井冈霉素生产工艺优化研究

井冈霉素生产工艺优化研究 山东雇药信息 井冈誊泰生产z艺优化研究 1前言 井冈霉素是农用抗生素,对水稻紫纹枯病有保 护和治疗作用,对水稻紫病,小粒菌核病有兼治作 用;还可用于防治小麦纹枯病和棉花,蔬菜,豆类,人 参,柑桔苗木的立枯病等.它是通过微生物发酵生 产的一种多元混合物,其有效成分为井冈霉素A. 是至今为止中国最廉价且使用面积最广的一种农用 抗生素,是农民非常信赖的产品之一.笔者通过多 年的生产实践经验总结,提出从菌种选育,发酵罐培 养基配方,发酵过程染菌等三个方面进行技术优化, 降低了成本,经济效益大幅度提高. 2实验 2.1设备与试剂 98#菌株,天门冬酰氨素,大米淀粉(60目以 下),山芋粉(80目以下),葡萄糖,黄豆饼粉(80目以 下),花生饼粉(80目以下),肉粉(80目以下),棉子 饼粉(80目以下),酵母粉(工业试剂),NaCI(工业 级),KH2PO4(工业品),消泡剂(工业级),MgSO4 (工业级),HZQ—R振荡器,种子罐(容积200L),中 试发酵罐(容积2300L),工业发酵罐(容积 50000L),生物显微镜,721分光光度计,C采用费林 法,N采用甲醛法,效价采用比色法,pH试纸. 2.2菌种选育 ?菌悬浮液制备:将菌株置于天门冬素葡萄糖 琼胆斜面上,在37?时培养3d挑菌筛选,将挑选好 的菌株镊人生理盐水(0.9%)中用玻璃棒倒烂制成 菌悬浮液. ?悬浮液用生理盐水稀释成不同倍数(每次稀 释10倍,即稀释成10倍液再稀释10倍,循环几 次),一般稀释浓度10,10倍即可以.每次释释 后,取数滴于培养皿中的培养基(天冬索葡萄糖琼 脂)上,用无菌推棒涂抹,置于温箱中37?培养3d; 在锥形瓶内装入一定数量液体培养基,灭菌后用无 菌操作接入孢子,放人摇床中恒温培养. 2.3培养基配方优化 以大米淀粉为主碳源选择适当的氮源,观察葡 萄糖对发酵的影响,并同时考察二种种子培养基对 发酵的影响,采用正交作试验,各组培养基按l配 制: 种子罐配方C1:大米粉(3%),花生饼粉(2'j6), 囡 酵母粉(0.5%). 种子罐配方C2:黄豆饼粉(2.2%),葡萄糖 (3%),肉粉(1%). 发酵培养基公共成分:MgSO4(0.05%), KH2PO4(0.05%),NaCl(0.6%),消泡剂(O.03%). 表l培养基配方 Table1Themediumformula 种子罐发酵罐配方 配方肉粉酵母粉花生饼粉黄豆饼粉葡萄糖淀粉 1Ci00.71107 2Ci00.72229 3Ci11.51209 4CJl1.52l2,7 500.72109 600.71227 711.52209 811.51127 2.4发酵过程染菌控制 2.4.1种子带菌 种子带菌主要发生在种子制备时,对砂土管及 孢瓶需严加控制,如砂土管末遭污染,则在一艘隋况 下,只要注意接种培养的无菌操作,对种子室加强无 菌管理,保证无菌室的卫生要求. 2.4.2培养基带菌 培养基灭菌不彻底是常见的染菌原因,培养基 灭菌前,杂菌种类多,数量大,灭菌时,蒸汽压力不 足,就达不到灭菌温度;蒸汽量不足,也不能彻底杀 灭杂菌;温度,压力都够,而灭菌时间不足,同样杀不 灭培养基中的杂菌.此外,灭菌时,培养基如产生大 量泡沫或发酵罐内有污垢堆积,设备制作安装不合 理,灭菌时蒸汽走短路,也会使培养基灭菌不彻底. 根据实践表明,最佳灭菌温度大于120?,灭菌时间 大于30rain. 2.4.3发酵设备及其附件防渗漏 井冈霉素生产为机械搅拌通风发酵型式,采用 间歇灭菌,发酵设备及其附件,虽不太容易损坏,但 由于化学腐蚀,设备与物料接触而产生的磨蚀等原 因,发酵设备及其附件产生渗漏而引起染菌,故在每 次发酵上罐前要严格检查,发现问题及时处理. 3结果与讨论 31菌种对发酵效价的影响 囫 98#菌株在天冬素一葡萄糖琼脂上的生长情况 和平板上自然分离的形态基本相同,但大部分菌落 在菌落中心和外圈不吸水,而在中间有一圈吸水,呈 山东欢药信息 黑色.在几种常用培养基上的培养特征和原始菌种 比较(如表2),选择98#菌株发酵效价高且稳定. 表2不同菌株培养的特性比较 Table2Thedifferentcharacteristicsofthestrain 3.2培养基配方对发酵效价的影响 发酵用培养基的选择由多种条件所决定,最终 取决于培养基的经济效果,因此不仅要考虑发酵单 位高,而且还要考虑粮耗低,原料易得,成本低,加工 方便等;不仅要考虑所处地区特产的利用.而且也要 对其它地区的原料特点进行研究,被试验的发酵培 养基有机氮源和碳源有以下几种(营养基配方及效 价见表3): F1:大米粉(7%),花生饼粉(1%),黄豆饼粉 (1%),酵母粉(1%),肉粉(1%),MgS04(0.10%), NaCI(0,6%),KH2po4(0,05%),泡敌(0.03%),调 节pH=7.0,7.5. F':大米粉(9%),花生饼粉(2%),黄豆饼粉 (2%),酵母粉(05%),MgS04(0.10%),NaCI(0. 6%),KH2PO4(0.05%),泡敌(0,03%),调节pH= 7.0,7.5. F3:大米粉(9%),花生饼粉(2%),黄豆饼粉 (2%),肉粉(0.5%),MgSO4(0,10%),NaCI(0. 6%),KH2PO4(0.05%),泡敌(0.03%),调节pH= 7,0,7,5. F4:大米粉(9%),花生饼粉(3%),酵母粉(1%),肉 粉(1%),(0.10%),NaCI(0.6%),Kt-t21~4(0. 05%),泡敌(0.03%),调节pH=7.0-7.5. 表3营养基配方表 Table3Themedium[ormuia 从表中结果可见种子罐培养基不同对发酵罐中 井冈霉素的效价没有明显影响.在发酵培养基中含 有Mg,~4时可选用种子罐培养基cl,c1培养基在 生长过程中泡沫较低,不会产生闷罐现象,生长时间 亦较C2培养基短,但对发酵单位都没有明显影响. 3.3不同的污染时期对发酵的影响 ?发酵前期染菌:菌丝还处于繁殖,生长阶段, 染了菌,杂菌在培养液中快速繁殖,生长,并与本菌 争夺养料和共处溶解氧,严重地干扰井冈霉素菌的 繁殖,生长和分泌.这时.轻微的,可采用调节pH, 改变通风量,降低发酵温度等予以补救;严重 的,要重新消毒. ?发酵中期染菌:严重地干扰井冈菌的代谢, 杂菌大量产酸,培养液的pH下降,菌丝自溶,糠,氮 消耗快,发酵液发粘,产物分泌减少或停滞,有时会 使已产生的产物失活破坏.若染了菌,可视代谢变 化情况,采用调节pH,适当提高罐温,增大通风量等 措施,坚持发酵终结;若情况十分严重,糖的指标还 较高,也要重新消毒. 菌量不多,对生产影响不 ?发酵后期染菌:杂 大;染菌量多,则可采取提前放罐的措施. 4结论 试验结果表明,通过菌种选育,发酵培养基的优 化和发酵染菌原因,优化前后发酵罐批,染菌率 降低了近l0个百分点(见表4). 表4优化前后对照表 Table4Theoptimiz2~tionresult 发酵平均效价优化后为24350t~g/mL,优化前 平均效价为20680tag/mL左右,一年中增收约300 万元人民币.