0800 核移植技术与动物克隆（可编辑）

0800 核移植技术与动物克隆（可编辑） 0800 核移植技术与动物克隆 干细胞与组织工程 两则相关新闻 ? 黄禹锡事件回放干细胞 ?美科学家成功利用患者自身细胞再造 膀胱组织组织工程 ? 黄禹锡事件回放干细胞 2004年2月黄禹锡领导的研究小组在世界上率先用卵子培育 成功人类胚胎干细胞 1998年美国威斯康星大学西蒙斯领导的实验室首次用 人类早期胚泡分离出14个细胞的内细胞团并培养出5个人 胚胎干细胞系得到了人的多潜能胚胎干细胞系美国 《科学》杂志1999年度世界十大科学成就评选中将干细 胞的研究排名第一 然而多数成体干细胞数量极少缺乏特异性的表面标 志难以识别分离和纯化在体外很难稳定地传代培 养时至今日人类在体外培养获得大量用以治疗的干细 胞依然十分艰难令人难以置信的是韩国的黄禹锡自称 完全掌握了这项尖端培养技术他们在两年时间里在 《科学》先后发表了两篇文章了惊人的进步 2004年2月在第一篇论文中他们自称在 人类历史上首先获得了一个来自健康供者的胚胎 干细胞系这个细胞系平均每5-7天分裂一次 在持续增殖70代之后仍然保持其不分化的特 性而将这个细胞注射给免疫缺陷小鼠12周后 发现在小鼠体内形成了畸胎瘤包含有神经上 皮骨组织软骨组织以及腺上皮说明这个胚 胎干细胞系具有向所有细胞分化的潜能 胚胎干细胞的来源 ? 从早期胚胎的获得inner cell mass ICM 发育良好的囊胚从中分离内细胞群细胞ES细胞 ? 原始生殖细胞中获得primordial germ cell PGC 从妊娠5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的 EG 细胞embryonic germ cells ? 畸胎瘤细胞 embryonic carcinoma cell EC ? 生殖克隆治疗性克隆 体细胞核转移 somatic cell nuclear transfer SCNT 去核卵细胞 体细胞核 克隆 囊胚 分离内细胞群 ES细胞 ES 细胞的鉴定 利用胚胎干细胞的特点 ? 细胞的形态结构 ? 核型分析 ? 碱性磷酸酶AKP 染色 ? SSEA-1 免疫荧光标记 ? OCT活性检测 ? 分化能力检测 体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成试验 核移植试验 更令人难以置信的是在随后的论文中 他们宣布获得了11个来自患者的胚胎干细胞 系这些患者分别患有脊索损伤糖尿病和 先天性低丙球蛋白血症等疾病全世界都为 之震惊 2005年5月19 日黄禹锡的实验室宣布成功克隆出 世界上首批与病人基因相符的胚胎干细胞系这 一成果被视为人类胚胎干细胞研究的重大突破 ?美科学家成功利用患者自身细胞再造 膀胱组织组织工程 三要素 过去10年来研究人员开始完善类似支架的细胞培育 平台用于控制人体内的细胞再生和细胞分裂此外再 生医疗领域有关干细胞的研究也取得了巨大进展干细 胞可以发育成人体的所有其它组织 在研究过程中波士顿儿童医院的研究人员利用了一 个更加成熟的细胞也就是所谓的祖细胞第一次实施 手术时他们摘除了患者体内一多半组成膀胱的病变组 织随后提取肌肉组织和膀胱壁细胞将它们放置在膀胱 形状的胶原质的支架内经过实验室内的7周繁殖 细胞数量由开始时的几万个最终达到15亿个左右研究 人员通过手术将这个装有细胞的模子植回患者的原始器 官与剩余的功能完好的膀胱组织结合实验室培育的细 胞将继续发育直至成熟 第八章 核移植技术与动物克隆 Nuclear transfer ,Animal Cloning Technology ? What 技术原理 ? How 技术方法 ? Why 技术应用 核移植技术与动物克隆 原理和方法 将受体卵细胞 去核 移植后的细胞激活 后可以象受精卵一 样发育形成动物个 体并具有与核供 体细 胞相同的基因 向去核卵细胞植入 供体细胞 的细胞核 ? 核移植 第二代试管婴儿 ? 卵母细胞胞浆内单精子注射 Intracytoplasmic sperm injection ICSI ? 核移植 第四代试管婴儿 ? 借助别人卵浆增强自己卵子活力 ? 特征卵浆置换 ? 主要针对那些卵子质量不高活力差的高龄女性 应 用 A 生产实践结合干细胞工程胚胎工程 ? 制备转基因动物用于药物生产 ? 优良畜种的培育和扩大繁殖 ? 开展异种动物克隆拯救濒危动物 ? 治疗性克隆研究 B 理论研究核质关系问题 细胞拆合与重组概述 细胞拆合与重组概述 1细胞拆合技术的发展概况 – 20世纪70年代初诞生 – 1952年Briggs 和King首创了核移植的方法 – 1967年Careter发现细胞松驰素B能诱发体外培养的小 鼠成纤维细胞的排核作用 – 1972年Prescott等首先应用离心结合CB分离哺乳类细 胞的胞质体获得成功 – 细胞核质分离技术与细胞融合技术汇合起来建立 了细胞重组技术 2细胞拆合与重组的概念 2细胞拆合与重组的概念 1细胞拆合 – 把完整细胞的细胞质和细胞核用特殊 – 的方法分离开来或把细胞核从细胞质 中吸取出来或用紫外线等把细胞中的 核杀死然后再把同种或异种的细胞核 和细胞质重新组织起来培育新的细胞 或新的生物个体 2细胞重组 2细胞重组 cell reconstruction cell reconstruction 将细胞融合技术与细胞核质分离技 术结合即在融合介子的诱导下使 胞质体与完整细胞合并 或胞质体 与核体重新组成构成细胞的过程 3细胞拆合的方法 3细胞拆合的方法 1物理拆合法 – 用紫外线或激光将核破坏再用微玻璃针或 微吸管将其他细胞核注入最早使用 – 将细胞融合技术与显微外科手术结合作微 吸管将细胞核连同周围少量细胞质吸出再注 入已去核的细胞中 显微操作法进行细胞核移植 2化学拆合法 2化学拆合法 细胞松驰素Cytochalasin B 结合高速离心 CB阻断细胞质分裂不干扰核分裂引起细胞表 面形状的改变和排出细胞核 机理CB是真菌的一种代谢产物可以切断微丝并结合在微丝 末端阻抑肌动蛋白聚合但对解聚没有明显影响因而可以破坏微 丝的三维网络 第五章 核移植技术与动物克隆 一核移植 核移植供体 核移植受体 核移植方法 激活培养与胚胎移植 二动物克隆 基本方法 克隆羊多莉的培育 三现状与前景 一 核移植技术 1核移植供体 ? 胚胎胎儿细胞胚胎细胞核移植 胚胎卵裂球干细胞和胎儿成纤维细胞等 ? 体细胞体细胞核移植 ? 完整的二倍体含供体动物的完整基因组 ? 在受体细胞质环境中完成分化过程的倒转重编程 reprogram 能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全 过程 如何获取供体细胞核 ? 紫外照射结合显微操作 ? 细胞松弛素结合高速离心 核体 胞质体 2核移植受体细胞 受体细胞的种类卵母细胞受精卵2-细胞胚胎 其中卵母细胞最为普遍作为核移植受体的处于第二次 减数分裂中期MII 的卵母细胞可以经超排卵或体外 成熟培养的卵巢细胞得到 ? 去核卵母细胞 收集方法处于减数分裂的期 ? 细胞体积较大 ? 决定细胞向某一方向分化的初始信息储存于卵细胞中 如何给受体细胞去核 ? 显微操作 ? 细胞松弛素结合高速离心 3核移植的方法 ? 去核卵细胞胞浆内显微注射 ? 核体透明带下注射再刺激核体与胞质体融合 4移植后重组细胞的激活 培养胚胎移植 ? 激活 使卵母细胞从M II 期解放转到受精状态 ? 重组胚的体内或体外培养 ? 胚胎移植 ? 核移植成功的重要前提 尽量保证核供体和受体细胞处于同样的细胞周期 同步状态 Cell cycle co-ordination in embryo cloning by nuclear transfer 如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体 处于同步状态 第五章 核移植技术与动物克隆 一核移植 核移植供体 核移植受体 核移植方法 激活培养与胚胎移植 二动物克隆 基本方法 克隆羊多莉的培育 三现状与前景 动物克隆发展简史略 动物克隆发展简史略 爪 爪 蟾 蟾 的 的 核 核 移 移 植 植 实 1958年 实 年 John Gurdon和Machineer John Gurdon和Machineer 验 验 注意爪蟾肠上皮细胞核仍保持全能性 注意爪蟾肠上皮细胞核仍保持全能性 问题 除了核移植外还有其它克隆动物的方法吗 1哺乳动物克隆的基本方法 利用胚胎分割或卵裂球分离技术从2个细胞至 胚胎的的早期胚胎产生两个或两个以上的个 体 通过细胞核移植构建新的重构胚或重建胚 2克隆羊 多莉的培育 问题 ? 3个母亲克隆出多莉3只公羊能克隆出一 只小公羊来吗 ? 多莉100,是白面绵羊的复制品吗 ? 如何做到100,复制自己雌性雄性 问题 体细胞核移植时 如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体 处于同步状态 核全能性的恢复重编程 血清饥饿法 实验成功的关键血清饥饿 实验成功的关键血清饥饿 使细胞核和去核卵细胞处于细胞周期中相匹 使细胞核和去核卵细胞处于细胞周期中相匹 配的阶段 配的阶段 使结合在基因DNA上的调控蛋白脱落下来 使结合在基因DNA上的调控蛋白脱落下来 重新编程reprogram remodel 重新编程reprogram remodel ? Three categories of cells in vivo ? Cycling cells Dividing continuouslyStem cells ? G0 cells Do not divide normally but divide when given an appropriate stimulus liver cells lymphocytes ?Terminally Differentiated cells Highly specialized have lost the ability to divide until they die muscle cells red blood cells nerve cells 试验结果 试验结果 424只成体绵羊细胞核移植 424只成体绵羊细胞核移植 277个融合细胞638 277个融合细胞638 移入母羊输卵管成功247个892 移入母羊输卵管成功247个892 发育到桑椹期的胚胎29枚 117 发育到桑椹期的胚胎29枚 117 植入13只母羊子宫后 植入13只母羊子宫后 1头羊怀胎产出 1头羊怀胎产出 总成功率023 总成功率023 一头全白的小羊羔依偎在生下它但与它毫无血缘关系的代育母亲一头苏格 兰黑脸羊旁边这张著名的照片向世人显示生物技术的新时代来临了 多莉 多莉 羊之 羊之 父 父 威尔 威尔 穆特 穆特 多利羊Dolly 风暴 多利羊Dolly 风暴 1997(2 (27 1997(2 (27 Nature 385 810 ,813 Nature 385 810 ,813 英国爱丁堡罗斯林研究所 英国爱丁堡罗斯林研究所 伊恩 威尔穆特小组 伊恩 威尔穆特小组 多利羊 多利羊 1996 7 出生 1996 7 出生 1996 11 收到文章 1996 11 收到文章 1997 2 文章发表 1997 2 文章发表 多莉羊成为明星 多莉羊成为明星 多莉和它的三个孩子 多莉和它的三个孩子 问题 多莉是第一只克隆成功的动物吗 为什么她的诞生会引起轰动 第一只体细胞克隆成功的哺乳动物 对传统理论的挑战 对传统理论的挑战 对于动物来说随着分化的演进细胞逐渐丧失其 分化能力 全能性 多能性 单能性 分化 成熟的体细胞 一条科学成就的宣布在全世界范围 一条科学成就的宣布在全世界范围 内短短几十天左右时间从学术界到经 内短短几十天左右时间从学术界到经 济界政界引起巨大而深刻的反响是空 济界政界引起巨大而深刻的反响是空 前的 前的 克隆一词也顿时变得妇孺皆知 克隆一词也顿时变得妇孺皆知 多莉在全世界引起的巨大反响 多莉在全世界引起的巨大反响 一方面学术界高度评价 一方面学术界高度评价 1997 3 2 美国华盛顿邮报 1997 3 2 美国华盛顿邮报 奥勒冈州沃尔小组成功克隆两只恒 奥勒冈州沃尔小组成功克隆两只恒 河猴96 8出生 河猴96 8出生 1997 3 5台湾地区吴明杰小组5只 1997 3 5台湾地区吴明杰小组5只 克隆猪 克隆猪 沃尔 沃尔 小组 小组 成功 成功 克隆 克隆 两只 两只 恒河 恒河 猴 猴 吴明杰小组5只克隆猪 吴明杰小组5只克隆猪 在 在 日 日 本 本 克 克 隆 隆 成 成 功 功 的 的 牛 牛 多莉在全世界引起的巨大反响 多莉在全世界引起的巨大反响 另一方面人们马上意识到克隆人的威胁 另一方面人们马上意识到克隆人的威胁 政界纷纷出来表态 政界纷纷出来表态 com 美克林顿总统宣布禁止 com 美克林顿总统宣布禁止 联邦政府资助人体克隆实验 联邦政府资助人体克隆实验 com 意卫生部长在众议院宣 com 意卫生部长在众议院宣 布禁止人体和动物克隆 布禁止人体和动物克隆 1998年 1998年,月美国一位名叫理查德?锡德的科学家率先提出他将 进行克隆人试验目的是为患不育症的夫妇繁衍后代此言一出举世 震惊 1998年初提出要克隆人的美国医生锡德Richard Seed 折腾了几 年也不知是手艺不到家还是没钱 还是根本就只是举起刀叉装装样子没打算真把螃蟹 吃下肚又或者是被各路高人骂怕了总之一直不见 他动真格的 子 疯 三 隆 克 人 狂 三 学 科 2001年8月7 日美国科学院关于克隆人问题的讨论会上三位表示要克隆人的科学家 左意大利国际联合研究所International Associated Research Institute所长 Severino Antinori 中克隆援助Clonaid公司老板Brigitte Boisselier 右美国肯塔基大学教授Panayiotis Michael Zavos 他们克隆人的目的都是为了给不孕的夫妇培育后代 雷尔教派克隆婴儿的妇女 雷尔教派克隆婴儿的妇女 2001年 2002年 问题三 多莉 克隆成功即哺乳动物体细胞 克隆成功说明了什么 核的全能性 A 理论意义 A 理论意义 a 证实分化成熟的动物细胞核仍具全能性 b 证实细胞质对胚胎发育分化的决定性 看来分化的关键在于细胞 看来分化的关键在于细胞 质细胞质中有着决定细胞分化全 质细胞质中有着决定细胞分化全 能性的物质称为分化决定子 能性的物质称为分化决定子 细胞质中的分化决定子 细胞质中的分化决定子 后来实验证明细胞质中的分化决定 后来实验证明细胞质中的分化决定 子是 RNA它们对紫外线敏感对 子是 RNA它们对紫外线敏感对 RNase 敏感 RNase 敏感 在卵子形成过程中卵母细胞中含有 2 在卵子形成过程中卵母细胞中含有 2 ,5 万种 mRNA每种约 600个拷贝这 ,5 万种 mRNA每种约 600个拷贝这 些 RNA 构成母体信息决定受精卵的发 些 RNA 构成母体信息决定受精卵的发 育潜能 育潜能 信息体 信息体 informasome informasome 在卵子中母体信息以核糖核酸 在卵子中母体信息以核糖核酸 蛋白RNP颗粒形式存在其沉降 蛋白RNP颗粒形式存在其沉降 系数比核糖体还大称为信息体 系数比核糖体还大称为信息体 B 实践意义 B 实践意义 a 为实验室研究和动物的药物实验提供遗传上完 a 为实验室研究和动物的药物实验提供遗传上完 全一致的实验动物 全一致的实验动物 b 控制动物的性别 b 控制动物的性别 c 拯救濒危动物 c 拯救濒危动物 d 提高转基因动物的效率 d 提高转基因动物的效率 e 使经遗传改造的猪为人类提供移植器官 e 使经遗传改造的猪为人类提供移植器官 f 生产基因工程药物和基因疫苗 f 生产基因工程药物和基因疫苗 g 如蛋白质,多肽类药物 胰岛素凝血子 g 如蛋白质,多肽类药物 胰岛素凝血子 干扰素生长因子 2000年产达到185亿美元 干扰素生长因子 2000年产达到185亿美元 2003年2月15 日早晨的罗斯林研究所 2003年2月15 日早晨的罗斯林研究所 第五章 核移植技术与动物克隆 一核移植 核移植供体 核移植受体 核移植方法 激活培养与胚胎移植 二动物克隆 基本方法 克隆羊多莉的培育 三现状与前景 克隆人的技术路线与步骤 克隆人的技术路线与步骤 目前已经克隆出的动物 动物克隆技术存在的问题 1营养过多发育过快克隆动物一般都 有发育过快的问题体外培养的时间过长 或培养液的成分可能与克隆动物的流产以 及出生后不久死亡有关 2线粒体问题 目前还不知道原本就存在于卵子里的 线粒体到底在多大程度上与个体的性质有 关细胞核的遗传基因与线粒体的遗传基 因相互影响的问题必须引起重视 3核的重新编程不完整染色体倍数不正 确性别等都可能对克隆动物的质量产生影 响因为目前所得到的体细胞克隆动物大多 为雌性因此性别可能对体细胞克隆的成功 率一定的影响 端粒问题争论颇多 动物克隆技术存在的其他问题 体细胞克隆后代有可能出现老化现象 动物克隆的理论研究跟不上技术发展的步伐 总体成功率处于1-5的较低水平 克隆技术研究本身需要与其他学科和技术进 行更为广泛的渗透与融合 克隆产生的后代基因组成单一失去对复 杂环境变化的适应潜力 生殖性克隆 将核转移后激活的卵细胞植入到生殖道中可以发育为一 个新的个体并与核供体具有相同的基因型如图示 母体 子代和 母代完 全相似 卵细胞 发育成个体 去核 提供细胞核 去 激活卵细胞 核 植入生殖道 治疗性克隆原理 胚胎干细胞具有全能性可以分化形成多种组织从而替代人体坏损组织通 过核移植技术得到的胚胎干细胞不仅可以避免使用人类胚胎的伦理问题还能使用 病人的细胞核获得组织配型相似胚胎干细胞避免了移植细胞和组织的免疫排斥 电视短片克隆人猜想 作 业 以多莉羊的培育为例简述克隆动物制备 的基本过程及其原理 参考文献