肝X受体β促进大脑背侧皮质内放射状胶质细胞向少突胶质细胞分化的作用研究(可编辑)

肝X受体β促进大脑背侧皮质内放射状胶质细胞向少突胶质细胞分化的作用研究(可编辑) 肝X受体β促进大脑背侧皮质内放射状胶质细胞向少 突胶质细胞分化的作用研究 分类号 Q13 密 级 公 开学 号 2002010019 学校代码 90031 硕士学位论文 肝 X 受体β促进大脑背侧皮质内放射状胶质细胞向少 突胶质细胞分化的作用研究 徐 培 范晓棠 教 授 指导教师 徐海伟 教 授 导师组成员 培养单位 第三军医大学基础部组胚教研室 申请学位类别 硕士学术学位 专业名称 发育生物学 论文提交日期 2013 年 5月 论文答辩日期 2013 年 5月 答辩委员会主席 武胜昔 评 阅 人 徐志卿,徐兴顺二 ?一三年五月? 本课题受国家自然科学基金项目No. 31070927 资助目 录 缩略语..1 英文摘要..3 中文摘要..7 论文正文 肝 X 受体β促进大脑背侧皮质内放射状胶质细胞向少突胶质细 胞 分化的作用研究..10 第一章 前言.10 1.1 选题缘由..10 1.2 研究背景..10 1.3 研究意义.13 1.4 研究内容.13 1.5 研究..13 第二章 肝 X 受体 β 对成年小鼠 CNS 髓鞘形成的影响..15 2.1 材料和方法.15 2.2 结 果.24 2.3 讨 论.32 2.4 小 结.34 第三章 LXR β 调控小鼠大脑中放射状胶质细胞向少突胶质细胞分化..35 3.1 材料和方法.35 3.2 结 果.37 3.3 讨 论.47 3.4 小 结.49 第四章 TO901317 对酒精致新生小鼠髓鞘损伤的保护作用50 4.1 材料和方法.51 4.2 结 果.52 4.3 讨 论.56 4.4 小 结.58 全文总结.59 参考文献.61文献综述 New roles of LXR β in the central nervous system.69 Reference.76 攻读硕士期间发表文章83 致 谢84 第三军医大学硕士学位论文 缩略语表 英文缩写 英文全称 中文全称 AP Ammonium persulfate 过硫酸铵 AST Astrocyte 星形胶质细胞 BLBP Brain lipid binding protein 脑脂质结合蛋白 BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白 CC Corpus callosum 胼胝体 CNS Central nervous system 中枢神经系统 EAE Experimental autoimmune 实验变态反应性脑脊髓炎 encephalomyelitis FAS Fetal alcohol syndrome 胎儿酒精综合症 GFAP Glial fibrillary acidic protein 胶原纤维酸性蛋白 IF Immunofluorescence 免疫荧光 IHC Immunohistochemical 免疫组织化学 KO Knockout 敲除 LXR Liver X receptor 肝 X 受体 LXR β Liver X receptor β 肝 X 受体 β MBP Myelin basic protein 髓鞘碱性蛋白 NR Nuclear receptor 核受体 Olig2 Oligodendrocyte lineage transcription少突胶质细胞转录因子 2 factor 2 OPC Oligodendrocyte precursor cell 少突胶质前体细胞 OL Oligodendrocyte 少突胶质细胞 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 PDGFR α Platelet-derived growth factor receptor- α 血小板衍生生 长因子受体 α PFA Paraformaldehyde 多聚甲醛 RGC Radial glial cell 放射状胶质细胞 SVZ Subventricular zone 室下区 VZ Ventricular zone 室区 1第三军医大学硕士学位论文 WB Western blotting 蛋白免疫印迹 WT Wild type 野生型2第三军医大学硕士学位论文 The role of Liver X receptor beta in the differentiation of radial glial cells to oligodendrocytes in the dorsal cortex Abstract Oligodendrocytes OLs are the myelin-forming cells of central nervous system CNS, which can surround axon to form myelin and mediate the fast conduction of the neuronal information. Mature oligodendrocytes derived from oligodendrocyte precursor cells OPCs can further surround the nerve fibers to form myelin sheath. The earliest differentiated OPCs come from the ventral cortex of embryo would be gradually degraded and disappear after birth, while the OPCs produced from the dorsal cortex continue to be differentiated into OLs and involved in myelination after birth. However, the pathway of the generation of OPCs from the dorsal cortex is not clear by nowRadial glia cells RGCs,which derived from the neural epithelium and function as neural precursor cells to form new neurons in the cortex and migrational guides for radial later-born neurons, are critical for morphogenesis of the cerebral cortex. As the process of cortical development and neuronal migration slow down, RGCs, a bipolar cells with polar character gradually transformed into mature astrocytes and ependymal cells. Recently, it have been demonstrated that the long fiber of RGCs play important roles in initiating the myelination, and RGCs may be contribute to the production of the OPCs from dorsal cortexIn addition, the regulatory pathways of RGCs within the dorsal cortex involved in the differentiation into OPCs remains unclearLiver X receptors LXRs are ligand-activated nuclear receptors, including two subtypes of α and β, have demonstrated to be involved in the regulation of lipid metabolismAnalyzing the expression patterns of the two subtypes of receptor has shown that LXR α is mainly expressed in the tissues and cells where occurred high lipid metabolism such as liver, intestine, adipose tissue, and macrophages; while LXR β was widely expressed all over the body. In addition, LXR β expression in the cerebral cortex was developmentally regulated It has been demonstrated that LXR β play an important role in the formation of the cerebral cortex lamination by modulating the radial migration of later-born neurons during 3第三军医大学硕士学位论文 corticogenesis. It has been noted that loss of LXR β in mice induced the significant reduction of RGCs long fibers in the cerebral cortex during later embryonic stages, and further acceleration of RGCs transformation into astrocytes after birth. Similarly, LXR agonist treatment neonatal mice have inferred to promote the migration of granular neurons in the cerebellum by inhibition RGCs transformation into astrocytes during developmentConsistent with these findings, loss of LXR β induced astrogliosis appeared in the spinal cord and substantia nigra. On the other hand, previous studies have indicated that loss of LXRs resulted in serious dysfunction in the myelination. Moreover, LXR deficiency in mice exacerbated disease in the experimental autoimmune encephalomyelitis EAE model of multiple sclerosis. These studies seemed to indicate that as an important regulatory factor involved in the maintenance of RGCs, LXR β may determine the choice of differentiation from RGCs to astrocytes or OPCs, and thereby affect myelination in the adult CNSHowever, the underlyng mechanism is not clear by nowIn this study, the expression pattern of LXR β was detected in the corpus callosum and subventricular zone VZ of mice from P2 to P6W to infer the correlation between LXR β expression level and the development of white matter. The independent activity is measured in 6 weeks and 3 months old male WT and LXR β knockout LXR β knockout, LXR βKO mice by Open-field. The myelin structure of optic nerve and corpus callosum in 6 weeks and 3 months old male WT and LXR β knockout mice were observed by using electron microscopy. The differential expression of the mature OLs markers CC1 between 6-week-old male WT and LXR β knockout mice were detected by the use of immunohistochemical technique. The expression of MBP in the corpus callosum and cortex at P10, P14, P6W were analyzed in WT and LXR β knock mice with immunohistochemical technique combined with Western Blot. Simultaneously, the expression of PDGFR α and Olig2 in WT and LXR β KO mice at P2, P7, P10 and P14 had been compared by the use of immunohistochemistry and WB. The comparison of double-labeled cells using brain lipid binding protein BLBP as a marker for RGCs , and combined with PDGFR α or Olig2 were detected in the corpus callosum and cerebral cortex of WT and LXR β KO mice at P2 and P7 to clarify the regulation of RGCs differentiation into OPCs by LXR β. Moreover, studies have shown that alcohol exposure may lead to developmental disorders of CNS and abnormality of myelination due to activation of astrocytes and microglia. Here, TO901317 4第三军医大学硕士学位论文 as LXR agonist were pretreated to mice before suffering alcohol exposure to find the possible protective effect of endogenous LXR β activation in the myelination The main results were as follows: 1. LXR β was persistent expressed in the subventricular zone and the corpus callosum of mouse at P2, P7, P10, P14 and P6W2. Open-field showed: Compared to the age matched WT mice, the movement within 10 minutes of LXR βKO mice were significantly reduced at P6W P0.01; and the similar trend was confirmed in the mice aged 3MP0.053. Electron microscopy results have shown that at P6W, compared to the age matched WT mice, the myelin of LXR βKO mouse were significantly reduced, and the LXR βKO mouse had thinner myelination and more demyelination in optic nerve and corpus callosumAt 3M, the demyelination of LXR βKO mouse in optic nerve and corpus callosum were severer4. The expression of MBP in the dorsal cortex and corpus callosum of LXR β KO mouse at P6W was significantly reduced compare to their WT littermates. Similarly, the expression of CC1 was also reduced in the corpus callosum by loss of LXR βImmunohistochemistry combined with WB showed the expression of MBP was significantly reduced P 0.05 in LXR β KO mice compared to their WT littermates at both P10 and P145. The expressions of PDGFR α and Olig2 were significantly decreased in the corpus callosum of LXR β KO mouse compared to their age-matched WT littermates at P7, P10 and P14 by the detection of immunohistochemistry technique combined with WB. Meanwhile, there were more detective double labeled cells with Olig2 and PDGFR α in the corpus callosum of WT mice compared to that in the LXR β KO mice at P26. At P2, there were a large number of BLBP-labeled RGCs that coexpressed OPCs markers such as PDGFR α and Olig2 at the same time in the SVZ and corpus callosum of WT mice, while the double-labeled cells were reduced by loss of LXR β KO mice. Different from double-labeled cells detected at P2, there were few double stained cells in the SVZ and corpus callosum of WT and LXR β KO mice at P7 7. The expressions of GFAP and Tomato-lectin in the corpus callosum were significantly decreased P 0.01, while the expression of PDGFR α was significantly 5第三军医大学硕士学位论文 increased P 0.01, when mice were pretreated with TO901317 before suffering from alcohol exposureConclusions: These results suggest: activation of endogenous LXR β maybe involved in the CNS myelination. It supposed to be one of key nuclear transcription factors to determine the differentiation of RGCs in the periventricular zone and corpus callosum toward OPCs at early time after birth, and contribute to OLs maturation and myelination Key Words: Liver X receptor β, Radial glial cells RGCs, Oligodendrocyte precursor cells OPCs,OligodendrocytesOLs, corpus callosum,transcription factor 6第三军医大学硕士学位论文 肝 X 受体β促进大脑背侧皮质内放射状胶质细胞向少突 胶质细胞分化的作用研究 摘 要 少突胶质细胞Oligodendrocytes, OLs是中枢神经系统central nervous system,CNS 的髓鞘形成细胞,能够包绕轴突形成髓鞘介导神经元信息快速传导。成熟的少突胶质 细胞由少突胶质前体细胞Oligodendrocyte precursor cells,OPCs进一步分化成熟而来。 来源于胚胎腹侧昀早分化形成的 OPCs 在生后逐渐退化消失,背侧皮质产生的 OPCs 在生后仍持续产生 OLs 并参与髓鞘形成。然而背侧皮质 OPCs 的产生途径目前仍不明 确。 放射状胶质细胞Radialglial cells, RGCs源于胚胎发育早期的神经上皮,在大脑皮 层发育早期主要作为神经前体细胞产生神经元,皮层发育中晚期则提供放射状纤维引 导神经元的迁移并参与皮层的板层构筑。随着皮层发育和神经元迁移进程的减慢, RGCs 由具有极性特征的双极细胞逐渐转变为成熟的星形胶质细胞和室管膜细胞。近 年研究显示 RGCs 的长纤维结构对髓鞘的形成具有重要调节作用;并且 RGCs 可能是 背侧皮质 OPCs 产生的重要途径。目前关于大脑背侧皮质内 RGCs 向 OPCs 分化的调 控途径仍不明确。 肝 X 受体Liver X receptors, LXRs属于配体激活的核受体超家族成员,包括 α 与 β 两个亚型,是体内调节胆固醇代谢的重要核受体。对两型受体的表达模式分析表明: LXR α 主要表达在脂代谢旺盛的组织与细胞如肝脏、脂肪组织、小肠等;而 LXR β 则 在全身具有广泛性表达,并在 CNS 证实 LXR β 在大脑皮层的表达呈明显的发育学表达 调控模式。 在大脑皮层的发育过程中已经证实:LXR β 通过影响胚胎晚期皮层新生神经元的 放射状迁移而影响大脑皮质板层结构的形成,并且这一作用与 LXR β 参与 RGCs 长突 起形态的维持密切相关。在大脑皮质与小脑皮质中注意到:LXR β 缺失引起 RGCs 的 长纤维显著减少,并提前转化成为星形胶质细胞。既往研究显示:LXR αβ 双敲成年小 鼠存在严重的髓鞘形成障碍,并且 LXR αβ 双敲小鼠实验变态反应性脑脊 髓炎? 本课题受国家自然科学基金项目No. 31070927资助 7第三军医大学硕士学位论文 Experimental autoimmune encephalomyelitis , EAE模型导致的脱髓鞘病变较野生型 Wild Type,WTEAE 模型显著加重,提示 LXR β 作为调控 RGCs 维持与转化的重要 调控分子,可能影响 RGCs 向星形胶质细胞或 OPCs 的分化,并进而影响成年 CNS 的 髓鞘形成。 本课题首先采用免疫组织化学检测 LXR β 在胼胝体及室下区的发育学表达,明确 LXR β 与白质发育的相关性。采用旷场实验Open-field检测 6 周及 3 月龄雄性 WT 和 LXR β 敲除LXR β knockout,LXR βKO小鼠的自主活动能力;采用透射电镜技术观察 6 周及 3 月龄雄性 WT 和 LXR β 敲除小鼠视神经及胼胝体的髓鞘结构。运用免疫组织 化学技术检测 6 周龄雄性 WT 和 LXR β 敲除小鼠胼胝体处成熟 OLs 的标志物 CC1 的 表达差异,检测 P10、P14、P6W 髓鞘碱性蛋白Myelin basic protein,MBP 在 WT 和 LXR β 敲除小鼠胼胝体及皮层内的表达,结合蛋白免疫印迹Western blot,WB进行半 定量分析以明确 LXR β 与 OLs 成熟及髓鞘形成的相关性。同时采用免疫组化与 WB 比 较在 P2、P7、P10 及 P14 时 WT 和 LXR β 敲除小鼠背侧皮质及胼胝体内血小板衍生生 长因子受体 α Platelet-derived growth factor receptor- α, PDGFR α及少突胶质细胞转录 因子 2 Oligodendrocyte lineage transcription factor 2,Olig2的表达差异,以明确 LXR β 对皮质内 OPCs 产生及分化调节。采用 RGCs 的标志物脑脂质结合蛋白Brain lipid binding protein,BLBP与 PDGFR α 或 Olig2 进行免疫荧光双标, 比较 P2 与 P7 时 WT 和 LXR β 敲除小鼠背侧皮质及胼胝体内双标细胞的表达差异,以明确 LXR β 对 RGCs 产生 OPCs 的调节。研究显示,酒精暴露可能会引起脑内星形胶质细胞和小胶质细胞 的活化,导致 CNS 发育障碍,进而导致髓鞘形成异常。本课题采用 LXRs 激动剂 TO901317 在酒精暴露之前进行预处理,检测内源性 LXR β 活化后对髓鞘的保护作用。 主要结果如下: 1、LXR β 在 P2,P7,P10,P14,P6W 小鼠室下区及胼胝体中均有持续性的大量 表达。 2、旷场实验结果显示:与同龄 C57 WT 小鼠相比, 6 周龄的 LXR βKO 小鼠在 10 分钟内运动的总路程明显降低P0.01、中央区域活动的路程与时间无明显差异;3 月 龄的 LXR β 敲除小鼠在 10 分钟运动的总路程与 WT 小鼠比较亦明显降低P0.05。 3、电镜结果显示:与同龄 C57 WT 小鼠相比, 6 周龄的 LXR βKO 小鼠视神经与 胼胝体中的髓鞘明显减少,并且髓鞘较 WT 小鼠薄,有较多的脱髓鞘现象;在 3 月龄 的 LXR β 敲除小鼠视神经与胼胝体中脱髓鞘现象更为显著。 4、6 周龄 LXR β 敲除小鼠背侧皮质与胼胝体中 MBP 的表达较同龄野生小鼠相比8第三军医大学硕士学位论文 显著降低,胼胝体中 CC1 的表达也明显降低。免疫组化结合 WB 检测显示在 P10、P14 与 P6W时,LXR β 敲除小鼠皮质内 MBP 较 WT 小鼠明显减少P0.05。 5、P7,P10,P14 时,OPCs 的标志物 PDGFR- α 及影响促进 OPCs 形成并进一步 发育分化的重要转录因子 Olig2在 LXR β敲除小鼠胼胝体处的表达量显著低于同龄 WT 小鼠。同时,WB 证实,P7,P10,P14 时,PDGFR α,Olig2 蛋白在 LXR β 敲除小鼠 中的表达量明显低于同龄 WT 小鼠。 P2 时胼胝体处 Olig2 与 PDGFR α 双标细胞在野生 小鼠显著多于 LXR β 敲除小鼠。 6、P2 时 WT 野生小鼠室下区、胼胝体区可见大量 BLBP 标记的 RGCs 同时表达 OPCs 的标记物 PDGFR α 及 Olig2,LXR β 缺失导致双标细胞显著减少;而在 P7 野生 小鼠与 LXR β 敲除小鼠室下区及胼胝体区双标细胞数均显著减少。 7、制作酒精诱导的髓鞘损伤模型,加入 LXRs 激动剂进行保护后,星形胶质细胞 标志物 GFAP 和小胶质细胞标志物 Tomato-lectin 的表达量明显降低P0.01,而 OPCs 的标志物 PDGFR α 的表达量显著增加P0.01。结论:研究结果提示:内源性 LXR β 活化参与 CNS 的髓鞘形成,并且 LXR β 是生后早期 室周区与胼胝体区 RGCs 在小鼠生后早期向 OPCs 定向分化,及髓鞘形成阶段促进 OPCs 向 OLs 分化成熟的重要核转录因子。 关键词:肝 X 受体β,放射状胶质细胞,少突胶质前体细胞,少突胶质细胞,胼胝体,转录因子 9第三军医大学硕士学位论文 肝 X 受体β促进大脑背侧皮质内放射状胶质细胞向少 突胶质细胞分化的作用研究 第一章 前言 1.1 选题缘由 中枢神经系统central nervous system,CNS中,少突胶质细胞Oligodendrocytes, OLs是由少突胶质前体细胞Oligodendrocyte precursor cells, OPCs分化而来,并包绕轴 突形成绝缘的髓鞘结构。来源于胚胎腹侧昀早分化形成的 OPCs 在生后逐渐退化消失, 背侧皮质产生的 OPCs 在生后仍持续产生 OLs 并参与髓鞘形成。然而背侧皮质 OPCs 的产生途径目前仍不明确。 放射状胶质细胞Radialglial cells, RGCs在皮质发育早期主要作为神经前体细胞 产生神经元,皮层发育中晚期则提供放射状纤维引导神经元的迁移而参与皮层的板层 构筑。近年研究显示 RGCs 的长纤维结构对髓鞘的形成具有重要调节作用;并且 RGCs 可能是背侧皮质 OPCs 产生的重要途径。目前关于大脑背侧皮质内 RGCs 向 OPCs 分 化的调控途径仍不明确。 1.2 研究背景 髓鞘myelin sheath是包裹在神经细胞轴突外面的一层膜,由髓磷脂构成。髓鞘具 有绝缘作用,能提高神经冲动的传导速度,并且对轴突的完整性具有重要的支持作用 1,2。在周围神经系统中,髓鞘由施旺细胞包绕轴突形成,主要分布于脊髓白质和 坐骨神经;在中枢神经系统中,髓鞘则由少突胶质细胞包绕轴突形成,富集分布于大 脑白质和视神经3,4。在神经系统发育过程中,伴随着许多髓鞘组成物质如髓鞘碱 性蛋白Myelin basic protein,MBP、髓鞘少突胶质细胞醣蛋白Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG、髓鞘相关醣蛋白Myelin-associated glycoprotein,MAG 的合成, 大量的神经细胞质膜延伸并包绕轴突形成了多层脂双层结构的髓鞘5,6,7。胆固醇 是髓磷脂的重要组成部分,在周围神经系统中,胆固醇占髓鞘脂类物质的 20%-30%, 并且具有稳定和包装鞘膜等重要作用。在中枢神经系统中,胆固醇同样是组成髓鞘脂? 本课题受国家自然科学基金项目No. 31070927资助 10第三军医大学硕士学位论文 类的重要物质,脑中 70%以上的胆固醇都与髓鞘相关8,9。胆固醇代谢异常将导致 髓鞘形成异常甚至引起脱髓鞘病变。 肝 X 受体LXRs属于配体激活的核受体超家族成员,分为 α 和 β 两个亚型,是体 内调节胆固醇代谢的重要核受体10,11,12。LXR α 主要表达在脂代谢旺盛的肝脏、 脂肪组织等;而 LXR β 则在全身具有广泛性表达。对脑中两型受体的表达模式分析表 明: LXR β 的表达量明显高于 LXR α13。胆固醇在中枢神经系统通过原位合成并不 断更新,为了维持胆固醇的稳态,等量的胆固醇必须有效排出14。但是,脑中的胆 固醇无法降解,需转换为其极性代谢物 24S-羟基胆甾醇透过血脑屏障进入体循环, 而 24S-羟基胆甾醇正是 LXRs 的激动剂15。近年研究显示,由 LXRs 异常引起的胆 固醇平衡紊乱与阿尔茨海默AD,帕金森综合症PD,多发硬化综合症MS,亨廷顿 综合症HD等多种神经退行性疾病密切相关16,17,18,19。在 LXR αβ 双 敲小鼠中 证实:CNS 存在大量的脂质沉积并由此而引起神经元的退变20。在脊髓中,LXR β 缺失导致脂质沉积及脊髓前角运动神经元的丢失,并通过旋杆实验证实运动功能减退 21。在 8 月龄 LXR β 敲除小鼠中发现黑质网状部的小胶质细胞大量激活,多巴胺能 神经元大量丢失并且伴随着胆固醇水平的显著升高22。这些证据均表明 LXR β 是神 经系统中调节胆固醇稳态的关键因子。 胆固醇作为髓鞘组成的重要成分以及 LXR 对胆固醇稳态的关键作用,提示 LXR 参与髓鞘形成,然而其作用的途径与机制目前并不清楚。坐骨神经及施旺细胞中证实 存在多种 LXR 的天然配体及其合成酶,当 LXR 缺失后导致髓鞘变薄15,23。糖尿 病亦可引起周围神经系统中的髓鞘变薄并且出现脂质沉淀,采用 LXR 激动剂预处理则 能有效修复髓鞘并使其恢复至正常水平24。与此一致的是:LXR 激动剂预处理野生 小鼠能明显改善 EAE 模型中的脱髓鞘病变;LXR αβ 双敲小鼠 EAE 模型中的脱髓鞘现 象较 WT 小鼠明显加重25。以上研究结果提示:LXR 作为神经系统中胆固醇稳态调 节的重要核转录因子参与髓鞘形成。 中枢神经系统中,髓鞘的形成依赖于少突胶质前体细胞Oligodendrocyte precursor cells,OPCs的分化以及少突胶质细胞Oligodendrocytes,OLs的成熟26,OPCs 的起 源也一度成为研究的热点。OPCs 源自多个特定脑区,被认为是 CNS 室周区及室下区 有增殖能力的神经祖细胞分化而来,主要分为腹侧来源和背侧来源27,28。腹侧来 源的 OPCs 在小鼠 E16 时昀早出现于大脑皮质;背侧来源的 OPCs 在 E18 时才开始出 现。由于大部分早期产生的腹侧 OPCs 在小鼠出生后即消失,背侧来源的 OPCs 作为 参与髓鞘形成的主要前体细胞在生后持续存在29,30,31。在小鼠 P0 时,OPCs 主11第三军医大学硕士学位论文 要集中于 VZ 和 SVZ;P7 时,OPCs 分化为不成熟的 OLs,髓鞘形成开始启动;P10 时,不成熟的 OLs 进一步分化为成熟的 OLs,是髓鞘形成的关键期;P30 时,髓鞘形 成完成32。提示 LXR β 可能是通过影响 OPCs 的来源或 OPCs 向 OLs 的 分化而影响 CNS 中 OLs 的数量,进而影响髓鞘形成。图 小鼠生后中枢神经系统髓鞘形成过程引用于 Role of radial fibers in controlling the onset of myelination. Nakahara, J. et al. RGCs 是胞体位于 VZ 和 SVZ 的双极细胞,在皮层发育中晚期提供放射状纤维引 导神经元的迁移而参与皮层的板层构筑,在小鼠生后逐渐转化为星形胶质细胞和室管 膜细胞33,13。近年研究显示,RGCs 可能作为祖细胞产生 OPCs。采用 Lox-Cre 技 术特异性标记新生小鼠侧脑室的 RGCs 后,发现标记的 OLs 出现在胼胝体和其它脑白 质富集区域34。体外分离人胎儿大脑 VZ/SVZ 的 RGCs,经离体培养后,分化为能够 被 OPCs 特异性标志物 PDGFR α,NG2 标记的前体细胞,并昀终形成 MBP 阳性的 OLs35。同时,成年小鼠 CNS的 SVZ区和海马齿状回颗粒下区Subgranular zone, SGZ 的神经干细胞Neural stem cells, NSCs在形态结构上与 RGCs 极其相似,并且能在髓鞘 受损时可分化为 OPCs,对损伤髓鞘进行修复36。这些证据均表明了 RGCs 是中枢神 经系统中 OPCs 发育的关键,然而调节 RGCs 向 OPCs 甚至 OLs 分化的作用途径及机 制目前尚不清楚。 LXR β 作为调节脂代谢的核受体,在中枢神经系统发育中同样发挥着重要作用。12第三军医大学硕士学位论文 LXR β 有助于维持小鼠大脑皮质板层发育中 RGCs 的长纤维结构,抑制生后 RGCs 向 星形胶质细胞的转化13。采用人工合成激动剂 T091317 内源性激活小脑 LXRs,可促 进浦肯野细胞的树突生长,有助于维持小脑中伯格曼胶质细胞的长纤维结构及颗粒神 经元的迁移37。同时,利用 LXRs KO 小鼠已经证实 LXRs 在早期中脑发育过程中对 RGCs 和神经元的平衡具有重要调控作用22。既往研究显示,成年小鼠 LXRs 缺失后 将破坏髓鞘超微结构,导致髓鞘形成障碍21。并且 LXR αβ 双敲小鼠实验变态反应性 脑脊髓炎Experimental autoimmune encephalomyelitis , EAE模型导致的脱髓鞘病变较 野生型Wild Type,WTEAE 模型显著加重18。提示 LXR β 可能作为调控 RGCs 维持 与转化的关键“开关”分子,影响 RGCs 向 OPCs 分化。 1.3 研究意义 目前背侧皮质 OPCs 的产生途径仍不明确,同时作为 OPCs 可能来源的 RGCs 在 大脑背侧皮质向 OPCs 分化的调控途径仍不明确,这一科学问题是发育神经生物学领 域的重要前沿课题。我们前期研究提示:LXRβ 影响放射状胶质细胞RGCs的分化, 可能是决定背侧皮质内 RGCs 向 OPCs 分化的关键分子。从 RGCs 的分化途径着手, 阐明 LXRβ 影响背侧皮质内 OPCs 的产生、分化及成鞘的机制,可为理解脑白质发 育异常疾病的诊断与治疗提供新依据。同时,利用酒精诱导的髓鞘损伤模型,采用 LXR 激动剂提前保护,有助于为髓鞘损伤疾病新药物的筛选提供方向。 1.4 研究内容 1肝 X 受体β对成年小鼠 CNS 髓鞘形成的影响。 2LXRβ调控小鼠大脑中放射状胶质细胞向少突胶质细胞分化的机制研究。 3制作酒精诱导的髓鞘损伤模型,观察 TO901317 对酒精致新生小鼠髓鞘损伤的 保护作用。 1.5 研究方法 本实验拟采用旷场实验比较 6周龄与 3月龄成年 WT 和 LXR β 敲除小鼠 的自主活 动能力,采用电镜技术进一步观察 WT 和 LXR βKO 小鼠视神经与胼胝体中的髓鞘的超 微结构,明确 LXR β 缺失后对小鼠 CNS 髓鞘形成的影响。采用免疫组化与 WB 检测13第三军医大学硕士学位论文 P10,P14, P6W 野生与同龄 LXR β 敲除小鼠大脑皮质内髓鞘蛋白 MBP 的表达水平, 结合免疫组化检测 6 周龄野生与 LXR β 敲除小鼠胼胝体中 OLs 的标志物 CC1,探讨 LXR β 对大脑皮质及胼胝体中髓鞘蛋白与胞体在数量、形态分布的影响。通过免疫组 化及 Western blot 观察 OPCs 的标志物 PDGFR α,Olig2 在 WT 和 LXR β KO 小鼠大脑 背侧皮质中的表达情况,明确 LXR β 缺失后对小鼠 OPCs 的影响。通过免疫荧光双标 观察大脑背侧皮质 OPCs 与 RGCs 的关系,及 WT 和 LXR βKO 小鼠中的差异,阐明 LXR β 在生后大脑背侧皮质 RGCs 向 OPCs 分化中的作用。制作酒精诱导的髓鞘损伤 模型,采用 LXRs 激动剂 TO901317 在酒精暴露之前进行预处理,通过免疫组化检测 PDGFR α,GFAP,Tomato-lectin,探讨内源性 LXR β 活化后对髓鞘的保护 作用。 14第三军医大学硕士学位论文 第二章 肝 X 受体 β 对成年小鼠 CNS 髓鞘形成的影响 髓鞘myelin sheath是包裹在神经细胞轴突外面的一层膜,由髓磷脂构成。髓鞘具 有绝缘作用,能提高神经冲动的传导速度,并且对轴突的完整性具有重要的支持作用。 胆固醇是髓磷脂的重要组成部分,胆固醇代谢异常将导致髓鞘形成异常甚至引起脱髓 鞘病变。 肝 X 受体LXRs是体内调节胆固醇代谢的重要核受体,对脑中两型受体的表达模 式分析表明:LXR β 的表达量明显高于 LXR α13。胆固醇在脑中的通过转换为 24S- 羟基胆甾醇排出,而 24S-羟基胆甾醇正是 LXRs 的激动剂。 胆固醇作为髓鞘组成的重要成分以及 LXR 对胆固醇稳态的关键作用,提示 LXR 参与髓鞘形成,然而其作用的途径与机制目前并不清楚。我们推测 LXR 可能作为神经 系统中胆固醇稳态调节的重要核转录因子参与髓鞘形成。 2.1 材料和方法 2.1.1 材料 2.1.1.1 试剂和药品 多聚甲醛PFA 成都科龙试剂 无水乙醇 重庆市川东化工 氯化钠 成都科龙试剂 磷酸氢二钠 成都科龙试剂 磷酸二氢钠 成都科龙试剂 牛血清白蛋白BSA Roche 公司 Triton-X-100 Sigma 试剂公司 APES 北京中杉金桥 无水甲醇 重庆市川东化工 DPX 封片剂 Sigma 试剂公司 丙酮 重庆市川东化工 SABC试剂盒 Vector 公司 DAB 试剂盒 北京中杉金桥 组织基因组 DNA 提取试剂盒 北京天根公司 15第三军医大学硕士学位论文 枸橼酸缓冲液 北京中杉金桥 琼脂糖 Amerisco 公司 乙二醇 Sigma 试剂公司 蔗糖