定痫丸对青霉素致痫大鼠脑组织环核苷酸（cAMP、cGMP）影响

定痫丸对青霉素致痫大鼠脑组织环核苷酸（cAMP、cGMP）影响 定痫丸对青霉素致痫大鼠脑组织环核苷酸 (cAMP、cGMP)影响 ? 1344?安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2011Nov;15(11) 定痫丸对青霉素致痫大鼠脑组织环核苷酸(cAMP,cGMP)影响 周胜利,龙子江,蔡永亮,陈明,阮诗兰,金鹤,陆辉,陈梅林 (1.安徽省合肥市第二人民医院;2.安徽中医学院;3.安徽省中医院,安徽合肥 230000) 摘要:目的观察探讨定痫丸治疗癫痫的作用及作用机制. 方法各组大鼠按不同剂量灌胃给药7d后,采用腹腔注射 青霉素制备癫痫急性模型,青霉素注射剂量为600万u? kg,,分别测定各组大鼠脑组织中环核苷酸(cAMP,cGMP)的 含量,并进行各组大鼠脑电波观察.结果定痫丸能明显减 轻青霉素的致痫作用,减少模型大鼠癫痫发作的频率,显着升 高模型大鼠脑组织中SOD活性,降低MDA含量,显着升高脑 组织中cAMP含量,降低cGMP含量.结论定痫丸抗癫痫 作用机制与其抑制自由基引起的脂质过氧化反应,增加自由 基的清除,调节脑内cAMP,cGMP含量变化有关. 关键词:定痫丸;大鼠急性癫痫发作;神经递质 环核苷酸(cAMP,cGMP)在脑组织中含量丰富,被称为 "第二信使",参与许多神经疾病的病理生理机制,体内 cAMP,cGMP保持一定比例,得以维持中枢神经系统正常放 电过程,而适当比例发生改变时出现异常兴奋或抑制,结果 出现异常放电.定痫丸为古代名方,其组成严谨,配伍精 当,受到国内外专家学者的高度重视.定痫丸方出《医学心 悟》,有天麻,川贝,胆南星,姜半夏,陈皮,茯苓,茯神,丹参,麦 冬,菖蒲,远志,全蝎,僵蚕,琥珀,辰砂,姜汁,竹沥,甘草等中 药组成,具有豁痰宣窍,熄风定痫的作用.临床用定痫丸治疗 癫痫效果明显,为进一步研究其抗癫痫的作用机制,本研究选 用青霉素致痫大鼠模型,观察定痫丸对青霉素致痫大鼠海马 内cAMP,cGMP含量的影响. 1实验 1.1实验动物Wistar大鼠,雌雄各半,体重在180,220g 之间,由安徽医科大学动物中心提供,许可证:SCXK(皖) 2009—0031. 1.2药物与试剂定痫丸:江苏省中医院提供,批号:090921 (定痫丸制剂所需草药由合肥济生源药业饮片有限公司提 供);地西泮:上海信宜制药厂提供;批号:071001;青霉素:哈 药集团制药总厂提供,批号:A090600512;生理盐水:河北天成 药业有限公司提供,批号:08122808;水合氯醛:国药集团化学 试剂有限公司生产,批号:T20090331;MDA试剂盒,SOD试 剂盒:由南京建成生物研究所提供,批号:20100517; cAMP,cGMP试剂盒:由上海西唐生物有限公司提供,批号: 20100601. 1.3实验仪器754紫外一可见分光光度计:上海精密科学仪 器有限公司生产;电子太平:上海天平仪器厂;AnkeTDL一5台 式离心机:上海安亭科学仪器厂生产;电热恒温干燥箱:上海 三星电热仪器厂生产;Biopac生理系统:SantaBarbara Califrnia提供. 基金项目:2009年度合肥市中医专项资助科研项目 通讯作者:龙子江,男,教授,硕士生导师,研究方向:药理学,E—mail lzjyls@163.con 2实验方法及指标检测 2.1动物筛选,分组,给药及造模取健康Wistar大鼠6O 只,随机分成6组,雌雄各半:正常组,模型组,定痫丸低剂量 组(1.8mg?kg..),定痫丸中剂量组(3.6mg?kg),定痫丸 高剂量组(7.2mg?kg),阳性对照组(地西泮片4mg? ). 各药物组大鼠按照上述剂量连续给药7d,正常组和模型 组大鼠给予等容量的蒸馏水,末次药后用3.5%的水合氯醛 按1ml/lO0g体重腹腔注射麻醉大鼠后固定在立体定位仪 上,沿中线切开头皮并将肌肉等组织向两侧剥离后暴露出颅 骨,清理干净颅骨表面,待干燥后确定电极植入点,接Biopac 生理记录系统,腹腔注射青霉素600万U?kg致痫,观察脑 电波变化J. 2.2取材待大鼠癫痫发作完毕后处死.开胸,暴露心脏, 直视下将穿刺针经左心室刺入,并以止血钳固定,然后剪开右 心耳,随即用4?预冷的生理盐水250ml快速灌注,再灌注含 40g?L多聚甲醛的0.1mol?L..磷酸盐缓冲液500ml. 先灌注再改为滴注,调节滴速,先快后慢,滴注时间为1h,观 察大鼠全身僵硬后,迅速开颅取出完整大脑,去除脑干及小脑 部分,将修整后的脑组织块沿止状线切成两半.右侧大脑制 成10%匀浆液,离心,取上清液一20?保存,用于检测MDA, SOD,cAMP及cGMP的含量. 2.3丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)测定将已制 备好的脑组织匀浆上清液,用754紫外分光光度计于(532, 550nm),按说明操作,分别测脑组织匀浆中MDA和SOD 值. 2.4环核苷酸(cAMP,cGMP)测定将已制备好的脑组织 匀浆上清液,按说明书操作,用EIJAsA法测定. 3统计学处理 实验数据的统计,采用SPSS12.0软件处理系统.计量资 料采用单因素方差分析,用-I-S表示. 4实验结果 4.1对大鼠脑组织中MDA,SOD的影响模型组与正常组 对比,大鼠脑组织中MDA的含量显着升高(P<0.05),而 SOD含量显着下降,与正常组比较,有显着性差异(P< 0.O1),说明模型复制成功;定痫丸各剂量组与模型组对比,能 降低大鼠血清中MDA的含量,升高大鼠血清中SOD的含量, 中剂量组,高剂量组效果明显,与模型对照组比较有显着性差 异(P<0.05或P<0.01).结果见表1. 4.2对大鼠海马组织中cAMP,cGMP含量的影响模型组 与正常对照组比,cAMP,cGMP含量明显增加,cAMP/cGMP 比值明显减小,差异均具有显着性意义(P<0.05或P< 0.01),定痫丸各剂量组与模型组比,cAMP含量明显增加, cGMP含量则明显减少,eAMP/eGMP比值明显增加,差异均 具有显着性意义(P<0.01).结果见表2. 安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2011Nov;15(11)?1345? 表1定痫丸对青霉素致痫大鼠脑组织 MDA,SOD含量的影响(?s,n=10) 注:与正常组比较,P<0.05,P<0.01;与模型组比较,'P< 0.05.P<0.01 5讨论 癫痫(epilepsy,EP)是一种慢性,反复性,突然发作的大 脑功能失调性疾病,发作时伴有局部病灶脑神经元的异常高 频放电,并向周围扩散,严重危害人类健康.其发病认为与遗 传,颅脑外伤J,脑卒中H等多种诱因有关,其发病机制也一 直是国内外研究的焦点. 祖国医学认为癫痫的病因病机复杂,病症表现各异,治疗 ,治疗则 方法也不尽相同.如肝火亢盛,肝气横逆,风阳上涌 以熄风止痉为重点;如痰瘀痰闭,闭阻清窍脉络,治疗则主 张祛痰通络,化痰息风;如因外伤及炎症,损伤部位瘀血及 表2定病丸对青霉素致痫大鼠海马组织中cAMP,cGMP的影响(?S,n=10) 注:模型组与正常组比较,P<0.05,P<0.01;各药物组与模型组比较,一P<0.0l 炎性渗出所致癫痫发作,则可运用活血化瘀药促进癫痫病灶 的转化. 定痫丸方出《医学心悟》,方中法夏,云苓,川I贝,胆南星, 竹沥清热化痰;天麻,全蝎,僵蚕熄风止痉;朱砂,琥珀,茯神, 远志,灯芯草,麦冬镇惊,安神,清心;石菖蒲,丹参,陈皮开窍, 行血气.符合中医对癫痫病机的认识,临床治疗癫痫已取得 较好的效果.因此,进一步从现代医学角度探讨其作用机制, 具有一定的理论和临床应用价值. 本实验采用腹腔注射青霉素600万U?kg"制备实验性 癫痫模型.青霉素为GABA受体阻断剂,它与GABA受体结 合,阻断了与受体偶联的氯离子通道,从而阻断了GABA引起 的突触后抑制,导致了中枢神经元的异常兴奋,诱发了癫痫的 发作j.在癫痫中,氧自由基可通过其脂质过氧化产物直接 损伤神经细胞,导致细胞膜构型,结构和细胞膜对离子通透性 的改变.超氧化物岐化酶(SOD)是机体内抗氧化作用主要的 酶之一,很多研究都证实癫痫状态下SOD活力下降'J.当 SOD活性降低,清除氧自由基的能力减弱,因此导致丙二醛 (MDA)含量明显升高,组织发生脂质过氧化,氧化与抗氧化 平衡失调,从而导致脑组织氧化应激反应,造成脑组织损 伤.环核苷酸(cAMP,cGMP)是中枢神经系统细胞的"第 二信使",对中枢神经系统活动起重要调节作用.体内 cAMP,cGMP保持一定比例,可使中枢神经元维持正常放电过 程.如果其比值发生改变,中枢神经则会出现异常兴奋,发生 异常放电,诱发癫痫的发作. 本实验研究表明定痫丸可有效升高脑组织SOD的活性, 降低MDA的含量,因此可认为其抗癫痫的机制可能与抑制自 由基引起的脂质过氧化反应,增加自由基的清除等有关.实 验结果还显示:定痫丸各剂量组能够使癫痫大鼠脑内cAMP 含量进一步增加,而cGMP含量明显下降,表明其对癫痫大鼠 脑内cAMP,cGMP含量有一定的调节作用.但关于定痫丸多 靶点的作用机制,还有待于进一步深入研究. 参考文献: [1]解学孔.癫痫病学[M].北京:人民卫生出版社,1995:92—3. [2]宋立群,肖洪彬,宋淑娟,等.安痫宁冲剂对青霉素诱导的大鼠 癫痫模型影响的实验研究[J].中国中医药科技,2002,9(3): 151—2. [3]张道兵.颅脑外伤与继发性癫痫关系的临床观察及药物治疗 [J].安徽医药,2010,14(2):198—9. [4]姚正鹏,袁良津,唐向阳.脑卒中后癫痫118例的I临床分析[J]. 安徽医药,2010,14(10):1167—8. [5]罗来培.虫类药治疗小儿癫痫的临床体会[J].中国中医药杂 志,2004,2(1):27—8. [6]蒋丽霞,罗学裕.涤痰祛瘀法治疗症状性癫痫78例[J].湖南中 医杂志,2002,l8(3):36. [7]陈继婷,陈慈煦.涤痰活血治疗癫痫经验[J].中医杂志,2002, 43(2):96. [8]徐叔云.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社, 2002:866. [9]EunJP,ChoiHY,KwakYG.Proteomicanalysisofhumancerebral cortexinepilepticpatients[J].ExpMolMed,2004,36(2):185— 91. [10]MiyataR,HayashiM,TanumaN.Oxidativestressinneurodegenera— tionindentatorubral-pallidoluysianatrophy[J].NeurolSci,2008, 264(1—2):133—9. [11]陈晓刚,李文玲,赵文清,等.SOD,MDA在猫运动区癫痫模型中 的作用[J].立体定向和功能性神经外科杂志,2009,22(3):145 — 7. (收稿日期:2011一O1一o4)