1. 1. 2 试剂不同组织器官上皮中的一种腺体细胞 ,其分泌的黏液中含有 大量的活性物质 ,如溶菌酶 、转移因子 、C - 反应蛋白及补体类 LaCl、苦味酸 、甲醛 、二甲苯 、无水乙醇 、95 %的乙醇 、阿新3 1 物质等,具有防止机械损伤 、抑菌杀菌 、防止病原微生物侵 蓝 、过碘酸等 ,均为国产分析纯 ; 袭的作用 。因此黏液细胞行使着比较重要的免疫功能 。曾有 1. 1. 3 仪器2 学者报道免疫原性物质可提高鱼类黏液细胞的数目 , 从而 NC303 - 7 型电热恒温箱 、HHS2 - 4 型电热恒温水浴锅 、切 提高鱼类的免疫力 ,但关于稀土元素对黏液细胞的作用 ,国内 片机等 。 外尚未见报道 。稀土元素在我国作为动物饲料添加剂已被广 1. 2 方法 泛应用于水产养殖业 。研究证明 ,饲料里添加微量稀土 ,可促 1. 2. 1 实验材料的培养与处理3 4 进鱼类生长 , 提高鱼类的抗病能力 。本实验选用我国养 将鲤鱼在无离子水中驯养 1w 。然后随机取 24 尾和 10 尾 分别置于含 25L 和 10L 0. 1mgΠL LaCl溶液的塑料桶中 , 再取 殖意义较大的鲤鱼为试验材料 ,以 AB - PAS 染色方法 ,研究了 3 稀土元素镧暴露 1d 、3d 、6d 、30d 、120d 对鲤鱼黏液细胞的作用 , 10 尾置于含 10L 无离子水的塑料桶中作为对照 ,充氧机充氧 , ( ) 期望能为稀土元素在养殖业上的科学应用 ,探索稀土元素对 每日上午喂金鱼饵料 不含稀土元素一次 , 每 2d 换水一次 , 鱼类免疫作用的机理提供科学依据 。 水温 10,15 ?。 1. 2. 2 切片的制作和观察1 材料与方法 3 + 在暴露 1d 、3d 、6d 、30d 时 ,从放置 24 尾的0. 1mgΠL La处 1. 1 材料 理组 中 每 次 随 机 取 6 尾 , 在 暴 露 120d 时 , 从 放 置 10 尾 的 1. 1. 1 实验材料3 + 0. 1mgΠL La处理组及对照组中各随机取鲤鱼 6 尾 ,解剖取其 ( ) 鲤鱼 Cyprinus carpio Linnaeus由 菏 泽 市 刘 寨 乡 刘 寨 种 鱼 ( ) 鳃 、口腔上皮 咽磨前部、前肠 、中肠 、后肠 ,用 0. 65 %的生理 μ盐水冲洗 ,Bouin’s 液固定 ,常规石蜡切片 ,切片厚度 6m ,阿新 5 收稿日期 :2008 - 04 - 21 ;修回日期 :2008 - 06 - 09 () () 蓝和过碘酸雪夫式 AB - PAS染色 AB 染液 p H 2. 6,黏液 (基金项目 : 山东省教育厅项目资助 “黄河鲤鱼与生态养殖及机理研 细胞呈现四类不同的颜色 ,据此可将鲤鱼黏液细胞分为四种 )究”,J 07J W47 6 () 作者简介 :张贵生 1972 - ,男 ,讲师 ,硕士 ,从事动物生态学研究 , E - 类型: ?型 ,呈红色 ; ?型 ,呈蓝色 ; ?型 ,呈紫红色 ; ?型 ,呈 mail :zgz2007hzxy @126 . com 。 () 蓝紫色 图 1。